Name: detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

Gli autori ringraziano la d. ssa Sueyoshi e Wang presso il National Institute di Environmental Health Sciences (NIEHS) per la loro lettura critica del manoscritto e Tanner Jefferson per l'esecuzione di procedure sul video. Questo lavoro è stato supportato dalla 1ZIAES070065 di istituti nazionali di salute Grant (a K.S.K.) dalla divisione di ricerca intramurale del NIEHS.

1. preparazione di plasmidi per il dosaggio di due-ibrido dei mammiferi
<ol><li>Utilizzare i plasmidi seguenti: pG5-Luc, pBIND-ERαEF e patto-ERαEF. Nota: I plasmidi sono disponibili da parte degli autori su richiesta e vengono inviati su carta da filtro. pG5-Luc è il plasmide di reporter che contiene cinque ripetizioni di GAL4 reattivi elementi fusi con l'unità di espressione di luciferase (Figura 1A). pBIND-ERαEF è il plasmide di espressione della proteina per le...

<ol>
	<li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F+domain+of+estrogen+receptor+&#945;+is+involved+in+species-specific,+tamoxifen-mediated+transactivation.">The F domain of estrogen receptor &#945; is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li><li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor.">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li><li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+estrogen+receptor/coactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen.">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li><li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization.">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li><li>Montano, M. M., M&#252;ller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor:+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists.">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).</li><li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+&#945;+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions.">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor &#945; that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li><li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. , (2011).</li><li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+&#945;+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element.">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor &#945; Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li><li>Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists.">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).</li><li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries:+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta.">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li><li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+L543A,+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists,+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity.">Estrogen receptor &#945; L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li></ol>

Qui, abbiamo descritto il protocollo per il dosaggio di M2H, concentrandosi sulle condizioni di test per rilevare l'attività di omodimerizzazione di ERα LBD come esempio. In generale, il dosaggio di M2H non è popolare per la valutazione delle attività di dimerizzazione ERα LBD ligando-dipendente. Ciò è dovuto il ERα LBD che possiede una funzione di attivazione trascrizionale; la cui attività si disturba, in alcuni casi, i risultati del dosaggio M2H. Tuttavia, come dimostriamo qui, l'analisi di M2H può essere us...

