Name: detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

Forfatterne takke Drs. Sueyoshi og Wang på National Institute of miljømæssige sundhed Sciences (NIEHS) for deres kritiske læsning af manuskript og Tanner Jefferson til at udføre procedurer på video. Dette arbejde blev støttet af den nationale institutter af sundhed Grant 1ZIAES070065 (til K.S.K.) fra NIEHS afdeling af murene forskning.

1. forberedelse af plasmider for pattedyr to-hybrid Assay
<ol><li>Brug de følgende plasmider: pG5-Luc, pBIND-ERαEF og pagten-ERαEF. Bemærk: Plasmider er ledige fra forfattere bestilles og sendes på filtrerpapir. pG5-Luc er reporter plasmid, der indeholder fem gentagelser af GAL4 lydhør elementer sammensmeltet med luciferase udtryk enhed (fig. 1A). pBIND-ERαEF er protein udtryk plasmid for GAL4DBD-smeltet ERα LBD proteiner. pBIND-ERαEF indeholder en Renilla luci...

<ol>
	<li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F+domain+of+estrogen+receptor+&#945;+is+involved+in+species-specific,+tamoxifen-mediated+transactivation.">The F domain of estrogen receptor &#945; is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li><li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor.">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li><li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+estrogen+receptor/coactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen.">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li><li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization.">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li><li>Montano, M. M., M&#252;ller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor:+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists.">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).</li><li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+&#945;+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions.">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor &#945; that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li><li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. , (2011).</li><li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+&#945;+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element.">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor &#945; Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li><li>Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists.">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).</li><li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries:+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta.">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li><li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+L543A,+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists,+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity.">Estrogen receptor &#945; L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li></ol>

Heri, beskrevet vi protokol for M2H analysen, fokusere på assay betingelser til påvisning af homodimerization aktivitet af ERα LBD som et eksempel. Generelt er er M2H-analysen ikke populær for vurdering af ligand-afhængige ERα LBD dimerization aktivitet. Dette skyldes ERα LBD besidder en transcriptional aktivering funktion; aktivitet som forstyrrer i nogle tilfælde resultaterne af M2H assay. Som vi viser her, kan M2H analysen bruges til at analysere LBD dimerization aktivitet af visse stoffer, der ikke aktiverer ...

Østrogen receptor alpha (ERα) er en østrogene ligand-afhængig transkription regulator. Aminosyre sequenceof ERα er meget bevaret blandt arter. På grund af den højere homologi mellem mennesker og mus ERα, funktionen af disse receptorer er opfattes som identiske, og differential aktiviteten af østrogene stoffer (fx, tamoxifen) i arter, der er forårsaget af artens forskelle i kemiske stofskifte og ikke af de strukturelle forskelle i ERα. ERα er meget bevaret domæne strukturer, der er udbredt blandt den nukleare receptor (NN) superfamilien, udpeget A til F domæner. E domæne eller ligand-bindende domæne (LBD) omfatter ligand-bindende lomme og transcriptional aktivering funktion 2, navngivet AF-2. Domænet F er lokaliseret umiddelbart støder op til E-domænet og er det mest variable domæne blandt NRs. Selv mellem mennesker og mus ERα, homologi af domænet F er væsentligt lavere end de andre domæner1. Ligand-bundet LBD ERα forbedrer homodimerization af ERα proteinet til at binde den særlige østrogen-responderende DNA element direkte til regulering af ligand-afhængige gen transskription (klassisk handling af ERα). Krystallografiske undersøgelser har afsløret den differentierede placering af helix 12 (AF-2 core domæne) med estradiol (E2)- eller 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) - bundet LBD dimerer2,3. Domænet ERα F (45 aminosyrer) Tilslut helix 12 direkte. Der er imidlertid ingen oplysninger om effekten af denne udvidelse af 45 aminosyrer (F domæne) fra helix 12 ERα LBD dimerization. I denne undersøgelse vise vi bidrag af domænet F til den artsspecifikke 4OHT-afhængige ERα LBD homodimerization ved hjælp af et pattedyr to-hybrid (M2H) assay.
M2H-analysen er en metode til at påvise protein-protein interaktioner i pattedyrceller at indføre de tre forskellige plasmid DNAs: to protein udtryk plasmider, som udtryk for GAL4 DNA-bindende domæne (Bel) fusion ERα LBD og VP16AD fusion ERα LBD, og en GAL4RE-smeltet luciferase udtryk reporter plasmid. Hvornår GAL4DBD fusion ERα LBD og VP16AD fusion ERα LBD interagere (gøre en dimer) i celler, denne proteinkompleks binder sig til GAL4RE og derefter aktiverer luciferase genekspression gennem funktionen VP16AD-afhængige transactivation. Niveau af LBD homodimerization kan vurderes af luciferase aktiviteten.
Gær to-hybrid (Y2H) assay er en alternativ metode baseret på samme princip, der bruger gær som værtsmiljøet. Tidligere rapporter ved hjælp af Y2H-systemet viste, at F-domæne-afkortet menneskelige ERα LBD øger E2-afhængige coactivator rekruttering, konkludere, at domænet F forhindrer E2-medieret transskription4. Dette resultat er i modstrid med andre rapporter, som har påvist den svækkede transcriptional aktivitet af F-domæne-afkortet menneskelige ERα i pattedyrceller5,6. For nylig, viste vores undersøgelse, ved hjælp af M2H systemet, at E2-afhængige coactivator rekruttering aktiviteten af menneskelige ERα LBD er faldet med F domæne trunkering i pattedyrsceller og er i overensstemmelse med transskription aktivitet1. Disse observationer tyder på, at den fysiologiske rolle af protein-protein interaktion adskiller sig i en celle type-specifikke måde og sammenhæng. M2H analysen kan påvise protein-protein interaktion aktivitet i den trådløse forbindelse, der bruges til at bestemme den transcriptional aktivitet. Dette giver en fordel af M2H analysen i forhold til Y2H eller andre in vitro- protein-protein interaktion analyser.
Der er stadig spørgsmål om de molekylære mekanismer for den delvise agonist aktivitet af selektiv østrogen receptor modulatorer (SERM) (f.eks., 4OHT) til at regulere ERα-medieret transskription. ERα LBD-baserede M2H assays kan anvendes til at studere mekanismen af delvis agonist aktivitet af SERM i forskellige pattedyr celletyper.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="891">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pG5-Luc</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E249A</td>
			<td style="width:360px;">Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pBIND</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E245A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pACT</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E246A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Rotor</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing Buckets</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Resuspension Solution (CRA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Lysis Solution (CLA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neutralization Solution (NSA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Column Wash Solution (CWB)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midipreps DNA Purification Resin</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midicolumns</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">51200038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BenchMark fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-119</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053028</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Passive Lysis 5X Buffer</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax L microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay

