Name: detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

De auteurs bedanken voor hun kritische lezing van het manuscript en Tanner Jefferson Drs. Sueyoshi en Wang op het National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) voor het uitvoeren van de procedures op de video. Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid Grant 1ZIAES070065 (naar KSK) vanuit de divisie van intramurale onderzoek naar de NIEHS.

1. voorbereiding van plasmiden, de zoogdieren twee-hybride Assay
<ol><li>Gebruik de volgende plasmiden: pG5-Luc, pBIND-ERαEF en pACT-ERαEF. Opmerking: De plasmiden zijn beschikbaar vanaf de auteurs op verzoek en worden verzonden op filterpapier. pG5-Luc is de verslaggever plasmide dat bevat vijf herhalingen van GAL4 responsieve elementen gefuseerd met de luciferase expressie eenheid(Figuur 1). pBIND-ERαEF is het eiwit expressie plasmide voor GAL4DBD-gesmolten ERα LB...

<ol>
	<li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F+domain+of+estrogen+receptor+&#945;+is+involved+in+species-specific,+tamoxifen-mediated+transactivation.">The F domain of estrogen receptor &#945; is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li><li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor.">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li><li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+estrogen+receptor/coactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen.">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li><li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization.">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li><li>Montano, M. M., M&#252;ller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor:+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists.">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).</li><li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+&#945;+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions.">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor &#945; that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li><li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. , (2011).</li><li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+&#945;+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element.">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor &#945; Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li><li>Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists.">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).</li><li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries:+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta.">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li><li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+L543A,+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists,+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity.">Estrogen receptor &#945; L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li></ol>

Hierin, beschreven we het protocol voor de M2H assay, zich te concentreren op de voorwaarden van de assay voor het opsporen van de activiteit van de homodimerization van ERα LBD als voorbeeld. In het algemeen, is de M2H-test niet populair voor de beoordeling van de ligand-afhankelijke ERα LBD dimerisatie activiteit. Dit is te wijten aan de ERα LBD bezitten een transcriptionele activering functie; waarvan de activiteit stoort, in sommige gevallen, de resultaten van de M2H-bepaling. Zoals we hier laten zien, kan de M2H ...

