Name: detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

Die Autoren danken DRS. Sueyoshi und Wang an das National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) für ihre kritischen Lektüre des Manuskripts und Tanner Jefferson für die Durchführung von Verfahren auf dem Video. Diese Arbeit wurde von den nationalen Instituten der Gesundheit Grant 1ZIAES070065 (zu K.S.K.) aus der Division des intramuralen Forschung von den NIEHS unterstützt.

1. Vorbereitung der Plasmide Säugetier-Zweimischling Assay
<ol><li>Verwenden Sie die folgenden Plasmide: pG5-Luc, pBIND-ERαEF und Pakt-ERαEF. Hinweis: Die Plasmide sind von den Autoren auf Anfrage erhältlich und werden auf Filterpapier gesendet. pG5-Luc ist das Reporter-Plasmid, das fünf Wiederholungen des GAL4 enthält ansprechende Elemente mit der Luciferase Ausdruck Einheit (Abb. 1A) fusioniert. pBIND-ERαEF ist das Protein-Expressionsplasmid für GAL4DBD versch...

<ol>
	<li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F+domain+of+estrogen+receptor+&#945;+is+involved+in+species-specific,+tamoxifen-mediated+transactivation.">The F domain of estrogen receptor &#945; is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li><li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor.">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li><li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+estrogen+receptor/coactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen.">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li><li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization.">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li><li>Montano, M. M., M&#252;ller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor:+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists.">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).</li><li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+&#945;+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions.">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor &#945; that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li><li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. , (2011).</li><li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+&#945;+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element.">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor &#945; Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li><li>Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists.">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).</li><li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries:+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta.">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li><li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+L543A,+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists,+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity.">Estrogen receptor &#945; L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li></ol>

Hier beschrieben wir das Protokoll für die M2H Assay mit Schwerpunkt auf der Assay-Bedingungen für die Homodimerization Aktivität von ERα LBD als Vorbild. Im Allgemeinen ist die M2H Assay nicht beliebt für die Beurteilung der Liganden-abhängige ERα LBD Dimerisierung Aktivität. Dies ist aufgrund der ERα LBD besitzen eine transkriptionelle Aktivierungsfunktion; deren Tätigkeit stört, in einigen Fällen die Ergebnisse des M2H Assays. Wie wir hier zeigen, kann jedoch M2H Assay verwendet werden, für die Analyse de...