Recettore degli estrogeni (ERα) è un regolatore della trascrizione di ligando-dipendenti estrogenici. La sequenza dell'amminoacido ERα è altamente conservata tra le specie. A causa di più alta omologia tra umani ed ERα il mouse, la funzione di questi recettori è pensata come identici, e l'attività differenziale di sostanze estrogeniche (ad es., tamoxifene) in quelle specie è causato da differenze della specie in metabolismi chimici piuttosto che dalle differenze strutturali di ERα. ERα è altamente conservata strutture di dominio che sono comuni tra la superfamiglia dei recettori nucleari (NR), designato ai domini di F. E dominio o dominio di legame al ligando (LBD) include la tasca di ligand-legantesi e la funzione di attivazione trascrizionale 2, denominata AF-2. Il dominio di F è localizzato immediatamente adiacente al dominio E ed è il dominio più variabile tra la NRs. Anche tra umani e mouse ERα, omologia del dominio di F è notevolmente inferiore a quello di altri domini1. Il LBD-ligando di ERα migliora la dimerizzazione della proteina ERα per associare l'elemento specifico di DNA estrogeno-rispondente direttamente per regolare la trascrizione genica di ligando-dipendenti (classica azione di ERα). Studi cristallografici hanno rivelato il posizionamento differenziale dell'elica 12 (AF-2 core domain) con estradiolo (E2) - o 4-idrossi-tamoxifen (4OHT) - associato LBD dimeri2,3. Il dominio di ERα F (45 aminoacidi) collegare elica 12 direttamente. Tuttavia, non c'è nessuna informazione per quanto riguarda l'effetto di questa estensione di 45 aminoacidi (dominio F) dall'elica 12 sulla dimerizzazione di ERα LBD. In questo studio, dimostriamo il contributo del dominio F per la specie-4OHT-dipendente ERα LBD omodimerizzazione usando un'analisi di (M2H) due-ibrido dei mammiferi.
Il dosaggio di M2H è un metodo per dimostrare le interazioni proteina-proteina in cellule di mammifero introducendo le tre differenti plasmide DNAs: due plasmidi di espressione della proteina, che esprimono la fusione di dominio (DBD) GAL4 DNA-legantesi ERα LBD e VP16AD fusione ERα LBD, e un GAL4RE-fuse luciferasi espressione del reporter del. Quando la fusione GAL4DBD ERα LBD e la fusione di VP16AD ERα LBD interagire (fare un dimero) nelle cellule, questo complesso della proteina si lega per il GAL4RE e, quindi, attiva l'espressione di gene di luciferase attraverso la funzione di transattivazione di VP16AD-dipendente. Il livello di LBD omodimerizzazione può essere valutato con l'attività luciferasica.
Il dosaggio di lievito due-ibrido (Y2H) è un metodo alternativo basato sullo stesso principio che utilizza lievito come l'ambiente host. Utilizzando il sistema di Y2H i rapporti precedenti hanno dimostrato che F-dominio-troncato umano ERα LBD aumenta reclutamento di coactivator di E2-dependent, concludendo che il dominio di F previene E2-mediata trascrizione4. Questo risultato è coerente con altri rapporti che hanno dimostrato l'attività trascrizionale attenuato di F-dominio-troncato ERα umano in cellule di mammiferi5,6. Recentemente, il nostro studio, utilizzando il sistema M2H, ha dimostrato che l'attività di reclutamento di coactivator E2-dipendente di umano ERα LBD è diminuito del troncamento del dominio di F in cellule di mammiferi ed è coerenza con la trascrizione attività1. Queste osservazioni suggeriscono che il ruolo fisiologico di interazione proteina-proteina differisce in un modo specifico del tipo di cella e contesto. Il dosaggio di M2H può dimostrare attività di interazione proteina-proteina nello stesso contesto cellulare che viene utilizzato per determinare l'attività trascrizionale. Ciò fornisce un vantaggio del dosaggio M2H rispetto alla Y2H o altre analisi di interazione proteina-proteina in vitro .
Ci rimangono domande per quanto riguarda i meccanismi molecolari dell'attività agonista parziale di modulatori dei recettori selettivi dell'estrogeno (SERMs)(ad esempio, 4OHT) per regolare la trascrizione ERα-mediata. Analisi di M2H ERα LBD-based possono essere applicate per studiare il meccanismo dell'attività agonista parziale di SERMs in vari tipi di cellule di mammifero.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="891">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pG5-Luc</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E249A</td>
			<td style="width:360px;">Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pBIND</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E245A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pACT</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E246A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Rotor</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing Buckets</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Resuspension Solution (CRA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Lysis Solution (CLA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neutralization Solution (NSA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Column Wash Solution (CWB)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midipreps DNA Purification Resin</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midicolumns</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">51200038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BenchMark fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-119</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053028</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Passive Lysis 5X Buffer</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax L microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay

Recettore degli estrogeni (ERα) è un regolatore della trascrizione di ligando-dipendenti estrogenici. La sequenza della proteina ERα è altamente conservata tra le specie. Si è pensato che la funzione dell'essere umano e il mouse ERαs è identico. Dimostriamo l'effetto differenziale 4-idrossi-tamoxifen (4OHT) il mouse e attività dimerizzazione del dominio (LBD) del ligand-legantesi ERα umana usando l'analisi di (M2H) due-ibrido dei mammiferi. Il dosaggio di M2H in grado di dimostrare l'efficienza delle attività di omodimerizzazione LBD in cellule di mammifero, che utilizzano la transfezione di due plasmidi di espressione della proteina (GAL4 DNA-binding dominio [DBD] fusione LBD e VP16 transactivation dominio [VP16AD] fusione LBD) e un Elemento Gal4-sensible a reagire (GAL4RE) fuso plasmide del reporter di luciferase. Quando la fusione GAL4DBD LBD e la fusione di VP16AD LBD fanno un dimero nelle cellule, questo complesso della proteina si lega per il GAL4RE e, quindi, attiva un'espressione di gene della luciferasi attraverso l'attività di trascrizione dipendente VP16AD. L'attivazione di 4OHT-mediata luciferasi è maggiore nelle cellule HepG2 che sono state trasfettate con i plasmidi della espressione di proteina fusione ERα LBD di mouse rispetto nelle cellule del plasmide transfettata espressione umane del proteina fusione ERα LBD. Questo risultato suggerisce che l'efficacia del mouse 4OHT-dipendente attività omodimerizzazione ERα LBD è superiore umano ERα LBD. In generale, l'utilizzo del dosaggio M2H non è ideale per la valutazione dell'attività di dimerizzazione LBD recettore nucleare, perché agonistiche ligandi che permettono di migliorare il livello basale dell'attività LBD e che impedisce la rilevazione di attività di dimerizzazione LBD. Abbiamo trovato che 4OHT non migliora l'attività basale ERα LBD. Che è un fattore chiave per essere in grado di determinare e rilevare l'attività di dimerizzazione di LBD 4OHT-dipendente per con successo usando l'analisi M2H. Analisi di M2H ERα LBD-based possono essere applicate per studiare l'attività agonista parziale dei modulatori del recettore estrogeno selettivo (ad esempio, 4OHT) in vari tipi di cellule di mammifero.

Figura 3 Visualizza la combinazione di possibili risposte la combinazione (i) e combinazione (ii) plasmide-transfettati. I risultati sperimentali sono riportati nella Figura 4. L'attività della combinazione (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + patto) Mostra di stimolazione di 10 nM E2 (Figura 4A), perché la LBD ERα contiene il dominio di transattivazione ligando-dipendente funzionale, A...

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Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

Presentiamo un metodo per analizzare la 4-idrossi-tamoxifen-dipendente dell'estrogeno recettore alfa ligand-legantesi dominio dimerizzazione attività usando l'analisi di due-ibrido dei mammiferi.

Rilevazione dell'attività di dimerizzazione del dominio Ligand-legantesi del recettore degli estrogeni usando l'analisi di due-ibrido dei mammiferi