Oestrogeen receptor-alpha (ERα) is een oestrogene ligand-afhankelijke transcriptie regulator. Het aminozuur sequenceof ERα is zeer bewaard tussen de soorten. Vanwege de hogere homologie tussen mens en muis ERα, de functie van deze receptoren als identiek is gedacht en de differentiële activiteit van oestrogene stoffen (b.v., tamoxifen) in deze soorten wordt veroorzaakt door de soort verschillen in chemische stofwisseling in plaats van de structurele verschillen van ERα. ERα heeft zeer domeinstructuren die onder de superfamilie van nucleaire receptor (NR gelden), aangewezen van A tot F domeinen behouden. Het E-domein of de ligand-bindend domein (LBD) omvat de ligand-bindende zak en de transcriptionele activering functie 2, AF-2 genoemd. Het domein van F is gelokaliseerd onmiddellijk grenzend aan het domein van E en is het meest variabele domein onder de NRs. Zelfs tussen mens en mouse van ERα, de homologie van het domein van F is aanzienlijk lager dan die van de andere domeinen1. De ligand-gebonden LBD van ERα verbetert de homodimerization van de ERα eiwitten binden van het specifieke element voor het oestrogeen-responsief DNA rechtstreeks voor het reguleren van de ligand-afhankelijke gene transcriptie (klassieke actie van ERα). Kristallografische studies is gebleken de differentiële positionering van helix 12 (AF-2 core domein) met estradiol (E2)- of 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) - gebonden LBD Dimeren2,3. Het domein van de ERα F (45 aminozuren) helix 12 direct verbinden. Er is echter geen informatie over de gevolgen van deze uitbreiding van 45 aminozuren (F domein) uit de helix 12 over de dimerisatie ERα LBD. In deze studie tonen we de bijdrage van het F-domein naar de soortspecifieke 4OHT-afhankelijke ERα LBD homodimerization met behulp van een zoogdieren twee-hybride (M2H) test.
De assay M2H is een methode om aan te tonen van eiwit-eiwitinteractie in zoogdiercellen invoering van de drie verschillende plasmide Ani: twee eiwit expressie plasmiden, die GAL4 DNA-bindende domein (DBD) fusion ERα LBD en VP16AD fusion ERα LBD uitdrukken, en een GAL4RE-gesmolten luciferase expressie verslaggever plasmide. Wanneer de GAL4DBD fusion ERα LBD en de fusie van de VP16AD ERα LBD interactie (Maak een dimeer) in de cellen, dit complexe eiwit bindt aan de GAL4RE en, vervolgens, activeert luciferase genexpressie via de VP16AD-afhankelijke transactivation functie. Het niveau van LBD homodimerization kan worden geëvalueerd door de luciferase activiteit.
De bepaling van gist twee-hybride (Y2H) is een alternatieve methode gebaseerd op hetzelfde principe dat gist als de hostomgeving gebruikt. Eerdere rapporten met behulp van het Y2H-systeem aangetoond dat F-domein-afgekapt menselijke ERα LBD E2-afhankelijke coactivator werving verhoogt, sluiting van dat het domein van F E2-gemedieerde transcriptie4voorkomt. Dit resultaat is inconsistent met andere verslagen die hebben aangetoond de verzwakte transcriptionele activiteit van menselijke ERα in de cellen van zoogdieren5,6F-domein-afgekapt. Onlangs, onze studie, via het systeem M2H aangetoond dat de E2-afhankelijke coactivator recruitment activiteiten van menselijke ERα LBD is daalde met F domein truncatie in zoogdiercellen en met de transcriptie activiteit1 strookt. Deze opmerkingen suggereren dat de fysiologische rol van eiwit-eiwit interactie in een cel type-specifieke wijze en context verschilt. De assay M2H kan aantonen eiwit-eiwit interactie activiteit in dezelfde cellulaire context die wordt gebruikt voor het bepalen van de transcriptionele activiteit. Dit biedt een voordeel van de bepaling van de M2H in vergelijking met de Y2H of andere in vitro eiwit-eiwit interactie analyses.
Er blijven vragen over de moleculaire mechanismen van de activiteit van de partiële agonist van selectieve oestrogeen receptor modulatoren (SERMs) (bijvoorbeeld, 4OHT) voor het regelen van ERα-gemedieerde transcriptie. ERα LBD gebaseerde M2H tests kunnen worden toegepast om te bestuderen van het mechanisme van de gedeeltelijke agonist activiteit van SERMs in verschillende zoogdieren celtypes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="891">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pG5-Luc</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E249A</td>
			<td style="width:360px;">Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pBIND</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E245A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pACT</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E246A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Rotor</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing Buckets</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Resuspension Solution (CRA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Lysis Solution (CLA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neutralization Solution (NSA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Column Wash Solution (CWB)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midipreps DNA Purification Resin</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midicolumns</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">51200038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BenchMark fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-119</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053028</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Passive Lysis 5X Buffer</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax L microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay

Oestrogeen receptor-alpha (ERα) is een oestrogene ligand-afhankelijke transcriptie regulator. De volgorde van ERα eiwit wordt zeer behouden tussen de soorten. Het heeft gedacht dat de functie van de mens en de muis ERαs identiek is. We tonen het effect van de differentiële 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) op de muis en de menselijke ERα ligand-bindend domein (LBD) dimerisatie activiteit met behulp van de zoogdieren twee-hybride (M2H) bepaling. De assay M2H kan aantonen dat de efficiëntie van LBD homodimerization activiteit in zoogdiercellen, gebruik makend van de transfectie van twee eiwit expressie plasmiden (GAL4 DNA-bindende domein [DBD] fusie LBD en VP16 transactivation domein [VP16AD]-fusie LBD) en een GAL4-responsief element (GAL4RE) gesmolten luciferase verslaggever plasmide. Wanneer de GAL4DBD fusion LBD en de VP16AD-fusion LBD een dimeer in de cellen, dit complexe eiwit bindt aan de GAL4RE en vervolgens activeert een luciferase genexpressie via de VP16AD afhankelijk transcriptie activiteit. De 4OHT-gemedieerde luciferase activering is hoger in de HepG2 cellen die waren met de muis ERα LBD fusion eiwit expressie plasmiden dan in de menselijke ERα LBD fusion eiwit expressie plasmide transfected cellen transfected. Dit resultaat wijst erop dat de werkzaamheid van de 4OHT-afhankelijke muis ERα LBD homodimerization activiteit hoger dan menselijke ERα LBD. In het algemeen, is het gebruik van de M2H-test niet ideaal voor de evaluatie van nucleaire receptor LBD dimerisatie activiteit, omdat agonistic liganden het basale niveau van de activiteit LBD verbeteren en dat de detectie van LBD dimerisatie activiteit belemmert. We vonden dat 4OHT doet niet verhogen, ERα LBD basale activiteiten. Dat is een belangrijke factor om te kunnen bepalen en op te sporen van de 4OHT-afhankelijke LBD dimerisatie activiteit voor het met succes gebruik van de M2H-bepaling. ERα LBD gebaseerde M2H tests kunnen worden toegepast om te bestuderen van de activiteit van de partiële agonist van selectieve oestrogeen receptor modulatoren (bijvoorbeeld, 4OHT) in verschillende zoogdieren celtypes.

Figuur 3 toont de regeling van mogelijke reacties in de combinatie (i) en (ii) plasmide-transfected cellen van de combinatie. De experimentele resultaten worden weergegeven in Figuur 4. De activiteit van de combinatie (i) (pBIND-mERαEF, pG5-Luc + pACT) toont stimulatie door 10 nM E2 (Figuur 4A), omdat de ERα LBD de ligand-afhankelijke transactivation domein met het domeinfunctional...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

Presenteren we een methode voor het analyseren van de 4-hydroxy-tamoxifen-afhankelijke oestrogeen receptor Alfa ligand-bindend domein dimerisatie activiteit met behulp van de zoogdieren twee-hybride assay.

Opsporen van de Ligand-bindend domein dimerisatie activiteit van oestrogeen Receptor-Alpha met behulp van de zoogdieren twee-hybride Assay