Østrogen receptor alpha (ERα) er en østrogene ligand-afhængig transkription regulator. Sekvensen af ERα protein er meget bevaret blandt arter. Det har været tænkt, at den funktion af menneskelige og mus ERαs er identiske. Vi demonstrere differential 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) virkning på musen og menneskelige ERα ligand-bindende domæne (LBD) dimerization aktivitet ved hjælp af pattedyr to-hybrid (M2H) analysen. M2H analysen kan demonstrere effektiviteten af LBD homodimerization aktivitet i pattedyrceller, udnytte Transfektion af to protein udtryk plasmider (GAL4 DNA-bindende domæne [Bel] fusion LBD og VP16 transactivation domæne [VP16AD] fusion LBD) og en GAL4-responderende element (GAL4RE) smeltet luciferase reporter plasmid. Når GAL4DBD fusion LBD og VP16AD fusion LBD laver en dimer i cellerne, dette protein kompleks binder sig til GAL4RE og derefter aktiverer en luciferase genekspression gennem VP16AD afhængige transskription aktivitet. En 4OHT-medieret luciferase aktivering er højere i de HepG2 celler, der blev transfekteret med mus ERα LBD fusion protein udtryk plasmider end i de menneskelige ERα LBD fusion protein udtryk plasmidet transfekteret celler. Dette resultat tyder på, at effekten af 4OHT-afhængige mus ERα LBD homodimerization aktivitet er højere end menneskelige ERα LBD. I almindelighed, er udnyttelse af M2H analyse ikke ideelt til evalueringen af nukleare receptor LBD dimerization aktivitet, fordi agonistisk ligander forbedre det basale niveau af LBD aktivitet og der hindrer paavisning af LBD dimerization aktivitet. Vi fandt, at 4OHT ikke øge ERα LBD basal aktivitet. Det er en afgørende faktor for at kunne bestemme og afsløre 4OHT-afhængige LBD dimerization aktivitet for succes ved hjælp M2H assay. ERα LBD-baserede M2H assays kan anvendes til at studere den delvise agonist aktivitet af selektiv østrogen receptor modulatorer (fx, 4OHT) i forskellige pattedyr celletyper.

Figur 3 viser ordningen af mulige løsninger i kombination (i) og kombination (ii) plasmid-transfekteret celler. De eksperimentelle resultater er vist i figur 4. Aktiviteten af kombination (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pagten) viser stimulation af 10 nM E2 (figur 4A), fordi ERα LBD indeholder ligand-afhængige transactivation funktionelle domæne, AF-2. Agonist (f.eks.E2),...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

Vi præsenterer en metode til analyse af 4-hydroxy-tamoxifen-afhængige østrogen receptor alpha ligand-bindende domæne dimerization aktivitet ved hjælp af de pattedyr to-hybrid assay.

