Name: detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

Les auteurs remercient les Drs Sueyoshi et Wang à l’Institut National de Environmental Health Sciences (NIEHS) pour leur lecture critique du manuscrit et Jefferson Tanner pour effectuer des interventions sur la vidéo. Ce travail a été soutenu par le 1ZIAES070065 d’instituts nationaux de santé Grant (au KSK) de la Division de la recherche intra-muros du NIEHS.

1. préparation des plasmides pour le dosage de deux-hybride chez les mammifères
<ol><li>Utilisez les plasmides suivants : pG5-Luc pBIND-ERαEF et pacte-ERαEF. Remarque : Les plasmides sont disponibles auprès des auteurs sur demande et sont envoyés sur papier filtre. pG5-Luc est le plasmide de journaliste qui contient cinq répétitions de GAL4 responsive éléments fusionnés avec l’unité d’expression luciférase (Figure 1A). pBIND-ERαEF est le plasmide d?...

<ol>
	<li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F+domain+of+estrogen+receptor+&#945;+is+involved+in+species-specific,+tamoxifen-mediated+transactivation.">The F domain of estrogen receptor &#945; is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li><li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor.">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li><li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+estrogen+receptor/coactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen.">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li><li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization.">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li><li>Montano, M. M., M&#252;ller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor:+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists.">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).</li><li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+&#945;+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions.">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor &#945; that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li><li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. , (2011).</li><li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+&#945;+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element.">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor &#945; Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li><li>Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists.">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).</li><li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries:+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta.">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li><li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+L543A,+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists,+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity.">Estrogen receptor &#945; L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li></ol>

Dans les présentes, nous décrit le protocole de l’essai M2H, mettant l’accent sur les conditions de test pour la détection de l’activité de l’homodimérisation de ERα LBD à titre d’exemple. En règle générale, l’essai de M2H n’est pas populaire pour l’évaluation de l’activité de dimérisation ERα LBD ligand-dépendants. Cela est dû à la ERα LBD possédant une fonction d’activation de la transcription ; dont l’activité perturbe, dans certains cas, les résultats du dosage M2H. Toutefo...

Œstrogènes alpha du récepteur (ERα) est un régulateur oestrogéniques ligand-dépendants de transcription. L’acides aminés sequenceof ERα est hautement conservée entre les espèces. En raison de l’homologie supérieur entre l’homme et souris ERα, la fonction de ces récepteurs est considérée comme identique, et l’activité différentielle des substances oestrogéniques (par exemple, le tamoxifène) chez ces espèces est causée par des différences dans l’espèce métabolismes chimiques plutôt que par des différences structurelles de ERα. ERα a hautement conservée les structures de domaine qui sont fréquents chez la superfamille des récepteurs nucléaires (NR), désignée A pour domaines de F. E domaine ou domaine de liaison du ligand (LBD) comprend la poche de liaison du ligand et la fonction d’activation transcriptionnelle 2, nommée AF-2. Le domaine de F est localisé juste à côté du domaine E et le domaine plus variable chez le NRs. Même entre l’homme et la souris ERα, l’homologie du domaine F est sensiblement inférieur à celui des autres domaines1. Le LBD ligand lié de ERα améliore l’homodimérisation de la protéine ERα pour lier l’élément spécifique de l’ADN sensibles aux oestrogènes directement pour la régulation de la transcription du gène de ligand-dépendants (action classique de ERα). Des études cristallographiques ont révélé le positionnement différentiel d’hélice 12 (noyau de la AF-2) avec l’estradiol (E2) - ou 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) - lié LBD dimères2,3. Le domaine ERα F (45 acides aminés) Connectez hélice 12 directement. Cependant, il n’y a aucune information concernant l’effet de cette extension de 45 acides aminés (domaine de F) de l’hélice 12 sur la dimérisation ERα LBD. Dans cette étude, nous démontrons la contribution du domaine F l’homodimérisation de ERα LBD 4OHT-dépendante spécifique à l’espèce à un mammifère-hybride (M2H) dosage.
L’essai de M2H est une méthode pour montrer les interactions protéine-protéine dans les cellules de mammifères présentant les trois différents plasmide DNAs : deux plasmides d’expression protéique, qui exprime la fusion de GAL4 DNA-binding domain (DBD) la fusion ERα LBD LBD ERα et VP16AD, et un Plasmide de journaliste d’expression luciférase fusionnés avec le GAL4RE. Lorsque la fusion GAL4DBD ERα LBD et la fusion de VP16AD ERα LBD interagissent (faire un dimère) dans les cellules, ce complexe protéique se lie à la GAL4RE et, ensuite, active l’expression de gène de luciférase grâce à la fonction de transactivation VP16AD-dépendante. Le niveau de LBD homodimérisation peut être évalué par l’activité de la luciférase.
L’essai de (Y2H) de deux-hybride de levure est une méthode alternative basée sur le même principe qui utilise la levure comme l’environnement hôte. Les rapports précédents, en utilisant le système Y2H démontré que F-domaine-tronqué humains ERα LBD augmente recrutement de coactivateur E2-dépendante, concluant que le domaine F empêche la transcription induite par l’E24. Ce résultat est incompatible avec d’autres rapports qui ont démontré l’activité transcriptionnelle atténuée de F-domaine-tronqué humain ERα dans les cellules de mammifères5,6. Récemment, notre étude, en utilisant le système M2H, a démontré que l’activité de recrutement de coactivateur E2-dépendante des humains ERα LBD est diminuée par troncature domaine F en cellules mammifères et est compatible avec l’activité de transcription1. Ces observations suggèrent que le rôle physiologique de l’interaction protéine-protéine est différente dans un contexte et de manière spécifique au type de cellule. Le dosage M2H peut démontrer l’activité interaction protéine-protéine dans le même contexte cellulaire qui est utilisé pour la détermination de l’activité transcriptionnelle. Cela procure un avantage du dosage M2H comparé à la Y2H ou autres analyses d’interaction de protéine-protéine in vitro .
Il reste des questions concernant les mécanismes moléculaires de l’activité agoniste partielle des modulateurs des récepteurs œstrogènes (SERMs) (p. ex., 4OHT) à réglementer ERα-mediated transcription. LBD ERα M2H analyses peuvent être appliquées pour étudier le mécanisme de l’activité agoniste partielle des SERMs dans divers types de cellules de mammifères.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="891">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pG5-Luc</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E249A</td>
			<td style="width:360px;">Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pBIND</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E245A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pACT</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E246A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Rotor</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing Buckets</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Resuspension Solution (CRA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Lysis Solution (CLA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neutralization Solution (NSA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Column Wash Solution (CWB)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midipreps DNA Purification Resin</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midicolumns</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">51200038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BenchMark fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-119</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053028</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Passive Lysis 5X Buffer</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax L microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay

