Name: detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

लेखक डीआरएस. Sueyoshi और वांग राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (NIEHS) में पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए धंयवाद, और टांनर जेफरसन वीडियो पर प्रक्रियाओं के प्रदर्शन के लिए । इस काम को नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट 1ZIAES070065 (K.S.K.) ने NIEHS के अंदर रिसर्च के डिविजन से सपोर्ट किया था ।

1. स्तनधारी दो के लिए Plasmids की तैयारी-संकर परख
<ol><li>निम्न plasmids का उपयोग करें: pG5-ल्यूक, pBIND-ERαEF, और इमानदारी-ERαEF । नोट: plasmids अनुरोध पर लेखकों से उपलब्ध है और फ़िल्टर कागज पर भेजा जाता है । pG5-ल्यूक रिपोर्टर प्लाज्मिड कि...

<ol>
	<li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F+domain+of+estrogen+receptor+&#945;+is+involved+in+species-specific,+tamoxifen-mediated+transactivation.">The F domain of estrogen receptor &#945; is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li><li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor.">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li><li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+estrogen+receptor/coactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen.">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li><li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization.">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li><li>Montano, M. M., M&#252;ller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor:+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists.">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).</li><li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+&#945;+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions.">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor &#945; that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li><li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. , (2011).</li><li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+&#945;+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element.">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor &#945; Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li><li>Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists.">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).</li><li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries:+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta.">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li><li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+L543A,+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists,+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity.">Estrogen receptor &#945; L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li></ol>

इस के साथ साथ, हम M2H परख के लिए प्रोटोकॉल वर्णित है, एक उदाहरण के रूप में ERα LBD के homodimerization गतिविधि का पता लगाने के लिए परख शर्तों पर ध्यान केंद्रित । सामांय में, M2H परख ligand-निर्भर ERα LBD dimerization गतिविधि के आकलन के लिए लो?...

एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा (ERα) एक एस्ट्रोजन ligand-निर्भर प्रतिलेखन नियामक है । एमिनो एसिड sequenceof ERα प्रजातियों के बीच अत्यधिक संरक्षित है । मानव और माउस ERα के बीच उच्च समरूपता की वजह से, इन रिसेप्टर्स के समारोह के रूप में समान के बारे में सोचा है, और उन प्रजातियों में एस्ट्रोजन पदार्थों (जैसे, tamoxifen) की विभेदक गतिविधि में प्रजातियों के मतभेदों के कारण होता है रासायनिक चयापचय के बजाय ERα के संरचनात्मक मतभेदों से । ERα उच्च डोमेन संरचनाओं कि परमाणु रिसेप्टर (NR) superfamily के बीच आम है संरक्षित है, एफ डोमेन के लिए नामित । E डोमेन या ligand-बाइंडिंग डोमेन (LBD) में ligand-बाइंडिंग पॉकेट और transcriptional सक्रियण फ़ंक्शन 2, नामक वायुसेना-2 शामिल हैं । एफ डोमेन तुरंत ई डोमेन के निकट स्थानीयकृत है और एनआरएस के बीच सबसे चर डोमेन है । यहां तक कि मानव और माउस ERα के बीच, एफ डोमेन के समरूपता है कि अंय डोमेन1की तुलना में काफी कम है । ERα के ligand-बाउंड LBD ERα प्रोटीन के homodimerization को ligand-निर्भर जीन प्रतिलेखन (ERα की शास्त्रीय क्रिया) को विनियमित करने के लिए सीधे विशिष्ट एस्ट्रोजन-उत्तरदायी डीएनए तत्व को बाँधना बढ़ाता है. Crystallographic अध्ययन एस्ट्राडियोल (E2)-या 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT)-बाउंड LBD dimers2,3के साथ कुंडल 12 (वायुसेना-2 कोर डोमेन) के अंतर स्थिति से पता चला है । ERα एफ डोमेन (४५ एमिनो एसिड) वक्र 12 सीधे कनेक्ट । हालांकि, वहां ४५ अमीनो एसिड (F डोमेन) के इस विस्तार के प्रभाव के बारे में कोई जानकारी नहीं है ERα LBD dimerization पर कुंडल 12 से । इस अध्ययन में, हम प्रजातियों के लिए एफ डोमेन के योगदान-विशिष्ट 4OHT-निर्भर ERα LBD homodimerization एक स्तनधारी दो संकर (M2H) परख का उपयोग प्रदर्शित करता है ।
M2H परख एक विधि को स्तनधारी कोशिकाओं तीन अलग प्लाज्मिड DNAs: दो प्रोटीन अभिव्यक्ति plasmids है, जो एक्सप्रेस GAL4 डीएनए बंधन डोमेन (DBD) फ्यूजन ERα LBD और VP16AD फ्यूजन ERα LBD शुरू करने में प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का प्रदर्शन है, और एक GAL4RE-जुड़े luciferase अभिव्यक्ति रिपोर्टर प्लाज्मिड. जब GAL4DBD फ्यूजन ERα LBD और VP16AD फ्यूजन ERα LBD (एक डिमर बनाने) कोशिकाओं में, इस प्रोटीन जटिल बांध GAL4RE और, फिर, luciferase-निर्भर VP16AD समारोह के माध्यम से transactivation जीन अभिव्यक्ति सक्रिय करता है । luciferase गतिविधि के द्वारा LBD homodimerization के स्तर का मूल्यांकन किया जा सकता है ।
खमीर दो संकर (Y2H) परख एक वैकल्पिक एक ही सिद्धांत है कि मेजबान पर्यावरण के रूप में खमीर का उपयोग करता है पर आधारित विधि है । पिछले Y2H प्रणाली का उपयोग कर रिपोर्ट का प्रदर्शन किया है कि एफ डोमेन-छोटा मानव ERα LBD वृद्धि e2-निर्भर coactivator भर्ती, समापन कि एफ डोमेन e2-मध्यस्थ प्रतिलेखन4रोकता है । यह परिणाम जो F-डोमेन-छोटा मानव ERα के स्तनधारी कक्ष5,6में तनु transcriptional गतिविधि का प्रदर्शन किया है अंय रिपोर्ट के साथ असंगत है । हाल ही में, हमारे अध्ययन, M2H प्रणाली का उपयोग कर, यह दर्शाता है कि मानव ERα LBD के E2 पर निर्भर coactivator भर्ती गतिविधि स्तनधारी कोशिकाओं में एफ डोमेन जनचेतना से कम है और प्रतिलेखन गतिविधि1के अनुरूप है. इन टिप्पणियों का सुझाव है कि प्रोटीन प्रोटीन बातचीत की शारीरिक भूमिका एक सेल प्रकार-विशिष्ट तरीके और संदर्भ में अलग है । M2H परख एक ही सेलुलर संदर्भ है कि transcriptional गतिविधि का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है में प्रोटीन प्रोटीन संपर्क गतिविधि का प्रदर्शन कर सकते हैं । यह Y2H या अन्य इन विट्रो प्रोटीन-प्रोटीन इंटरेक्शन विश्लेषण की तुलना में M2H परख का एक लाभ प्रदान करता है ।
वहां चयनात्मक एस्ट्रोजन रिसेप्टर ढा (SERMs) (जैसे, 4OHT) के आंशिक एगोनिस्ट गतिविधि के आणविक तंत्र के बारे में प्रश्न ERα-मध्यस्थता प्रतिलेखन को विनियमित करने के लिए रहते हैं । ERα LBD-आधारित M2H की परख विभिन्न SERMs कोशिका प्रकारों में स्तनधारी के आंशिक एगोनिस्ट कार्यकलाप के तंत्र का अध्ययन करने के लिए लागू की जा सकती है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="891">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pG5-Luc</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E249A</td>
			<td style="width:360px;">Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pBIND</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E245A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pACT</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E246A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Rotor</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing Buckets</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Resuspension Solution (CRA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Lysis Solution (CLA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neutralization Solution (NSA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Column Wash Solution (CWB)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midipreps DNA Purification Resin</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midicolumns</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">51200038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BenchMark fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-119</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053028</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Passive Lysis 5X Buffer</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax L microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay

एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा (ERα) एक एस्ट्रोजन ligand-निर्भर प्रतिलेखन नियामक है । ERα प्रोटीन के अनुक्रम प्रजातियों के बीच अत्यधिक संरक्षित है । यह सोचा गया है कि मानव और माउस ERαs के समारोह के समान है । हम अंतर 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) माउस और मानव ERα ligand-बाध्यकारी डोमेन (LBD) dimerization दो-संकर (स्तनधारी) परख का उपयोग गतिविधि पर प्रभाव प्रदर्शित करता है । M2H परख स्तनधारी कोशिकाओं में LBD homodimerization गतिविधि की क्षमता का प्रदर्शन कर सकते हैं, दो प्रोटीन अभिव्यक्ति अभिकर्मक के plasmids का उपयोग (GAL4 डीएनए-बंधन डोमेन [DBD] फ्यूजन LBD और VP16 transactivation डोमेन [VP16AD] फ्यूजन LBD) और एक GAL4-उत्तरदायी तत्व (GAL4RE) से जुड़े luciferase रिपोर्टर प्लाज्मिड. जब GAL4DBD फ्यूजन LBD और VP16AD फ्यूजन LBD कोशिकाओं में एक डिमर बनाने के लिए, इस प्रोटीन जटिल GAL4RE करने के लिए बांध और, फिर, luciferase निर्भर प्रतिलेखन गतिविधि के माध्यम से एक VP16AD जीन अभिव्यक्ति सक्रिय करता है. 4OHT-मध्यस्थता luciferase सक्रियण HepG2 कोशिकाओं है कि माउस के साथ transfected थे में अधिक है ERα LBD फ्यूजन प्रोटीन अभिव्यक्ति plasmids की तुलना में मानव ERα LBD फ्यूजन प्रोटीन अभिव्यक्ति प्लाज्मिड transfected कोशिकाओं. इस परिणाम से पता चलता है कि 4OHT-निर्भर माउस ERα LBD homodimerization गतिविधि की प्रभावकारिता मानव ERα LBD से अधिक है । सामांय में, M2H परख के उपयोग परमाणु रिसेप्टर LBD dimerization गतिविधि के मूल्यांकन के लिए आदर्श नहीं है, क्योंकि agonistic लाइगैंडों LBD गतिविधि के बेसल स्तर को बढ़ाने और है कि LBD dimerization गतिविधि का पता लगाने में बाधा उत्पंन करता है । हमने पाया है कि 4OHT ERα LBD बेसल गतिविधि में वृद्धि नहीं करता है । यह निर्धारित करने और सफलतापूर्वक M2H परख का उपयोग करने के लिए 4OHT-निर्भर LBD dimerization गतिविधि का पता लगाने में सक्षम होने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है । ERα LBD-आधारित M2H परख चयनात्मक एस्ट्रोजन रिसेप्टर मॉडुलन के आंशिक एगोनिस्ट गतिविधि का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है (जैसे, 4OHT) विभिन्न स्तनधारी कोशिका प्रकार में.

चित्रा 3 संयोजन (i) और संयोजन (ii) प्लाज्मिड-transfected कोशिकाओं में संभावित प्रतिक्रियाओं की योजना प्रदर्शित करता है । प्रायोगिक परिणाम चित्रा 4में दिखाया गया है । संयोजन की ग...