Östrogen-Rezeptor Alpha (ERα) ist eine Östrogene Liganden-abhängige Transkription-Regler. Die Aminosäure Sequenceof ERα ist stark zwischen den Arten erhalten. Wegen der höheren Homologie zwischen Mensch und Maus ERα, die Funktion dieser Rezeptoren ist gedacht als identisch und die differenzielle Aktivität der östrogene Substanzen (z.B. Tamoxifen) in jenen Sorten entsteht durch die Arten Unterschiede in chemischen Stoffwechsel und nicht durch die strukturellen Unterschiede der ERα. ERα hat sehr Domänenstrukturen konserviert, die häufig bei der nuklearen Rezeptoren (NR)-Superfamilie, Bezeichnung A bis F Domänen sind. Der E-Domäne oder Liganden-bindende Domäne (LBD) beinhaltet die Liganden-Bindungstasche und die transkriptionelle Aktivierungsfunktion 2, AF-2 genannt. Die F-Domäne ist unmittelbar neben der E-Domäne lokalisiert und ist die variabelste Domäne unter der NRs. Auch zwischen Mensch und Maus ERα, die Homologie des Geschäftsfeldes F ist deutlich geringer als die der anderen Domänen1. Die Liganden gebundenes LBD ERα erhöht die Homodimerization des ERα-Proteins, das jeweilige Östrogen reagierende DNA-Element direkt für die Regulierung der Liganden-abhängige Gentranskription (klassische Aktion des ERα) zu binden. Kristallographische Untersuchungen haben ergeben, dass die differentielle Positionierung der Helix 12 (AF-2 zentrale Domäne) mit Estradiol (E2)- oder 4-hydroxy-Tamoxifen (4OHT) - LBD Dimere2,3gebunden. Die ERα F-Domäne (45 Aminosäuren) Helix 12 direkt verbinden. Allerdings gibt es keine Informationen über die Wirkung dieser Erweiterung von 45 Aminosäuren (F Domäne) aus der Helix 12 auf ERα LBD Dimerisierung. In der vorliegenden Studie zeigen wir den Beitrag der F-Domäne, die artspezifische 4OHT-abhängige ERα LBD-Homodimerization mit einem Säugetier Zweimischling (M2H) Assay.
Die M2H-Assay ist eine Methode, um Protein-Protein-Interaktionen in Säugerzellen, die Einführung der drei verschiedenen Plasmid-DNA nachweisen: zwei Protein Ausdruck Plasmide, die GAL4 DNA-bindende Domäne (DBD) Fusion Fusion ERα LBD und VP16AD ERα LBD zum Ausdruck bringen, und ein GAL4RE verschmolzen Luciferase Reporter Expressionsplasmid. Wenn die GAL4DBD Fusion ERα LBD und die VP16AD Fusion ERα LBD interagieren (stellen ein Dimer) in den Zellen dieser Protein-Komplex bindet an die GAL4RE und dann aktiviert Luciferase-gen-Expression durch die Funktion VP16AD-abhängigen werden. Die LBD Homodimerization können durch die Luciferase-Aktivität bewertet werden.
Die Hefe Zweimischling (Y2H) Test ist eine alternative Methode, basierend auf dem gleichen Prinzip, das Hefe als der Host-Umgebung verwendet. Frühere Berichte über das Y2H-System gezeigt, dass F-Domäne-abgeschnitten menschlichen ERα LBD E2-abhängige Coactivator Einstellung erhöht, zum Schluss, dass die Domain F E2-vermittelten Transkription4verhindert. Dieses Ergebnis widerspricht andere Berichte, die die abgeschwächte transkriptionelle Aktivität der F-Domäne-abgeschnitten menschlichen ERα in Säugerzellen5,6unter Beweis gestellt haben. Vor kurzem, nachweislich unsere Studie mit dem M2H System, die E2-abhängige Coactivator Rekrutierung Aktivität des menschlichen ERα LBD verringerte sich um F Domäne abschneiden in Säugetierzellen und steht im Einklang mit Transkription Aktivität1. Diese Beobachtungen legen nahe, dass die physiologische Rolle von Protein-Protein Interaktion in einer Zelle Art-spezifisch und Kontext unterscheidet. M2H Assay kann Proteinprotein Interaktion Aktivität im gleichen Zusammenhang mit zellulären zeigen, die für die Bestimmung der transkriptionellen Aktivität verwendet wird. Dies bietet einen Vorteil im Vergleich zu den Y2H oder andere in-vitro- Protein-Protein Interaktion Analysen M2H-Assay.
Es bleiben Fragen über die molekularen Mechanismen der teilweisen Agonist Tätigkeit der selektiven Östrogen-Rezeptor-Modulatoren (SERMs) (z.B. 4OHT) zu ERα-vermittelten Transkription regulieren. ERα LBD-basierte M2H Assays können angewendet werden, um den Mechanismus der teilweisen Agonist Tätigkeit der SERMs in verschiedenen Säugetier-Zelle Arten zu studieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="891">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pG5-Luc</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E249A</td>
			<td style="width:360px;">Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pBIND</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E245A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pACT</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E246A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Rotor</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing Buckets</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Resuspension Solution (CRA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Lysis Solution (CLA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neutralization Solution (NSA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Column Wash Solution (CWB)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midipreps DNA Purification Resin</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midicolumns</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">51200038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BenchMark fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-119</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053028</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Passive Lysis 5X Buffer</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax L microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay

Östrogen-Rezeptor Alpha (ERα) ist eine Östrogene Liganden-abhängige Transkription-Regler. Die Reihenfolge der ERα Protein ist stark zwischen den Arten erhalten. Es ist gedacht worden, dass die Funktion von Mensch und Maus ERαs ist identisch. Wir zeigen die differenzielle 4-hydroxy-Tamoxifen (4OHT) Wirkung auf Maus und menschliche ERα Liganden-bindende Domäne (LBD) Dimerisierung Tätigkeit mit den Säugetieren Zweimischling (M2H) Assay. M2H Assay kann die Effizienz der LBD Homodimerization Aktivität in Säugerzellen, unter Verwendung der Transfektion von zwei Protein Ausdruck Plasmide (GAL4 DNA-bindende Domäne [DBD] Fusion LBD und VP16 werden Domain [VP16AD] Fusion LBD) nachweisen und eine Gal4-responsive Element (GAL4RE) verschmolzen Luciferase Reporter Plasmid. Wenn die GAL4DBD Fusion LBD und die VP16AD Fusion LBD ein Dimer in den Zellen vornehmen, dieses Protein-Komplex bindet an die GAL4RE und dann aktiviert eine Luciferase-gen-Expression durch die VP16AD-abhängige Transkription-Aktivität. Die 4OHT-vermittelten Luciferase-Aktivierung ist in den HepG2-Zellen, die mit der Maus ERα LBD Fusion Protein Ausdruck Plasmide als in den menschlichen ERα LBD Fusion Protein Ausdruck Plasmid transfizierten Zellen transfiziert wurden höher. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Wirksamkeit der 4OHT-abhängige Maus ERα LBD Homodimerization Tätigkeit höher als menschliche ERα LBD. Die Nutzung des Assays M2H eignet sich im Allgemeinen nicht für die Bewertung der nuklearen Rezeptoren LBD Dimerisierung Aktivität, da agonistische Liganden der basalen Ebene der LBD Aktivität Verbesserung und das erschwert die Erkennung des LBD Dimerisierung Aktivität. Wir fanden, dass 4OHT nicht ERα LBD basale Aktivität verbessert. Das ist ein entscheidender Faktor für die Möglichkeit, zu bestimmen und erkennen der 4OHT-abhängige LBD Dimerisierung Aktivität für M2H Assay erfolgreich im Einsatz. ERα LBD-basierte M2H Assays können angewendet werden, um die teilweisen Agonist Tätigkeit der selektiven Östrogen-Rezeptor-Modulatoren (z.B. 4OHT) zu studieren, in verschiedenen Säugetier-Zelle.

Abbildung 3 zeigt das Schema der möglichen Antworten in der Kombination (i) und Kombination (Ii) Plasmid-transfizierten Zellen. Die experimentellen Ergebnisse sind in Abbildung 4dargestellt. Die Aktivität der Kombination (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + Pakt) zeigt Stimulation von 10 nM E2 (Abb. 4A), weil der ERα LBD die Liganden-abhängige werden funktionale Domäne, AF-2 enthält....

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Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Analyse der 4-hydroxy-Tamoxifen-abhängigen Rezeptor alpha Liganden-bindende Domäne Dimerisierung Östrogenaktivität mit Säugetieren Zweimischling Assays.

Erkennung der Liganden-bindende Domäne Dimerisierung Aktivitäten von Östrogen-Rezeptor Alpha mit den Säugetieren Zweimischling Assay