Œstrogènes alpha du récepteur (ERα) est un régulateur oestrogéniques ligand-dépendants de transcription. La séquence de la protéine ERα est hautement conservée entre les espèces. On a pensé que la fonction de l’homme et la souris ERαs est identique. Nous démontrons l’effet différentiel 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) souris et ERα ligands domaine (LBD) dimérisation activités humaines utilisant le mammifère-hybride (M2H) test. Le dosage M2H peut démontrer l’efficacité de l’activité de homodimérisation LBD dans les cellules de mammifères, utilisant la transfection des plasmides d’expression de deux protéines (GAL4 DNA-binding domain [DBD] fusion LBD et VP16 transactivation domaine [VP16AD] fusion LBD) et un GAL4-responsive element (GAL4RE) fondue plasmide rapporteur luciférase. Lors de la fusion de GAL4DBD LBD et la fusion de VP16AD LBD font un dimère dans les cellules, ce complexe protéique se lie à la GAL4RE et, ensuite, active l’expression des gènes par le biais de l’activité de transcription dépendant de VP16AD une luciférase. L’activation de la luciférase induite par le 4OHT est plus élevée dans les cellules HepG2 qui ont été transfectées avec les plasmides souris ERα LBD fusion protein expression que dans les ERα LBD fusion protein expression plasmide transfecté des cellules humaines. Ce résultat suggère que l’efficacité de la souris 4OHT-dépendante de l’activité homodimérisation ERα LBD est plus élevée que l’humain ERα LBD. En général, l’utilisation du dosage M2H n’est pas idéale pour l’évaluation de l’activité de dimérisation du récepteur nucléaire LBD, car des ligands agonistes améliorent le niveau de base de l’activité LBD et gêner la détection de l’activité de dimérisation LBD. Nous avons trouvé que 4OHT n’améliore pas l’activité basale ERα LBD. C’est un facteur clé pour être capable de déterminer et de détecter l’activité de dimérisation de LBD 4OHT-dépendant pour l’utilisation avec succès le test M2H. LBD ERα M2H analyses peuvent être appliquées pour étudier l’activité agoniste partielle des modulateurs des récepteurs œstrogènes (p. ex., 4OHT) dans divers types de cellules de mammifères.

La figure 3 affiche le régime des sanctions possibles dans la combinaison (i) et les cellules (ii) plasmide transfectées combinaison. Les résultats expérimentaux sont indiquées à la Figure 4. L’activité de l’Association (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + Pacte) montre la stimulation de 10 nM E2 (Figure 4A), car la LBD ERα contient le domaine fonctionnel de transactivation de ...