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Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

हम 4-hydroxy-tamoxifen-निर्भर एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा ligand-बाइंडिंग डोमेन dimerization गतिविधि का उपयोग स्तनधारी दो-संकर परख का विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं ।

एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा के Ligand-बाइंडिंग डोमेन Dimerization गतिविधि का पता लगाने के स्तनधारी दो-संकर परख का उपयोग

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

इसलिए यह विधि एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा को विनियमित करने के लिए एस्ट्रोजेनिक लिगांड की क्षमता और चयनात्मक एस्ट्रोजन रिसेप्टर मोडुलाटर के तंत्र के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह एक सरल तरीका है। यह कोशिकाओं में लिगांड-निर्भर एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा लिगांड बाध्यकारी डोमेन डाइमराइजेशन गतिविधि को दर्शाता है।प्रक्रिया का प्रदर्शन टानर जेफरसन, हमारे समूह से एक पोस्टडॉक छात्र होगा । यह विधि कोशिकाओं में एस्ट्रोजन रिसेप्टर लिगामेंट बाइजन बाइंडिंग डोमेन डाइमराइजेशन गतिविधि का पता लगाने के लिए तीन अलग-अलग प्लाज्मिड का उपयोग करती है। pG5-Luc डाइमेराइजेशन गतिविधि की प्रभावकारिता का पता लगाने के लिए लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर प्लाज्मिड है।pBIND माउस एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा EF एक गैलेक्टोज-उत्तरदायी प्रतिलेखन कारक GAL4 डीएनए एक मुख्य फ्यूज्ड माउस एस्ट्रोजन अल्फा लिगांड बाध्यकारी डोमेन अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के लिए बाध्यकारी है जो pG5-Luc रिपोर्टर पर GAL4 उत्तरदायी तत्व से बांधता है। पक्टेक्यू माउस एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा ईएफ एक दाद सिंप्लेक्स वायरस ट्रांसएक्टिवेट सेगमेंट प्रोटीन वीपी16 एक्टिवेशन डोमेन फ्यूज्ड माउस एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा लिगामेंट बाइंडिंग डोमेन एक्सप्रेशन प्लाज्मिड है जो सीधे pG5-Luc रिपोर्टर से नहीं बांधता है। जब उचित लिगामेंट मौजूद होता है, तो पीबीएनडी माउस एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा ईएफ और पीईटी माउस एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा ईएफ प्लाज्मिड्स से प्राप्त प्रोटीन एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा लिगामेंट बाध्यकारी डोमेन के माध्यम से बांधते हैं।डाइमाइजेशन की दक्षता लूसिफ़ेरेस गतिविधि द्वारा निर्धारित की जाती है। सबसे महत्वपूर्ण कदम पीबीआईएनडी माउस एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा ईएफ व्युत्पन्न प्रोटीन की गतिविधि को नियंत्रित करना है। पीबीआईएनडी-व्युत्पन्न एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा लिगांड बांध डोमेन की गतिविधि प्रत्येक लिगांड में प्याय के बिना एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा ईएफ प्लाज्मिड का मूल्यांकन लिगांड-निर्भर एस्ट्रोजन रिसेप्टर लिगांड बाध्यकारी डोमेन डिमेराइजेशन गतिविधि का विश्लेषण करने से पहले किया जाना चाहिए।संयोजन प्रति दो 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में उपयुक्त प्लाज्मिड संयोजन जोड़कर शुरू करें। डीएनए मिश्रण के दो संयोजन तैयार करें। पहली ट्यूब में pG5-Luc, pBIND-एस्ट्रोजन रिसेप्टर-अल्फा EF, और खाली pACT प्लाज्मिड शामिल हैं।