Name: detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

המחברים מודים ד"ר Sueyoshi ו וואנג-נבחרת המכון למדעי בריאות הסביבה (NIEHS) שלהם לקריאה ביקורתית של כתב היד, וכן טאנר ג'פרסון על ביצוע הליכים על הוידאו. עבודה זו נתמכה על ידי מוסדות לאומיים של בריאות גרנט 1ZIAES070065 (ל K.S.K.) מן החלוקה של מגזר בחקר NIEHS.

1. הכנה של פלסמידים וזמינותו שני-היברידית יונקים
<ol><li>להשתמש את פלסמידים הבאים: pG5-לוק ', ' pBIND-ERαEF, ברית-ERαEF. הערה: פלסמידים הינם זמינים מן המחברים על פי בקשה, נשלחים על נייר סינון. pG5-לוק הוא פלסמיד כתב המכיל חמש חזרה של GAL4 אלמנטים מגיב התמזגו עם יחידת ביטוי לוציפראז (איור 1<stron...

<ol>
	<li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F+domain+of+estrogen+receptor+&#945;+is+involved+in+species-specific,+tamoxifen-mediated+transactivation.">The F domain of estrogen receptor &#945; is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li><li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor.">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li><li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+estrogen+receptor/coactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen.">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li><li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization.">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li><li>Montano, M. M., M&#252;ller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor:+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists.">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).</li><li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+&#945;+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions.">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor &#945; that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li><li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. , (2011).</li><li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+&#945;+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element.">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor &#945; Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li><li>Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists.">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).</li><li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries:+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta.">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li><li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+L543A,+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists,+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity.">Estrogen receptor &#945; L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li></ol>

במסמך זה, אנחנו תיאר את פרוטוקול וזמינותו M2H, התמקדות התנאים assay לגילוי הפעילות homodimerization של ERα LBD כדוגמה. באופן כללי, וזמינותו M2H הוא לא פופולרי להערכה של תלויות ליגנד-ERα LBD dimerization פעילות. זאת בשל LBD ERα הפו פונקציה הפעלת גנים ברמת השעתוק; הפעילות אשר מפריע, במקרים מסוימים, תוצאות וזמינותו M2H. עם ...