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

So kann diese Methode helfen, schlüsselwichtige Fragen über die Fähigkeit der östrogene Liganden zu regulieren Östrogen-Rezeptor Alpha und die Mechanismen der selektiven Östrogen-Rezeptor-Modulatoren zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es eine einfache Methode ist. Es zeigt Liganden-abhängige Östrogen-Rezeptor Alpha Ligand Bindung Domain Dimerisierung Aktivität in den Zellen.Demonstriert wird das Verfahren tanner Jefferson, ein Postdoc-Student aus unserer Gruppe. Diese Methode verwendet drei verschiedene Plasmide, um die Östrogen-Rezeptor-Liganden-Bindungs-Domänendimerisierungsaktivität in Zellen zu erkennen. pG5-Luc ist das luziferase Reporter Plasmid zum Nachweis der Wirksamkeit der Dimerisierungsaktivität.pBIND Maus-Östrogen-Rezeptor alpha EF ist ein Galactose-responsive Rortionfaktor GAL4 DNA-Bindung an eine Haupt-Flüssigmaus-Östrogen-Alpha-Ligand-Bindung Sende-Domain-Expression Plasmid, die an das GAL4-responsive Element auf dem pG5-Luc Reporter bindet. pACT Maus Östrogen-Rezeptor alpha EF ist ein Herpes simplex Virus transaktivierende Segment Protein VP16 Aktivierung Sactivated Domain verschmolzen Maus Östrogen-Rezeptor Alpha Ligand Bindung Domain Expression Plasmid, die nicht direkt an den pG5-Luc Reporter bindet. Wenn der richtige Ligand vorhanden ist, binden die Proteine, die vom pBIND-Maus-Östrogenrezeptor alpha EF und pACT Mouse Östrogenrezeptor alpha EF Plasmiden abgeleitet werden, durch die Bindungsdomäne des Östrogenrezeptors AlphaLigand.Die Effizienz der Dimerisierung wird durch die Luziferase-Aktivität bestimmt. Der wichtigste Schritt ist die Steuerung der Aktivität des pBIND-Maus-Östrogen-Rezeptors alpha EF abgeleitetes Protein. Die Aktivität des pBIND-abgeleiteten Östrogenrezeptors Alphaligand binden Domäne in jedem Liganden ohne die pACT Östrogen-Rezeptor alpha EF Plasmid muss vor der Analyse der Liganden-abhängigen Östrogen-Rezeptor-Liganden Bindung Domain Dimerisierung Aktivität bewertet werden.Beginnen Sie, indem Sie die entsprechenden Plasmidkombinationen in zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pro Kombination hinzufügen. Bereiten Sie die beiden Kombinationen der DNA-Mischung vor. Die erste Röhre enthält die pG5-Luc, pBIND-Östrogen-Rezeptor-alpha EF und leere pACT-Plasmide.Zweite Röhre enthält die pG5-Luc, pBIND-Östrogen-Rezeptor-alpha EF, und pACT-Östrogen-Rezeptor-alpha EF-Plasmide. Um die DNA auszuscheiden, fügen Sie dem DNA-Gemisch in jeder Röhre eine 1/9 des DNA-Gemischvolumens von drei Mol-Natriumacetat und ein 20X-Drei-Molar-Natriumacetatvolumen von 100 % Ethanol in die DNA-Mischung in jedem Röhrchen hinzu und wirbeln die Rohre. Lagern Sie die Mischungen bei 20 Grad Celsius über Nacht, bevor Sie am nächsten Morgen mit Höchstgeschwindigkeit zentrieren.Entsorgen Sie die Überräube und setzen Sie die unsichtbaren Pellets in 120 Mikroliter n. 45 % Ethanol pro Tube wieder auf, wobei darauf geachtet wird, dass jede DNA, die an den Innenteilen der Rohre klebt, abspült. Nach einer zweiten Zentrifugation unter den gleichen Bedingungen die Überstände entsorgen und die DNA 30 Minuten lang in einem Vakuumkonzentrator trocknen. Für die Transfektion die vorbereiteten humanen hepatozellulären Karzinomzellen zweimal mit 0,5 Millilitern Raumtemperatur PBS pro Brunnen pro Brunnen pro Waschbrunnen waschen und die Zellen mit 0,5 Millilitern frischem 37 Grad Celsius phenolrot-freiem MEM füttern, ergänzt mit 10% holzkohlegestreiftem, wärme-inaktiviertem fetalem Rinderserum und zwei Millimolar-L-Glutamin.Als nächstes suspendieren Sie getrocknete Plasmid-DNA-Mischung und Transfektionsreagenz in dem entsprechenden Volumen von DMEM pro Anzahl von Brunnen in einzelnen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren. Fügen Sie jedem DMEM-suspendierten Plasmid-DNA-Gemischrohr ein gleiches Volumen transfektionsreagenzmediums hinzu. Nach einer fünf- bis zehnminütigen Inkubation bei Raumtemperatur 25 Mikroliter DNA-Mischung in die entsprechenden Versuchsbrunnen der 24-Well-Human-Hepatozellulären Karzinom-Zellkulturplatte für eine sechsstündige Transfektion im Zellkultur-Inkubator geben.Und das Ende der Inkubation, ersetzen Sie das Transfektionsmedium durch 0,5 Milliliter frisches 37 Grad Celsius phenolrot-freies MEM, ergänzt durch 10% kohlegestreifte wärmeinaktivierte FBS, zwei Millimolar-L-Glutamin, 1%Penicillin-Streptomycin und Liganden pro Brunnen und geben die Zellen für weitere 16 bis 18 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück. Am nächsten Morgen die Zellen mit einem Milliliter PBS pro Brunnen waschen und die Zellen aus jedem Brunnen mit 100 Mikrolitern passiver Lysepuffer