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Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

Nous présentons une méthode pour analyser la 4-hydroxy-tamoxifène-dépendants oestrogène receptor ligands domaine dimérisation activité alpha utilisant l’analyse de deux-hybride chez les mammifères.

Détection de l’activité de dimérisation du domaine ligands de œstrogènes Alpha du récepteur à l’aide de l’essai de deux-hybride chez les mammifères

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

Ainsi, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la capacité des ligands oestrogènes à réguler alpha récepteur d’oestrogène et les mécanismes des modulateurs sélectifs récepteur d’oestrogène. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode simple. Il démontre ligand-dépendant récepteur d’oestrogène alpha ligand liaison activité de dimérisation du domaine dans les cellules.Tanner Jefferson, un étudiant postdoc de notre groupe, démontrera la procédure. Cette méthode utilise trois plasmides différents pour détecter l’activité de dimérisation de domaine de liaison de récepteur d’oestrogène dans les cellules. pG5-Luc est le plasmide journaliste luciferase pour détecter l’efficacité de l’activité de dimémissement.pBIND récepteur d’oestrogène de souris alpha EF est un facteur de transcription galactose-sensible GAL4 ADN se liant à une souris fusionnée principale oestrogène alpha ligand expression de domaine plasmide qui se lie à l’élément sensible GAL4 sur le journaliste pG5-Luc. pACT souris récepteur d’oestrogène alpha EF est un virus de l’herpès simplex transactivant la protéine segment VP16 domaine d’activation fusionné récepteur d’oestrogène de souris alpha ligand liaison expression de domaine plasmide qui ne se lie pas directement au journaliste pG5-Luc. Quand le ligand approprié est présent, les protéines dérivées du récepteur d’oestrogène de souris de pBIND alpha EF et plasmides alpha EF de récepteur d’oestrogène de souris de pACT se lient par le domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène.L’efficacité de la dimémisation est déterminée par l’activité de luciferase. L’étape la plus importante est le contrôle de l’activité du récepteur d’oestrogène de souris pBIND alpha EF protéine dérivée. L’activité du récepteur d’oestrogène dérivé de pBIND alpha ligand lient le domaine dans chaque ligand sans le plasmide alpha EF de récepteur d’oestrogène de pACT doit être évaluée avant d’analyser l’activité ligand-dépendante de liaison de domaine de récepteur d’oestrogène ligand.Commencez par ajouter les combinaisons de plasmides appropriées en deux tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre par combinaison. Préparer les deux combinaisons du mélange d’ADN. Le premier tube contient le pG5-Luc, le récepteur-alpha EF de pBIND-oestrogène, et les plasmides vides de pACT.Deuxième tube contient le pG5-Luc, pBIND-oestrogène récepteur-alpha EF, et pACT-oestrogène récepteur-alpha EF plasmides. Pour précipiter l’ADN, ajouter un 1/9 du volume du mélange d’ADN de trois acétate de sodium molaire et un volume d’acétate de sodium 20X trois molaire de 100% éthanol au mélange d’ADN dans chaque tube et vortex les tubes. Conserver les mélanges à 20 degrés Celsius pendant la nuit avant de les centrifuger à vitesse maximale le lendemain matin.Jetez les supernatants et réutilisez les granulés invisibles dans 120 microlitres de 75% d’éthanol par tube, en prenant soin de rincer tout ADN collé à l’intérieur des tubes. Après une deuxième centrifugation dans les mêmes conditions, jeter les supernatants et sécher l’ADN dans un concentrateur sous vide pendant 30 minutes. Pour la transfection, lavez les cellules de carcinome hépatocellulaires humaines préparées deux fois avec 0,5 millilitres de PBS à température ambiante par puits par lavage et nourrissez les cellules avec 0,5 millilitres de phénol frais de 37 degrés Celsius sans phénol complété par 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par charbon de bois et deux millimolaires de L-glutamine.Ensuite, suspendre le mélange d’ADN plasmide séché et le réaccente de transfection dans le volume approprié de DMEM par nombre de puits dans des tubes individuels de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Ajouter un volume égal de milieu de réaccente de transfection à chaque tube de mélange d’ADN plasmide suspendu au DMEM. Après une incubation de cinq à dix minutes à température ambiante, ajouter 25 microlitres de mélange d’ADN aux puits expérimentaux appropriés de la plaque de culture de cellules hépatocellulaires humaines de 24 puits pour une transfection de six heures dans l’incubateur de culture cellulaire.Et la fin de l’incubation, remplacer le milieu de transfection par 0,5 millilitres de frais 37 degrés Celsius phénol sans rouge MEM complété par 10% de charbon de bois dépouillé fbs inactivé par la chaleur, deux millimolaire L-glutamine, 1% streptomycine pénicilline, et ligand par puits et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pour un autre 16 à 18 heures. Le lendemain matin, lavez les cellules avec un millilitre de PBS par puits et fixez les cellules de chaque puits avec 100 microlitres de tampon de lyse passive par puits et secouant vigoureusement à l’aide d’un mélangeur