אלפא קולטן אסטרוגן (ERα) הוא הרגולטור שעתוק תלויות ליגנד-אסטרוגניים. Sequenceof חומצת אמינו ERα מאוד כולו בין המינים. בגלל הומולוגיה גבוה יותר בין בני האדם ואת העכבר ERα, הפונקציה של רצפטורים אלו נחשב כזהה ולאחר הפעילות דיפרנציאלית של חומרים אסטרוגניים (למשל, טמוקסיפן) של מינים אלו נגרמת על ידי ההבדלים המינים שיטות ההזנה כימי ולא על-ידי ההבדלים המבניים של ERα. ERα יש מאוד והתפאורה במבנים תחום נפוצה בקרב superfamily גרעיני קולטן (ע נ), איזור A לתחומים F. התחום E או תחום מחייב ליגנד (LBD) כוללת את הכיס ליגנד מחייב והפונקציה הפעלת גנים ברמת השעתוק 2, בשם AF-2. תחום F הוא מקומי ומייד בסמוך לקבוצת המחשבים E, הוא תחום משתנה ביותר בקרב NRs. גם בין האדם העכבר ERα, הומולוגיה של התחום F היא נמוכה באופן משמעותי מזו של שאר התחומים1. LBD ERα של ליגנד מכורך מגביר את homodimerization של החלבון ERα לאגד שהרכיב הספציפי DNA מגיב אסטרוגן ישירות לוויסות שעתוק גנים תלויי-ליגנד (פעולה קלאסי של ERα). מחקרים לחקר הגבישים גילו מיקום דיפרנציאלית של סליל 12 (AF-2 המחשבים) עם אסטרדיול (E2) - או 4-הידרוקסי-טמוקסיפן (4OHT) - מאוגד LBD הדימרים2,3. התחום ERα F (חומצות אמינו 45) להתחבר סליל 12 ישירות. עם זאת, יש אין מידע לגבי ההשפעה של הרחבה זו של חומצות אמינו 45 (תחום F) מ הסליל 12-dimerization ERα LBD. במחקר זה, נדגים את התרומה של התחום F בו homodimerization ERα LBD תלויי-4OHT תלויי מין תוך שימוש assay (M2H) של שני-היברידית יונקים.
הבדיקה M2H היא שיטה להפגין אינטראקציות חלבון בתאים בתרבית של מציגה את DNAs פלסמיד אחר שלושה: שני פלסמידים ביטוי חלבון, אשר אקספרס GAL4 DNA מחייב תחום (DBD) fusion פיוז'ן ERα LBD ו VP16AD ERα LBD, ו- a לוציפראז התמזגו GAL4RE ביטוי כתב פלסמיד. מתי הפיוז'ן GAL4DBD ERα LBD ופיוז'ן VP16AD ERα LBD אינטראקציה (להפוך דיימר) בתאים, חלבון זה מורכב נקשר GAL4RE ומפעילה, ואז, ביטוי גנים לוציפראז באמצעות הפונקציה transactivation תלויי-VP16AD. ניתן להעריך את רמת LBD homodimerization על ידי הפעילות לוציפראז.
וזמינותו שמרים 2-היברידית (Y2H) היא שיטה חלופית המבוססת על אותו עיקרון המשתמשת שמרים כמו הסביבה המארח. בדו"חות קודמים באמצעות מערכת Y2H הוכיח כי F-תחום-קטום LBD ERα האנושי מגביר גיוס coactivator תלויי-E2, מסכמים כי התחום F מונעת שעתוק בתיווך E24. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם דיווחים אחרים אשר הדגימו פעילות גנים ברמת השעתוק הקלוש של F-תחום-נחתך ERα האנושי ב-5,בתרבית של תאים6. לאחרונה, המחקר שלנו, באמצעות מערכת M2H, הפגינו פעילות גיוס coactivator תלויי-E2 LBD ERα האנושי מופחת לפי F לחיתוך תחום בתאים בתרבית של וזה עולה בקנה אחד עם פעילות שעתוק1. מקרים אלה מצביעים על תפקיד פיזיולוגי אינטראקציית חלבון-חלבון שונה באופן ספציפי סוג התא, ההקשר. וזמינותו M2H יכולים להפגין פעילות אינטראקציה חלבון באותו הקשר הסלולר המשמש לקביעת תעתיק הפעילות. זה מספק יתרון של וזמינותו M2H לעומת Y2H או אחרים במבחנה חלבון אינטראקציה ניתוחים.
נותרו שאלות הנוגעות המנגנונים המולקולריים של הפעילות אגוניסט חלקי של קולטן אסטרוגן סלקטיבי מאפננים (SERMs) (למשל, 4OHT) כדי לווסת את תמלול בתיווך ERα. ניתן להחיל מבוסס-ERα LBD מבחני M2H ללמוד את מנגנון הפעילות אגוניסט חלקי של SERMs בסוגים שונים בתרבית של תאים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="891">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pG5-Luc</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E249A</td>
			<td style="width:360px;">Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pBIND</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E245A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pACT</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E246A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Rotor</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing Buckets</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Resuspension Solution (CRA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Lysis Solution (CLA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neutralization Solution (NSA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Column Wash Solution (CWB)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midipreps DNA Purification Resin</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midicolumns</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">51200038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BenchMark fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-119</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053028</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Passive Lysis 5X Buffer</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax L microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay

אלפא קולטן אסטרוגן (ERα) הוא הרגולטור שעתוק תלויות ליגנד-אסטרוגניים. הרצף של חלבון ERα מאוד כולו בין המינים. זה כבר חשבה כי תפקידו של האדם והעכבר ERαs הוא זהה. נדגים את ההשפעה דיפרנציאלית 4-הידרוקסי-טמוקסיפן (4OHT) על ERα ליגנד מחייב תחום (LBD) dimerization פעילות אנושית שימוש בתרבית של שני-היברידית (M2H) וזמינותו של עכבר. וזמינותו M2H יכולים להדגים את היעילות של פעילות של homodimerization LBD בתרבית של תאים, ניצול של תקנים של חלבון שני ביטוי פלסמידים (דנ א GAL4 מחייב תחום [DBD] פיוז'ן LBD ו- VP16 transactivation תחום [VP16AD] פיוז'ן LBD) ו- a אלמנט מגיב GAL4 (GAL4RE) התמזגו לוציפראז כתב פלסמיד. כאשר GAL4DBD פיוז'ן LBD ופיוז'ן VP16AD LBD להפוך דיימר בתאים, חלבון זה מורכב נקשר GAL4RE ומפעילה, ואז, ביטוי גנים לוציפראז דרך הפעילות תלויה שעתוק VP16AD. הפעלת לוציפראז בתיווך 4OHT הוא גבוה יותר בתאים HepG2 היו transfected עם העכבר ERα LBD פיוז'ן חלבון ביטוי פלסמידים יותר בתאים אנושיים ERα LBD פיוז'ן חלבון ביטוי פלסמיד transfected. תוצאה זו עולה כי יעילותם של העכבר 4OHT תלויי-ERα LBD homodimerization פעילות הוא גבוה יותר מאשר LBD ERα האנושית. באופן כללי, הניצול של וזמינותו M2H אינה אידיאלית עבור הערכת קולטן גרעיני LBD dimerization פעילות, כי היתה ללא-חת ליגנדים לשפר את רמת הבסיס של הפעילות LBD ופוגע זה הגילוי של פעילות dimerization LBD. . מצאנו שאת 4OHT אינו משפר פעילות הבזליים ERα LBD. זה גורם מפתח עבור היכולת לקבוע ולגלות את הפעילות dimerization LBD תלויי-4OHT לשימוש בהצלחה את הבדיקה M2H. ניתן להחיל מבוסס-ERα LBD מבחני M2H ללמוד את הפעילות אגוניסט חלקי של קולטן אסטרוגן סלקטיבי מאפננים (למשל, 4OHT) בסוגים שונים בתרבית של תאים.

איור 3 מציגה את הערכה של תגובות אפשריות שילוב (i), שילוב (ii) פלסמיד transfected תאים. תוצאות הניסוי מוצגות באיור4. הפעילות של שילוב (i) (pG5-לוק + pBIND-mERαEF + ברית) מציג גירוי ב-10 ננומטר E2 (איור 4א'), כי LBD ERα מכיל קבוצת המחשבים פונקצי?...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

אנו מציגים שיטה לניתוח את 4-הידרוקסי-טמוקסיפן-תלוי הקולטן אלפא ליגנד מחייב תחום dimerization פעילות האסטרוגן שימוש בתרבית של שני-היברידית וזמינותו.

זיהוי ליגנד מחייב תחום פעילות Dimerization אלפא קולטן אסטרוגן באמצעות וזמינותו שני-היברידית יונקים