दूसरी ट्यूब में PG5-Luc, pBIND-एस्ट्रोजन रिसेप्टर-अल्फा EF, और pACT-एस्ट्रोजन रिसेप्टर-अल्फा EF प्लाज्मिड्स शामिल हैं । डीएनए को तेज करने के लिए, डीएनए मिश्रण की मात्रा का एक 1/9 तीन मोलर सोडियम एसीटेट और प्रत्येक ट्यूब में डीएनए मिश्रण में 100% इथेनॉल की 20X तीन मोलर सोडियम एसीटेट मात्रा जोड़ें और ट्यूबों को भंवर दें। अगली सुबह अधिकतम गति से अपकेंद्री से पहले रात भर 20 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण स्टोर करें ।सुपरनेटेंट्स को त्यागें और 75% इथेनॉल प्रति ट्यूब के 120 माइक्रोलीटर में अदृश्य छर्रों को फिर से खर्च करें, ट्यूबों के अंदर फंसे किसी भी डीएनए को कुल्ला करने का ख्याल रखते हैं। एक ही परिस्थितियों में एक दूसरे अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेटेंट को त्यागें और डीएनए को 30 मिनट के लिए वैक्यूम सांद्रता में सुखा लें। ट्रांसफैक्शन के लिए, तैयार मानव हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा कोशिकाओं को दो बार कमरे के 0.5 मिलीलीटर के साथ धोएं- तापमान पीबीएस प्रति अच्छी तरह से प्रति वॉश और कोशिकाओं को ताजा 37 डिग्री सेल्सियस फिनोल लाल-मुक्त मेम के 0.5 मिलीलीटर के साथ खिलाएं 10% चारकोल-छीन गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण-इनएक्टिवेटेड भ्रूण लिरम और दो मिलीमोलर-ग्लूटाइमिन के साथ पूरक।इसके बाद, अलग-अलग 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में कुओं की संख्या के अनुसार डीएमईएम की उचित मात्रा में सूखे प्लाज्मिड डीएनए मिश्रण और ट्रांसफैक्शन रिएजेंट को निलंबित करें। प्रत्येक डीएमईएम-निलंबित प्लाज्मिड डीएनए मिश्रण ट्यूब में ट्रांसफैक्शन रिएजेंट माध्यम की बराबर मात्रा जोड़ें। कमरे के तापमान पर पांच से 10 मिनट की इनक्यूबेशन के बाद, सेल कल्चर इनक्यूबेटर में छह घंटे के ट्रांसफेक्शन के लिए 24-अच्छी तरह से मानव हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा सेल कल्चर प्लेट के उपयुक्त प्रायोगिक कुओं में डीएनए मिश्रण के 25 माइक्रोलीटर जोड़ें।और इनक्यूबेशन का अंत, ट्रांसफेक्शन माध्यम को 0.5 मिलीलीटर ताजा 37 डिग्री सेल्सियस फेनोल रेड-फ्री एमईएम के साथ प्रतिपूरित 10% चारकोल-छीन लिया गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस, दो मिलीमोलर एल-ग्लूटामीन, 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमामाइसिन, और लिगांड प्रति अच्छी तरह से और कोशिकाओं को एक और 16 से 18 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापसी के साथ पूरक किया जाता है। अगली सुबह, पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को अच्छी तरह से धोएं और प्रत्येक कुएं से कोशिकाओं को अच्छी तरह से निष्क्रिय लाइसिस बफर के 100 माइक्रोलीटर के साथ संलग्न करें और भंवर मिक्सर के साथ जोरदार मिलाते हुए। इसके बाद लिक्विड नाइट्रोजन में सेल को फ्रीज कर दें।डुअल लूसिफ़ेरेस परख के दिन, प्लेट के कमरे के तापमान तक पहुंचने तक एक शेकर पर lysates हिलाएं, और 96-अच्छी तरह से सफेद प्लास्टिक प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में lysate के 10 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें। फिर प्रत्येक सेल की लूसिफ़ेरेस गतिविधि को एक माइक्रोप्लेट रीडर पर lysate नमूना पढ़ें। पीबीआईएनडी माउस एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा ईएफ और पीएटी प्लाज्मिड्स का उपचार 10 नैनोमोलियर एस्ट्राडिओल के साथ संक्रमित कोशिकाओं को लुसिफ़ेरेस गतिविधि को उत्तेजित करता है क्योंकि एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा लिगांड बाध्यकारी डोमेन में लिगांड-निर्भर ट्रांसएक्टिवेशन कार्यात्मक डोमेन, एएफ-2 शामिल है।