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

Quindi questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla capacità dei ligandi estrogenici di regolare l'alfa del recettore degli estrogeni e i meccanismi dei modulatori selettivi del recettore degli estrogeni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un metodo semplice. Dimostra l'attività di dimerizzazione del dominio dimerizzazione del dominio del recettore degli estrogeni dipendente dal ligando nelle cellule.A dimostrare la procedura sarà Tanner Jefferson, uno studente postdoc del nostro gruppo. Questo metodo utilizza tre diversi plasmidi per rilevare l'attività di dimerizzazione del dominio di legame del recettore degli estrogeni nelle cellule. pG5-Luc è il plasmide reporter luciferasi per rilevare l'efficacia dell'attività di dimerizzazione.Il recettore degli estrogeni del topo pBIND alpha EF è un fattore di trascrizione galattosio-responsive GAL4 DNA legato a un principale plasmide di espressione del dominio alfa ligando del topo fuso che si lega all'elemento reattivo GAL4 sul reporter pG5-Luc. PACT mouse estrogen receptor alpha EF è un virus herpes simplex transactivating segment protein VP16 dominio di attivazione fuso mouse estrogeno recettore alfa ligando legame dominio espressione plasmide che non si lega direttamente al giornalista pG5-Luc. Quando è presente il ligando corretto, le proteine derivate dal recettore degli estrogeni del topo pBIND alfa EF e dal recettore degli estrogeni del topo pACT alfa EF plasmidi si legano attraverso il dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni.L'efficienza della dimerizzazione è determinata dall'attività della luciferasi. Il passo più importante è controllare l'attività del recettore degli estrogeni del topo pBIND alfa proteina derivata da EF. L'attività del recettore degli estrogeni derivato da pBIND alfa ligando legare il dominio in ogni ligando senza il recettore degli estrogeni pACT alfa EF plasmide deve essere valutata prima di analizzare l'attività di dimerizzazione del dominio legante del recettore degli estrogeni dipendente dal ligando.Inizia aggiungendo le combinazioni plasmide appropriate in due tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri per combinazione. Preparare le due combinazioni della miscela di DNA. Il primo tubo contiene pG5-Luc, recettore pBIND-estrogeno-alfa EF e plasmidi pACT vuoti.Il secondo tubo contiene i pG5-Luc, il recettore pBIND-estrogeno-alfa EF e i plasmidi pACT-recettore-estrogeno-alfa EF. Per far precipitare il DNA, aggiungere un 1/9 del volume della miscela di DNA di tre acetati di sodio molare e un volume di acetato di sodio molare 20X del 100% di etanolo alla miscela di DNA in ogni tubo e vortice dei tubi. Conservare le miscele a 20 gradi Celsius durante la notte prima di centrifugare alla massima velocità la mattina successiva.Scartare i supernaganti e rimescolare i pellet invisibili in 120 microlitri di 75% di etanolo per tubo, facendo attenzione a risciacquare qualsiasi DNA attaccato all'interno dei tubi. Dopo una seconda centrifugazione nelle stesse condizioni, scartare i supernatanti e asciugare il DNA in un concentratore sottovuoto per 30 minuti. Per la trasfezione, lavare due volte le cellule carcinoma epatocellulari umane preparate con 0,5 millilitri di PBS a temperatura ambiente per pozzo per lavaggio e nutrire le cellule con 0,5 millilitri di MEM fresco privo di fenolo di 37 gradi Celsius, integrato con siero bovino fetale inattivato al carbone del 10% e due L-glutammina millimolare.Successivamente, sospendere la miscela di DNA plasmide essiccato e il reagente di trasfezione nel volume appropriato di DMEM per numero di pozzi in singoli tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Aggiungere un volume uguale di mezzo reagente di trasfezione a ciascun tubo di miscela di DNA plasmide sospeso da DMEM. Dopo un'incubazione da cinque a 10 minuti a temperatura ambiente, aggiungere 25 microlitri di miscela di DNA ai pozzi sperimentali appropriati della piastra di coltura cellulare del carcinoma epatocellulare umano a 24 porri per una trasfezione di sei ore nell'incubatore di coltura cellulare.E alla fine dell'incubazione, sostituire il mezzo di trasfezione con 0,5 millilitri di MEM fresco privo di fenolo di 37 gradi Celsius integrato con FBS inattivato al calore 10% spogliato di carbone, due l-glutammina millimolare, 1%penicillina streptomicina e ligando per pozzo e riportare le cellule nell'incubatrice di coltura cellulare per altre 16-18 ore. La mattina dopo, lavare le cellule con un millilitro di PBS per pozzo e attaccare le cellule da ogni pozzo con 100 microlitri di tampone dilisi passiva per pozzo e scuotere vigorosamente con un miscelatore a vortice. Quindi congelare i liscimi cellulari in azoto liquido.Il giorno del doppio test della luciferasi, agitare i lisati su uno shaker fino a quando la piastra raggiunge la temperatura ambiente e trasferire 10 microlitri di lisato in singoli pozzi di una piastra di plastica bianca da 96 po '. Quindi leggi l'attività della luciferasi di ogni campione di lisato cellulare su un lettore di micropiatte. Il trattamento del recettore degli estrogeni del topo pBIND alfa EF e pACT plasmidi cellule trasfette con 10 estradiolo nanomolare stimola l'attività luciferasi in quanto il dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni contiene il dominio funzionale di transattivazione dipendente dal ligando, AF-2.Una e 10 concentrazioni nanomolare, tuttavia, inducono l'attività della luciferasi nelle cellule trasfette con la combinazione di pBIND e pACT recettore degli estrogeni del topo alfa EF plasmidi, suggerendo la fattibilità di questa procedura per valutare l'attività di dimerizzazione del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni fino a un nanomolare del trattamento estradiolo. Il trattamento con 4-idrossi-tamoxifene non provoca attività luciferasi nel recettore degli estrogeni del topo pBIND alfa EF e cellule transfette plasmidali pACT, suggerendo che la funzione AF-2 del recettore degli estrogeni alfa non è attivata da questo ligando. Fino a 10 concentrazioni nanomolare, tuttavia, induce l'attività della luciferasi nelle cellule trasfette con la combinazione di pBIND e recettore degli estrogeni del topo pACT alfa EF plasmidi, suggerendo che questa procedura è fattibile per valutare l'attività di dimerizzazione del dominio di legame del recettore degli estrogeni alfa ligando fino a 10 nanomolare del trattamento con 4-idrossi-tamoxifene.L'attività dalla combinazione di pBIND e pACT mouse estrogen receptor alpha ligand binding domain expression plasmidi con 4-idrossi-tamoxifene è significativamente superiore alla combinazione di pBIND e pACT umano recettore degli estrogeni alfa ligando legame dominio espressione plasmidi. Ciò indica che l'attività di omodimerizzazione dipendente da 4 idrossi-tamoxifene del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni del topo è più potente del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni umani. Inoltre, l'attività di omodimerizzazione dipendente da 4-idrossi-tamoxifene del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni del topo contenente un dominio F umano è significativamente inferiore a quella del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni del topo di tipo selvatico.Al contrario, l'attività di omodimerizzazione dipendente da 4-idrossi-tamoxifene del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni umani contenente un dominio F del topo è significativamente superiore a quella del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni umani di tipo selvatico. Ciò suggerisce che il dominio F ha un'influenza sull'attività di omodimerizzazione del dominio alfa ligando legante alfa legante 4-idrossi-tamoxifene dipendente dalle specie. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di testare l'attività basale del dominio di legame del DNA GAL4 che lega il ligando alfa del recettore degli estrogeni fuso legare l'attività del dominio con il ligando.Tale attività dovrebbe essere la stessa del trattamento del veicolo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