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

אז שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על היכולת של ליגנדים אסטרוגניים לווסת אלפא קולטן אסטרוגן ואת המנגנונים של אפנון קולטן אסטרוגן סלקטיבי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזו שיטה פשוטה. זה מדגים את קולטן אסטרוגן תלוי ליגנד אלפא ליגנד איגוד פעילות עמעום התחום בתאים.הדגמת ההליך תהיה טאנר ג'פרסון, סטודנט פוסט-דוק מהקבוצה שלנו. שיטה זו משתמשת בשלושה פלסמידים שונים כדי לזהות את פעילות עמעום תחום מחייבת של קולטן אסטרוגן בתאים. pG5-לוק הוא כתב luciferase פלסמיד לגילוי היעילות של פעילות עמעום.pBIND עכבר אסטרוגן קולטן אלפא EF הוא גורם שעתוק תגובה גלקטוז GAL4 DNA מחייב לעכבר התמזג הראשי אסטרוגן אלפא ליגנד מחייב ביטוי תחום פלסמיד כי נקשר אלמנט מגיב GAL4 על הכתב pG5-Luc. pACT עכבר אסטרוגן קולטן אלפא EF הוא וירוס הרפס סימפלקס ביצוע קטע חלבון VP16 תחום הפעלה מותך עכבר קולטן אלפא ליגנד מחייב ביטוי תחום פלסמיד שאינו נקשר ישירות לכתב pG5-Luc. כאשר ligand הנכון קיים, החלבונים נגזר קולטן האסטרוגן עכבר pBIND אלפא EF ו pACT עכבר קולטן אסטרוגן אלפא EF פלסמידים לאגד דרך התחום מחייב אלפא ליגנד קולטן אסטרוגן.יעילות העמעום נקבעת על ידי פעילות לוציפראז. הצעד החשוב ביותר הוא שליטה על הפעילות של pBIND עכבר אסטרוגן קולטן אלפא EF נגזר חלבון. יש להעריך את הפעילות של תחום איגוד אלפא ליגנד של קולטן אסטרוגן שמקורו ב- pBIND בכל ליגנד ללא קולטן האסטרוגן pACT אלפא EF פלסמיד לפני ניתוח פעילות עמעום התחום הכריכה של קולטן האסטרוגן התלויה בליגה.התחל על ידי הוספת שילובי פלסמיד המתאימים לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר לכל שילוב. מכינים את שני השילובים של תערובת הדנ"א. הצינור הראשון מכיל את pG5-Luc, קולטן pBIND-אסטרוגן-אלפא EF, ופלסמידים pACT ריקים.הצינור השני מכיל את pG5-Luc, קולטן pBIND-אסטרוגן-אלפא EF, ו pACT-אסטרוגן קולטן-אלפא EF פלסמידים. כדי לזרז את ה-DNA, להוסיף 1/9 של נפח תערובת ה-DNA של שלושה אצטט נתרן טוחן ונפח 20X שלושה נתרן אצטט טוחן של 100% אתנול לתערובת ה- DNA בכל צינור ומערבולת הצינורות. לאחסן את תערובות ב 20 מעלות צלזיוס לילה לפני צנטריפוגה במהירות מקסימלית למחרת בבוקר.השליכו את העל-טבעיים והתינו מחדש את הכדורים הבלתי נראים ב-120 מיקרוליטרים של 75% אתנול לצינור, ודאגו לשטוף כל דנ"א שדבק בחלק הפנימי של הצינורות. לאחר צנטריפוגה שנייה באותם תנאים, להשליך את supernatants ולייבש את ה-DNA במרכז ואקום במשך 30 דקות. עבור transfection, לשטוף את תאי קרצינומה hepatocellular האנושי מוכן פעמיים עם 0.5 מיליליטר של PBS בטמפרטורת החדר לכל רחצה ולהאכיל את התאים עם 0.5 מיליליטר של טרי 37 מעלות צלזיוס פנול אדום חינם MEM בתוספת 10%פחם הפשיט חום בלתי פעיל זרע שור העובר ושני מילימולר L-גלוטמין.לאחר מכן, להשעות תערובת DNA פלסמיד מיובשת ו reagent transfection בנפח המתאים של DMEM למספר בארות בודדים 1.5 מיליליטר צינורות מיקרוצנטריפוגה. הוסף נפח שווה של מדיום רגנט transfection לכל צינור תערובת DNA פלסמיד תלוי DMEM. לאחר דגירה של 5 עד 10 דקות בטמפרטורת החדר, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של תערובת דנ"א לבירות הניסוי המתאימות של צלחת תרבות תאי ההפטוצלומה האנושית בת 24 הבאר לתפנית של שש שעות באינקובטור תרבות התאים.וסוף הדגירה, להחליף את מדיום transfection עם 0.5 מיליליטר של טרי 37 מעלות צלזיוס פנול אדום חינם MEM בתוספת 10%פחם הפשיטו חום inactivated FBS, שני מילימולר L-גלוטמין, 1% פניצילין סטרפטומיצין, ו ligand ל הבאר ולהחזיר את התאים לחממה תרבות התאים עוד 16 עד 18 שעות. למחרת בבוקר, לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של PBS ל הבאר ולצרף את התאים מכל באר עם 100 microliters של חיץ תיזה פסיבית ל הבאר ורעידות נמרצות עם מערבל מערבולת. ואז להקפיא את התא lysates בחנקן נוזלי.ביום של בדיקה כפולה luciferase, לנער את lysates על שייקר עד הצלחת מגיעה לטמפרטורת החדר, ולהעביר 10 microliters של lysate ל בארות בודדות של צלחת פלסטיק לבן 96 היטב. לאחר מכן קרא את פעילות לוציפראז של כל תא ליסט מדגם על קורא מיקרופלסטיק. הטיפול של pBIND עכבר אסטרוגן קולטן אלפא EF ו pACT פלסמידים פלסמידים transfected תאים עם 10 אסטרדיול ננו-מולאר מגרה פעילות לוציפראז כמו הקולטן אסטרוגן אלפא ליגנד מחייב תחום מכיל את התחום הפונקציונלי transactivation תלוי ליגנד, AF-2.ריכוז אחד ו -10 ננו-מולאר עם זאת, לגרום לפעילות luciferase בתאים transfected עם השילוב של pBIND ו pACT עכבר אסטרוגן קולטן אלפא EF פלסמידים, מה שמרמז על היתכנות של הליך זה להערכת קולטן אסטרוגן אלפא רצועה מחייב פעילות עמעום תחום עד ננומול אחד של טיפול אסטרדיול. טיפול עם 4-הידרוקסי-טמוקסיפן אינו פולט פעילות לוציפראז ב pBIND עכבר אסטרוגן קולטן אלפא EF ו pACT פלסמיד פלסמיד תאים מומרים, מה שמרמז כי הפונקציה AF-2 של אלפא קולטן אסטרוגן אינו מופעל על ידי ליגנד זה. עד 10 ריכוזי nanomolar עם זאת, גורם לפעילות luciferase בתאים מומרים עם השילוב של pBIND ו pACT עכבר אסטרוגן קולטן אלפא EF פלסמידים, מה שמרמז כי הליך זה הוא ריאלי להערכת קולטן אסטרוגן אלפא רצועה מחייב פעילות עמעום תחום עד 10 nanomolar של 4-הידרוקסי-tamoxifen טיפול.הפעילות מהשילוב של pBIND ו pACT עכבר קולטן אסטרוגן אלפא ליגנד מחייב ביטוי תחום פלסמידים עם 4-הידרוקסי-טמוקסיפן הוא גבוה משמעותית מאשר השילוב של pBIND ו pACT קולטן אסטרוגן אנושי אלפא ליגנד מחייב ביטוי תחום פלסמידים. הדבר מצביע על כך שפעילות הומודימריזציה תלוית 4-הידרוקסי-טמוקסיפן של תחום איגוד אלפא ליגנד של קולטן האסטרוגן העכבר חזקה יותר מתחום איגוד אלפא ליגנד של קולטן האסטרוגן האנושי. יתר על כן, 4-הידרוקסי-טמוקסיפן תלוי פעילות הומודימריזציה של קולטן העכבר אסטרוגן אלפא ליגנד מחייב תחום המכיל תחום F אנושי נמוך משמעותית מזה של סוג פראי קולטן אסטרוגן אלפא ליגנד מחייב תחום.לעומת זאת, פעילות הומודימריזציה תלוית 4-הידרוקסי-טמוקסיפן של תחום מחייב אלפא ליגנד קולטן אסטרוגן אנושי המכיל תחום עכבר F גבוה משמעותית מזה של סוג פראי קולטן אסטרוגן אנושי אלפא ליגנד מחייב תחום. זה מרמז כי תחום F יש השפעה על מינים ספציפיים 4-הידרוקסי-טמוקסיפין תלוי קולטן אסטרוגן אלפא ליגנד מחייב פעילות הומודימריזציה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבדוק את הפעילות הבסיסית של GAL4 DNA מחייב תחום התמזגו קולטן אסטרוגן אלפא ליגנד לאגד פעילות תחום עם ligand שלך.פעילות זו צריכה להיות זהה לטיפול ברכב.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