एक और 10-नैनोमोलर सांद्रता हालांकि, पीबीआईएनडी और पीएक्ट माउस एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा ईएफ प्लाज्मिड्स के संयोजन से संक्रमित कोशिकाओं में लूसिफ़ेरेस गतिविधि को प्रेरित करती है, जो एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा लिगांड बाध्यकारी डोमेन डिमेराइजेशन गतिविधि के मूल्यांकन के लिए इस प्रक्रिया की व्यवहार्यता का सुझाव देती है। 4-हाइड्रोक्सी-टैमोक्सिफेन के साथ उपचार पीबीआईएनडी माउस एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा ईएफ और पीसीएटी प्लाज्मिड संक्रमित कोशिकाओं में लूसिफ़ेरेस गतिविधि को प्रकाश में नहीं रखता है, जिससे यह सुझाव मिलता है कि एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा का एएफ-2 कार्य इस लिगामेंट द्वारा सक्रिय नहीं है। 10 नैनोमोलर सांद्रता तक हालांकि, पीबीआईएनडी और पीएटी माउस एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा ईएफ प्लाज्मिड्स के संयोजन से संक्रमित कोशिकाओं में लूसिफ़ेरेस गतिविधि को प्रेरित करता है, यह सुझाव देता है कि यह प्रक्रिया एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा लिगामेंटेड बाध्यकारी डोमेन डिमेराइजेशन गतिविधि के मूल्यांकन के लिए संभव है 4-हाइड्रोक्सी-टैमोक्सिफेन उपचार के 10 नैनोमोलर तक।पीबीएनडी और पीएक्ट माउस एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा लिगांड बाइंडिंग डोमेन एक्सप्रेशन प्लाज्मिड्स के साथ 4-हाइड्रोक्सी-टैमोक्सिफेन के संयोजन से गतिविधि पीबीआईएनडी और पीएक्ट ह्यूमन एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा लिगांड बाइंडिंग डोमेन एक्सप्रेशन प्लाज्मिड्स के संयोजन से काफी अधिक है। यह इंगित करता है कि माउस एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा लिगांड बाइंडिंग डोमेन की 4-हाइड्रोक्सी-टैमोक्सिफेन-निर्भर होमोडिमराइजेशन गतिविधि मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा लिगांड बाध्यकारी डोमेन की तुलना में अधिक शक्तिशाली है। इसके अलावा, माउस एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा लिगामेंट बाध्यकारी डोमेन की 4-हाइड्रोक्सी-टैमोक्सिफेन-निर्भर होमोडिमराइजेशन गतिविधि जिसमें मानव एफ डोमेन होता है, वह जंगली प्रकार के माउस एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा लिगांड बाध्यकारी डोमेन की तुलना में काफी कम है।इसके विपरीत, माउस एफ डोमेन युक्त मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा लिगांड बाध्यकारी डोमेन की 4-हाइड्रोक्सी-टैमोक्सिफेन-निर्भर होममोडिमराइजेशन गतिविधि जंगली प्रकार के मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा लिगामेंट बाध्यकारी डोमेन की तुलना में काफी अधिक है। इससे पता चलता है कि एफ डोमेन का प्रजातियों-विशिष्ट 4-हाइड्रोक्सी-टैमोक्सिफेन-निर्भर एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा लिगांड बाइंडिंग डोमेन होमोसर्मेशन गतिविधि पर प्रभाव पड़ता है। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, अपने लिगामेंट के साथ GAL4 डीएनए बाइंडिंग डोमेन फ्यूज्ड एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा लिगामेंट बांध डोमेन गतिविधि की बेसल गतिविधि का परीक्षण करना याद रखना महत्वपूर्ण है।वह गतिविधि वाहन उपचार के समान होनी चाहिए ।

Research

JoVE Journal

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Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

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Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

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