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Un metodo generale per la rilevazione Nitrosamide formazione nel metabolismo In Vitro di nitrosammine di citocromo P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Valutazione del processo di migrazione e l'invasione delle cellule: un confronto dello Scratch Video basati su microscopio ferita test e le analisi della camera di Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Usando l'analisi di Dot per analizzare la migrazione degli strati delle cellule

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Utilizzando CRISPR/Cas9 Gene Editing per studiare l'attività oncogena di calreticulina mutante in cellule ematopoietiche Cytokine dipendente

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

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Una procedura completa per valutare le prestazioni In Vitro del Hemangioblastoma Neovascularization putativo utilizzando la sferoide germogliatura Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modellazione di Osteosarcoma con la sindrome di Li-Fraumeni paziente-derivato indotto Pluripotent Stem Cells

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

Risonanza di superficie-enhanced Raman Scattering Nanosonda Ratiometry per la rilevazione di cancro ovarico microscopico tramite ricevitore di folato di Targeting

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

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Produzione Chimeric Antigen Receptor (CAR) Cellule T per l'immunoterapia adottiva

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In Vitro Creazione di una linea cellulare di cancro di Murine geneticamente ingegnerizzato e collo utilizzando un sistema Adeno-Associated Virus-Cas9

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Mappatura delle relazioni struttura-funzione dei fattori di trascrizione oncogenica disordinati utilizzando l'analisi trascrittomica

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...