vortex. Congelez ensuite les lysates cellulaires dans de l’azote liquide.Le jour du double test de luciferase, secouez les lysates sur un shaker jusqu’à ce que la plaque atteigne la température ambiante, et transférez 10 microlitres de lysate aux puits individuels d’une plaque en plastique blanc de 96 puits. Lisez ensuite l’activité de luciferase de chaque échantillon de lysate de cellule sur un lecteur de microplaque. Le traitement du récepteur d’oestrogène de souris de pBIND alpha EF et des plasmides de pACT a transfecté des cellules avec l’estradiol nanomolar de nanomolar stimule l’activité de luciferase pendant que le domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène contient le domaine fonctionnel ligand-dépendant de transactivation, AF-2.Les concentrations d’un et de 10 nanomolaires cependant, induisent l’activité de luciferase dans les cellules transfectées avec la combinaison des plasmides alpha EF de récepteur d’oestrogène de souris de pBIND et de pACT, suggérant la faisabilité de cette procédure pour évaluer l’activité de dimérisation de domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène à jusqu’à un nanomolar du traitement d’estradiol. Le traitement avec 4-hydroxy-tamoxifen n’obtient pas l’activité de luciferase dans le récepteur d’oestrogène de souris de pBIND alpha EF et les cellules transfectées plasmides de pACT, suggérant que la fonction AF-2 du récepteur d’oestrogène alpha n’est pas activée par ce ligand. Jusqu’à 10 concentrations nanomolaires cependant, induit l’activité de luciferase dans les cellules transfectées avec la combinaison des plasmides alpha EF de récepteur d’oestrogène de souris de pBIND et de pACT, suggérant que cette procédure soit faisable pour évaluer l’activité de dimérisation de domaine de liaison d’alpha ligand de récepteur d’oestrogène à jusqu’à 10 nanomolar du traitement de 4-hydroxy-tamoxifen.L’activité de la combinaison du pBIND et du récepteur d’oestrogène de souris de pACT alpha ligand liant des plasmides d’expression de domaine avec 4-hydroxy-tamoxifen est sensiblement plus élevée que la combinaison des plasmides d’expression de domaine de liaison d’oestrogène humain pBIND et de pACT. Ceci indique que l’activité d’homodimerization 4-hydroxy-tamoxifen-dépendante du domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène de souris est plus puissante que le domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène humain. En outre, l’activité d’homodimerization 4-hydroxy-tamoxifen-dépendante du domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène de souris contenant un domaine humain de F est sensiblement inférieure à celle du domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène de type sauvage de souris.En revanche, l’activité d’homodimerization 4-hydroxy-tamoxifen-dépendante du domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène humain contenant un domaine de souris F est sensiblement plus haut que celui du domaine de liaison alpha ligand de récepteur d’oestrogène humain de type sauvage. Ceci suggère que le domaine de F ait une influence sur l’activité d’homodimerization de domaine de liaison alpha ligand 4-hydroxy-tamoxifen-dépendante de l’espèce. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de tester l’activité basale du domaine de liaison d’ADN GAL4 fusionné récepteur d’oestrogène alpha ligand lier l’activité du domaine avec votre ligand.Cette activité devrait être la même que le traitement des véhicules.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

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Une méthode générale pour la détection des Nitrosamide Formation du métabolisme In Vitro des Nitrosamines par Cytochrome P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Évaluation de l’Invasion des cellules et le processus de Migration : une comparaison de la rayure axée sur le Microscope vidéo blessure test et le test de chambre de Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Utilisant le test de Dot pour analyser la Migration des cellules feuilles

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

À l’aide de CRISPR/Cas9 gène édition pour étudier l’activité oncogénique de calréticuline mutante dans les cellules hématopoïétiques dépendant de Cytokine

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Une procédure complète d’évaluer la Performance In Vitro de la néovascularisation Hémangioblastome putatif à l’aide de l’ellipsoïde test de germination

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Ostéosarcome utilisant le Syndrome de Li-Fraumeni cellules souches de pluripotentes induites Patient dérivé de modélisation

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

Raman exaltée de surface résonance diffusion Nanoprobe Ratiometry pour détecter le Cancer de l’ovaire microscopique par l’intermédiaire de récepteurs de l’acide folique ciblage

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Fabrication de cellules T de récepteur d'antigène chimérique (CAR) pour l'immunothérapie adoptive

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Cartographie des relations structure-fonction des facteurs de transcription oncogènes désordonnés à l’aide de l’analyse transcriptomique

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...