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

Dus deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over het vermogen van oestrogene liganden te reguleren oestrogeen receptor alpha en de mechanismen van selectieve oestrogeen receptor modulatoren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige methode is. Het toont ligand-afhankelijke oestrogeen receptor alfa ligand binding domein dimerization activiteit in de cellen.Het aantonen van de procedure zal Tanner Jefferson zijn, een postdoc student van onze groep. Deze methode maakt gebruik van drie verschillende plasmiden om de oestrogeen receptor ligand binding domein dimerization activiteit in cellen te detecteren. pG5-Luc is de luciferase reporter plasmid voor het detecteren van de werkzaamheid van dimerisatie activiteit.pBIND muis oestrogeen receptor alpha EF is een galactose-responsieve transcriptie factor GAL4 DNA binding aan een hoofd gesmolten muis oestrogeen alpha ligand binding domein expressie plasmid dat bindt aan de GAL4 responsieve element op de pG5-Luc verslaggever. pACT muis oestrogeen receptor alpha EF is een herpes simplex virus transactivating segment eiwit VP16 activatie domein gesmolten muis oestrogeen receptor alfa ligand bindende domein expressie plasmid die niet rechtstreeks binden aan de pG5-Luc reporter. Wanneer de juiste ligand aanwezig is, de eiwitten afgeleid van de pBIND muis oestrogeen receptor alpha EF en pACT muis oestrogeen receptor alpha EF plasmiden binden via de oestrogeenreceptor alfa ligand binding domein.De efficiëntie van de dimerisatie wordt bepaald door de luciferase activiteit. De belangrijkste stap is het beheersen van de activiteit van de pBIND muis oestrogeen receptor alpha EF afgeleid eiwit. De activiteit van pBIND-afgeleide oestrogeen receptor alfa ligand bind domein in elke ligand zonder de pACT oestrogeen receptor alpha EF plasmide moet worden geëvalueerd alvorens de ligand-afhankelijke oestrogeen receptor ligand bindende domein dimerization activiteit.Begin met het toevoegen van de juiste plasmide combinaties in twee 1,5-milliliter microcentrifugebuizen per combinatie. Bereid de twee combinaties van het DNA-mengsel. Eerste buis bevat de pG5-Luc, pBIND-oestrogeen receptor-alpha EF, en lege pACT plasmiden.Tweede buis bevat de pG5-Luc, pBIND-oestrogeen receptor-alpha EF, en pACT-oestrogeen receptor-alpha EF plasmiden. Om het DNA neer te halen, voeg een 1/9 van het VOLUME van het DNA-mengsel van drie molaire natriumacetaat en een 20x drie molair natriumacetaatvolume van 100% ethanol toe aan het DNA-mengsel in elke buis en vortex de buizen. Bewaar de mengsels op 20 graden Celsius 's nachts voor centrifugeren op maximale snelheid de volgende ochtend.Gooi de supernatants weg en spoel de onzichtbare pellets opnieuw op in 120 microliters van 75% ethanol per buis, waarbij u ervoor zorgt dat dna dat aan de binnenkant van de buizen vastzit, wordt afgespoeld. Na een tweede centrifugatie onder dezelfde omstandigheden, gooi de supernatants en droog het DNA in een vacuüm concentrator gedurende 30 minuten. Voor de transfectie, was de bereide menselijke hepatocellulaire carcinoomcellen twee keer met 0,5 milliliter kamertemperatuur PBS per goed wassen en voer de cellen met 0,5 milliliter verse 37 graden Celsius fenol rood-vrije MEM aangevuld met 10%houtskool gestripte warmte-geïnactiveerd foetaald runderserum en twee millimolar L-amine glut.Vervolgens, schort gedroogde plasmide DNA-mengsel en transfectie reagens in de juiste hoeveelheid DMEM per aantal putten in individuele 1,5-milliliter microcentrifuge buizen. Voeg een gelijk volume van transfectie reagens medium aan elke DMEM-zwevende plasmid DNA mengsel buis. Voeg na een incubatie van vijf tot tien minuten bij kamertemperatuur 25 microliters dna-mengsel toe aan de juiste experimentele putten van de 24-put menselijke hepatocellulaire carcinoomcelkweekplaat voor een zes uur durende transfectie in de celkweek incubator.En het einde van de incubatie, vervang de transfectie medium met 0,5 milliliter verse 37 graden Celsius fenol rood-vrije MEM aangevuld met 10%houtskool-gestripte warmte-geïnactiveerde FBS, twee millimolar L-glutamine, 1%penicilline streptomycine, en ligand per goed en de cellen terug te keren naar de celcultuur incubator voor nog eens 16 tot 18 uur. De volgende ochtend, was de cellen met een milliliter PBS per put en bevestig de cellen van elke put met 100 microliters van passieve lyse buffer per goed en krachtig schudden met een vortex mixer. Bevries vervolgens de cellysates in vloeibare stikstof.Schud op de dag van de dubbele luciferase-test de lysates op een shaker tot de plaat op kamertemperatuur is en breng 10 microliter lysaat over naar individuele putten van een 96-put witte plastic plaat. Lees vervolgens de luciferase-activiteit van elk cellysaatmonster op een microplatelezer. De behandeling van pBIND muis oestrogeen receptor alpha EF en pACT plasmiden transfected cellen met 10 nanomolar estradiol stimuleert luciferase activiteit als de oestrogeen receptor alfa ligand binding domein bevat de ligand-afhankelijke transactivatie functioneel domein, AF-2.Een en 10-nanomolar concentraties echter, induceren luciferase activiteit in de cellen doorgeschoerd met de combinatie van pBIND en pACT muis oestrogeen receptor alpha EF plasmiden, wat wijst op de haalbaarheid van deze procedure voor de evaluatie van oestrogeen receptor alfa ligand bindende domein dimerization activiteit tot een nanomolar van estradiol behandeling. Behandeling met 4-hydroxy-tamoxifen niet uitlokken luciferase activiteit in de pBIND muis oestrogeen receptor alpha EF en pACT plasmid getransfecteerde cellen, wat suggereert dat de AF-2 functie van oestrogeen receptor alpha niet wordt geactiveerd door deze ligand. Tot 10 nanomolar concentraties echter, induceert luciferase activiteit in de cellen doorgeschat met de combinatie van pBIND en pACT muis oestrogeen receptor alpha EF plasmiden, wat suggereert dat deze procedure haalbaar is voor de evaluatie van oestrogeen receptor alfa ligand binding domein dimerization activiteit op maximaal 10 nanomolar van 4-hydroxy-tamoxifen behandeling.De activiteit van de combinatie van pBIND en pACT muis oestrogeen receptor alpha ligand binding domein expressie plasmiden met 4-hydroxy-tamoxifen is aanzienlijk hoger dan de combinatie van pBIND en pACT menselijke oestrogeen receptor alfa ligand bindende domein expressie plasmiden. Dit geeft aan dat de 4-hydroxy-tamoxifen-afhankelijke homodimerisatie activiteit van de muis oestrogeen receptor alfa ligand binding domein is krachtiger dan de menselijke oestrogeen receptor alfa ligand bindend domein. Verder, de 4-hydroxy-tamoxifen-afhankelijke homodimerisatie activiteit van de muis oestrogeen receptor alfa ligand binding domein met een menselijk F-domein is aanzienlijk lager dan die van het wilde type muis oestrogeen receptor alpha ligand bindend domein.In tegenstelling, de 4-hydroxy-tamoxifen-afhankelijke homodimerisatie activiteit van de menselijke oestrogeen receptor alfa ligand binding domein met een muis F domein is aanzienlijk hoger dan die van het wilde type menselijke oestrogeen receptor alfa ligand bindend domein. Dit suggereert dat de F-domein heeft een invloed op de soort-specifieke 4-hydroxy-tamoxifen-afhankelijke oestrogeen receptor alfa ligand bindende domein homodimerisatie activiteit. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de basale activiteit van GAL4 DNA bindende domein gesmolten oestrogeen receptor alfa ligand bind domeinactiviteit met uw ligand te testen.Deze activiteit moet hetzelfde zijn als de behandeling van het voertuig.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