Påvisning af Ligand-bindende domæne Dimerization aktivitet af østrogen Receptor Alpha ved hjælp af de pattedyr to-Hybrid Assay

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

Så denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål om evnen til østrogene ligands at regulere østrogen receptor alpha og mekanismerne i selektiv østrogen receptor modulatorer. Den største fordel ved denne teknik er, at det er en simpel metode. Det viser ligand-afhængige østrogen receptor alfa ligand bindende domæne dimerization aktivitet i cellerne.Demonstration af proceduren vil være Tanner Jefferson, en postdoc studerende fra vores gruppe. Denne metode bruger tre forskellige plasmider til at opdage østrogen receptor ligand bindende domæne dimerization aktivitet i celler. pG5-Luc er luciferase reporter plasmid til påvisning af effekten af dimerization aktivitet.pBIND mus østrogen receptor alpha EF er en galactose-lydhør transskription faktor GAL4 DNA bindende til en vigtigste smeltet mus østrogen alpha ligand bindende domæne udtryk plasmid, der binder sig til GAL4 lydhør element på pG5-Luc reporter. pACT mus østrogen receptor alpha EF er en herpes simplex virus transaktiverende segment protein VP16 aktivering domæne smeltet mus østrogen receptor alfa ligand bindende domæne udtryk plasmid, der ikke binder direkte til pG5-Luc reporter. Når den rette ligand er til stede, proteiner stammer fra pBIND mus østrogen receptor alfa EF og pACT mus østrogen receptor alfa EF plasmider binde gennem østrogen receptor alfa ligand bindende domæne.Dimeriseringens effektivitet bestemmes af luciferaseaktiviteten. Det vigtigste skridt er at kontrollere aktiviteten af pBIND mus østrogen receptor alfa EF afledt protein. Aktiviteten af pBIND-afledt østrogen receptor alfa ligand binde domæne i hver ligand uden pACT østrogen receptor alpha EF plasmid skal evalueres, før man analyserer ligand-afhængige østrogen receptor ligand bindende domæne dimerization aktivitet.Begynd med at tilsætte passende plasmidkombinationer i to 1,5 milliliter mikrocentrifugerør pr. kombination. Forbered de to kombinationer af DNA-blandingen. Første rør indeholder pG5-Luc, pBIND-østrogen receptor-alpha EF, og tomme pACT plasmider.Andet rør indeholder pG5-Luc, pBIND-østrogen receptor-alpha EF, og pACT-østrogen receptor-alpha EF plasmider. For at udfælde DNA'et tilsættes et 1/9 af DNA-blandingsvolumenet på tre molarnatriumacetat og et 20X tre molarnatriumacetatvolumen på 100%ethanol til DNA-blandingen i hvert rør og vortex rørene. Opbevar blandingerne ved 20 grader Celsius natten over, før centrifugering ved maksimal hastighed næste morgen.Kassér supernatanterne og opslæm de usynlige pellets i 120 mikroliter på 75% ethanol pr. rør, idet du skal passe på at skylle dna'et, der sidder fast på slangernes indvolde. Efter en anden centrifugering under de samme betingelser kasseres supernatanterne og DNA'et tørres i en vakuumkoncentrator i 30 minutter. Ved transinfektion vaskes de forberedte humane hepatocellulære karcinomceller to gange med 0,5 milliliter PBS pr. brønd pr. vask, og cellerne fodres med 0,5 milliliter frisk 37 grader Celsius phenol rødfri MEM suppleret med 10 % kul-strippet varmeinaktiveret kvægserum og to millimolar L-glutamin.Dernæst suspendere tørret plasmid DNA blanding og transfektion reagens i passende volumen af DMEM pr antal brønde i individuelle 1,5-milliliter mikrocentrifuge rør. Der tilsættes et tilsvarende volumen af transfektionsreagemediet til hvert DMEM-suspenderet plasmid DNA-blandingsrør. Efter en fem til 10-minutters inkubation ved stuetemperatur tilsættes 25 mikroliter af DNA-blanding til de relevante eksperimentelle brønde i den 24-årige humane hepatocellulære karcinomcellekulturplade til en seks timers transinfektion i cellekulturinkubatoren.Og slutningen af inkubationen, erstatte transfektion medium med 0,5 milliliter af friske 37 grader Celsius phenol rød-fri MEM suppleret med 10% trækul-strippet varme-inaktiveret FBS, to millimolar L-glutamin, 1% penicillin streptomycin, og ligand per brønd og returnere cellerne til cellekultur inkubator for en anden 16 til 18 timer. Den næste morgen, vaske cellerne med en milliliter PBS per brønd og fastgør cellerne fra hver brønd med 100 mikroliter passiv lysis buffer per brønd og kraftig omrystning med en vortex mixer. Derefter fryses cellen lysates i flydende nitrogen.På dagen for den dobbelte luciferase assay, ryst lysater på en shaker, indtil pladen når stuetemperatur, og overføre 10 mikroliter lysate til individuelle brønde af en 96-godt hvid plastplade. Læs derefter luciferase aktiviteten af hver celle lysate prøve på en mikroplade læser. Behandlingen af pBIND mus østrogen receptor alfa EF og pACT plasmider transfectede celler med 10 nanomolar estradiol stimulerer luciferase aktivitet som østrogen receptor alpha ligand bindende domæne indeholder ligand-afhængige transactivation funktionelle domæne, AF-2.En og 10-nanomolar koncentrationer dog fremkalde luciferase aktivitet i cellerne transfected med kombinationen af pBIND og pACT mus østrogen receptor alpha EF plasmider, hvilket tyder på gennemførligheden af denne procedure for evaluering af østrogen receptor alpha ligand bindende domæne dimerization aktivitet på op til en nanomolar af estradiol behandling. Behandling med 4-hydroxy-tamoxifen fremkalder ikke luciferase aktivitet i pBIND mus østrogen receptor alfa EF og pACT plasmid transfectede celler, tyder på, at AF-2 funktion østrogen receptor alpha ikke aktiveres af denne ligand. Op til 10 nanomolar koncentrationer dog inducerer luciferase aktivitet i cellerne transfected med kombinationen af pBIND og pACT mus østrogen receptor alpha EF plasmider, tyder på, at denne procedure er muligt for evaluering østrogen receptor alpha ligand bindende domæne dimerization aktivitet på op til 10 nanomolar af 4-hydroxy-tamoxifen behandling.Aktiviteten fra kombinationen af pBIND og pACT mus østrogen receptor alpha ligand bindende domæne udtryk plasmider med 4-hydroxy-tamoxifen er betydeligt højere end kombinationen af pBIND og pACT menneskelige østrogen receptor alfa ligand bindende domæne udtryk plasmider. Dette indikerer, at 4-hydroxy-tamoxifen-afhængige homodimerisering aktivitet af musen østrogen receptor alpha ligand bindende domæne er mere potent end den menneskelige østrogen receptor alfa ligand bindende domæne. Yderligere, den 4-hydroxy-tamoxifen-afhængige homodimerisering aktivitet af musen østrogen receptor alpha ligand bindende domæne, der indeholder en menneskelig F domæne er betydeligt lavere end den vilde type mus østrogen receptor alpha ligand bindende domæne.I modsætning hertil er den 4-hydroxy-tamoxifen-afhængige homodimerisering aktivitet af den menneskelige østrogen receptor alpha ligand bindende domæne, der indeholder en mus F domæne er betydeligt højere end den vilde type menneskelige østrogen receptor alpha ligand bindende domæne. Dette tyder på, at F domæne har en indflydelse på artsspecifikke 4-hydroxy-tamoxifen-afhængige østrogen receptor alpha ligand bindende domæne homodimerization aktivitet. Mens du forsøger denne procedure, Det er vigtigt at huske at teste den basale aktivitet GAL4 DNA bindende domæne smeltet østrogen receptor alpha ligand binde domæne aktivitet med din ligand.Denne aktivitet bør være den samme som behandling af køretøjer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