pro Brunnen und kräftigem Schütteln mit einem Wirbelmischer befestigen. Dann gefrieren Sie die Zelle lysiert in flüssigem Stickstoff.Am Tag des dualen Luziferase-Assays die Lysate auf einem Shaker schütteln, bis die Platte Raumtemperatur erreicht, und 10 Mikroliter Lysat in einzelne Brunnen einer 96-gut weißen Kunststoffplatte übertragen. Lesen Sie dann die Luziferase-Aktivität jeder Zelllysatprobe auf einem Mikroplattenleser. Die Behandlung von pBIND-Maus-Östrogenrezeptor alpha EF und pACT-Plasmiden transfizierten Zellen mit 10 Nanomolar Estradiol stimuliert die Luziferase-Aktivität, da die Östrogenrezeptor-Alphaligandenbindungsdomäne die Liganden-abhängige Transaktivierungsfunktionsdomäne AF-2 enthält.Ein- und 10-Nanomolar-Konzentrationen jedoch induzieren Luziferase-Aktivität in den Zellen transfiziert mit der Kombination von pBIND und pACT Maus Östrogen-Rezeptor Alpha EF Plasmide, was die Machbarkeit dieses Verfahrens zur Bewertung der Östrogenrezeptor Alpha Ligand Bindung Domain Dimerisierung Aktivität bei bis zu einem Nanomolar der Estradiol-Behandlung. Die Behandlung mit 4-Hydroxy-Tamoxifen löst keine Luziferase-Aktivität in den pBIND-Maus-Östrogenrezeptor-Alpha-EF- und pACT-Plasmid-Transfidenzellen aus, was darauf hindeutet, dass die AF-2-Funktion des Östrogenrezeptors alpha durch diesen Liganden nicht aktiviert wird. Bis zu 10 nanomolare Konzentrationen jedoch induziert Luziferase-Aktivität in den Zellen transfiziert mit der Kombination von pBIND und pACT Maus Östrogen-Rezeptor Alpha EF Plasmide, was darauf hindeutet, dass dieses Verfahren für die Bewertung der Östrogenrezeptor Alpha Liganden Bindung Domain Dimerisierung Aktivität bei bis zu 10 Nanomolar der 4-Hydroxy-Tamoxifen-Behandlung machbar ist.Die Aktivität aus der Kombination von pBIND und pACT Maus Östrogen-Rezeptor Alpha Ligand bindenden Domänenexpression Plasmide mit 4-Hydroxy-Tamoxifen ist signifikant höher als die Kombination von pBIND und pACT humanen Östrogen-Rezeptor Alpha Ligand bindenden Domänenexpression Plasmiden. Dies deutet darauf hin, dass die 4-Hydroxy-Tamoxifen-abhängige Homodimerisierungsaktivität der Maus Östrogen-Rezeptor-Alpha-Ligand-Bindungsdomäne stärker ist als die menschliche Östrogenrezeptor-Alphaliganbindungsdomäne. Darüber hinaus ist die 4-Hydroxy-Tamoxifen-abhängige Homodimerisierungsaktivität des Maus-Östrogen-Rezeptor-Alpha-Ligand-Bindungsbereichs, der eine menschliche F-Domäne enthält, deutlich niedriger als die der Wild-Typ-Maus-Östrogen-Rezeptor-Alpha-Ligand-Bindungsdomäne.Im Gegensatz dazu ist die 4-Hydroxy-Tamoxifen-abhängige Homodimerisierungsaktivität des menschlichen Östrogenrezeptors Alphaligand-Bindungsdomäne, die eine Maus-F-Domäne enthält, signifikant höher als die des wilden Typs humaner Östrogenrezeptor Alphaligand-Bindungsdomäne. Dies deutet darauf hin, dass die F-Domäne einen Einfluss auf die artspezifische 4-Hydroxy-Tamoxifen-abhängige Östrogenrezeptor-Alphaliganden-Bindungsdomäne Homodimerisierungsaktivität hat. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, daran zu denken, die basale Aktivität der GAL4 DNA-Bindung Seittrogen-Rezeptor Alpha Liganden binden Domain-Aktivität mit Ihrem Liganden zu testen.Diese Tätigkeit sollte mit der Fahrzeugbehandlung gleichsein.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

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Eine allgemeine Methode zur Erkennung von Nitrosamide Formation in der In-vitro- Metabolismus von Nitrosaminen durch Cytochrom P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Forschung

Krebsforschung

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Bewertung der Zelle Invasion und Migration-Prozess: ein Vergleich des Video Mikroskop-basierte Kratzers Wunde Assay und der Boyden Kammer-Test

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Mit Hilfe der Dot-Assay, Migration der Zelle Blätter zu analysieren

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Mit CRISPR/Cas9 gen untersuchen die Onkogene Aktivität des mutierten Calreticulin in Cytokine abhängigen hämatopoetischen Zellen bearbeiten

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

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Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

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Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

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Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

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The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

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Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...