Een algemene methode voor het opsporen van Nitrosamide-formatie in het metabolisme In Vitro van nitrosaminen door cytochroom P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Evaluatie van de invasie van de cel en het migratieproces: een vergelijking van de Video Microscoop gebaseerde kras wond Assay en de bepaling van Boyden kamer

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Met behulp van de Dot-Assay voor het analyseren van de migratie van cel bladen

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Met behulp van CRISPR/Cas9 Gene bewerken om te onderzoeken de oncogene activiteit van Mutant Calreticulin in Cytokine afhankelijke hematopoietische cellen

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Een uitgebreide Procedure voor de evaluatie van de prestaties In Vitro van de vermeende Hemangioblastoma Neovascularization met behulp van de kiemen Assay sferoïde

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modelleren van osteosarcoom met behulp van Li-Fraumeni syndroom geïnduceerde pluripotente stamcellen patiënt-afgeleide cellen

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

Oppervlakte-enhanced resonantie Raman verstrooiing nanosonde Ratiometry voor het opsporen van microscopische eierstokkanker via folaat Receptor gericht op

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Productie van Chimerische antigeen receptor (auto) T cellen voor adoptie immunotherapie

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In vitro oprichting van een genetisch gemanipuleerde Muriene hoofd en nekkanker cellijn met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Het in kaart brengen van de structuur-functierelaties van ongeordende oncogene transcriptiefactoren met behulp van transcriptomische analyse

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...