En General metode til påvisning af Nitrosamide dannelse i In Vitro metabolismen af nitrosaminer af cytokrom P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Evaluering af celle Invasion og migrationsprocessen: en sammenligning af den Video mikroskop-baseret skrabespil sår Assay og Boyden kammer Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Ved hjælp af Dot analyse til at analysere Migration af celle ark

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Ved hjælp af CRISPR/Cas9 gen redigering til at undersøge de muterede aktivitet af Mutant Calreticulin i cytokin afhængige hæmatopoietisk celler

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

En omfattende Procedure at evaluere In Vitro ydeevne af den formodede Hemangioblastoma Neovascularization ved hjælp af den sfæroide, spiring Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modeling osteosarkom ved hjælp af Li-Fraumeni syndrom Patient-afledte inducerede pluripotente stamceller-celler

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

Overflade-forstærket resonans Raman spredning Nanoprobe Ratiometry til påvisning af mikroskopiske æggestokkræft via folat Receptor målretning

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Fremstilling af Chimeric antigen receptor (bil) T-celler til adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In vitro etablering af en genetisk manipuleret murine hoved og hals Cancer cellelinje ved hjælp af en adeno-associeret virus-Cas9 system

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Kortlægning af strukturfunktionsforhold for uordnede onkogene transskriptionsfaktorer ved hjælp af transskriptomisk analyse

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...