שיטה כללית לגילוי Nitrosamide היווצרות בחילוף החומרים במבחנה של Nitrosamines מאת ציטוכרום P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

באמצעות וזמינותו נקודה כדי לנתח את ההעברה של גיליונות תא

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

שימוש CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי לחקור את פעילות Oncogenic Calreticulin מוטציה בתאים Hematopoietic תלויי ציטוקין

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

נוהל מקיף כדי להעריך את ביצועי במבחנה כורוידאלית Hemangioblastoma בשם משתמש את ספרואיד הלבלוב Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

מידול אוסטאוסרקומה באמצעות תאי גזע Pluripotent נגזר החולה המושרה תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

ראמאן תהודה משופרת השטח פיזור Nanoprobe Ratiometry לגילוי סרטן השחלות מיקרוסקופיים באמצעות חומצה פולית קולטן מיקוד

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

ייצור בצ הקולטן אנטיגן (רכב) T תאים לטיפול חיסוני המאמצת

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

בשנת הקמת מבחנה של הראש מהונדסים גנטית מורה וצוואר הסרטן קו תא באמצעות Adeno משויך וירוס-Cas9 מערכת

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

מיפוי קשרי מבנה-פונקציה של גורמי שעתוק אונקוגניים מופרעים באמצעות ניתוח תמלול

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...