Name: detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

著者は、原稿とタナー ジェファーソンの彼らの重要な読書のためのビデオの手順を実行するため夫妻末吉と王で、国立環境衛生研究所 (NIEHS) をありがとうございます。この作品は、(K.S.K.) に、NIEHS の学内研究部門からの国内機関の健康の付与 1ZIAES070065 によって支えられました。

1 哺乳類の 2 つのハイブリッド試金のためのプラスミッドの準備
<ol><li>次のプラスミドを使用: 協定 ERαEF へ ERαEF、pG5 リュック。 注: プラスミッドはリクエストの作成者から利用でき、ろ紙上に送信されます。pG5 リュックは、ルシフェラーゼ発現ユニット (図 1A) と敏感な要素が融合した GAL4 の 5 つの繰り返しを含む記者プラスミドです。ERαEF は ERα LBD ...

<ol>
	<li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F+domain+of+estrogen+receptor+&#945;+is+involved+in+species-specific,+tamoxifen-mediated+transactivation.">The F domain of estrogen receptor &#945; is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li><li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor.">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li><li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+estrogen+receptor/coactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen.">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li><li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization.">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li><li>Montano, M. M., M&#252;ller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor:+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists.">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).</li><li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+&#945;+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions.">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor &#945; that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li><li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. , (2011).</li><li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+&#945;+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element.">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor &#945; Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li><li>Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists.">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).</li><li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries:+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta.">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li><li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+L543A,+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists,+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity.">Estrogen receptor &#945; L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li></ol>

ここで、我々 は例として ERα LBD のダイマー化アクティビティを検出するアッセイ条件に焦点を当て M2H 試金のためのプロトコルを説明します。一般に、M2H アッセイは、リガンド依存性 ERα LBD 二量体化活動の評価のため人気がないです。これは転写活性化機能を有する ERα LBD 原因です。活動はいくつかのケースで、M2H アッセイの結果を妨げます。しかし、我々 がここに示すよう M2H アッセ?...

エストロゲンの受容器のアルファ (ERα) は、エストロゲンのリガンド依存性転写レギュレータです。アミノ酸順序 ERα 種間保存性が高い。人間で高い相同性のため ERα をマウス、これらの受容体の機能は、同じものとして考えられてし、の種の違いによって引き起こされるそれらの種のエストロゲン様物質 (例えばタモキシフェン) 差分の活動化学代謝 ERα の構造的な違いではなく。ERα は高度 A を F ドメインに指定 (NR) 核内受容体スーパーファミリーの間で共通のドメイン構造に保存します。E ドメインまたはリガンド結合ドメイン (LBD) は、リガンド結合ポケットと転写活性化機能 2、AF 2 という名前です。F ドメインは、E ドメインに隣接はローカライズされ、NRs の間でほとんどの変数のドメインです。人間の間でもマウスの ERα、F ドメインの相同性は、他のドメイン1のそれよりも有意に低かった。リガンド ERα LBD は、リガンド依存性遺伝子の転写 (ERα の古典的なアクション) を規制するために直接特定のエストロゲン応答性 DNA 要素をバインドする ERα 蛋白質のダイマー化を向上させます。結晶構造解析は、LBD ダイマー2,3をバインド配置ヘリックス 12 (AF 2 コア ドメイン) または 4-ヒドロキシ-タモキシフェン (4OHT)、エストラジ オール (E2) との差異を明らかにしました。ERα F ドメイン (45 アミノ酸) ヘリックス 12 に直接接続します。ただし、ERα LBD ートコフェロール ヘリックス 12 から 45 アミノ酸 (F ドメイン) のこの拡張機能の影響に関する情報はありません。本研究では、哺乳類 2 ハイブリッド (M2H) アッセイを用いた特異的 4OHT 依存 ERα LBD ダイマー化を F ドメインの寄与を示しています。
M2H アッセイは哺乳類細胞の 3 つの異なるプラスミド Dna を導入することでタンパク質間相互作用を実証する方法: 2 つのタンパク質発現プラスミド、GAL4 DNA 結合ドメイン (DBD) 融合 ERα LBD と VP16AD の融合 ERα LBD を表現してGAL4RE 融合ルシフェラーゼ発現レポーター プラスミド。GAL4DBD 融合 ERα LBD と VP16AD 融合 ERα LBD が対話する (二量体を作る)、セルのこの蛋白質の複合体、GAL4RE にバインドし、その後、アクティブにルシフェラーゼ遺伝子発現 VP16AD 依存型転写活性化関数を。LBD ダイマー化のレベルは、ルシフェラーゼ活性によって評価できます。
酵母 2 ハイブリッド (Y2H) アッセイは、酵母を使用して、ホスト環境と同じ原理に基づく代替方法です。Y2H システムを使用して以前のレポートは、人間 ERα LBD の F ドメイン切り捨て増加 E2 依存コアクチベーター募集 F ドメインが E2 を介した転写4を防止することを締結することを示した。この結果、哺乳類細胞5,6F ドメイン切り捨て人間 ERα の減衰転写活性を示している他のレポートと一致。最近、M2H システムを使用して、我々 の研究は、人間 ERα LBD の E2 依存コアクチベーター採用活動が哺乳動物細胞での F ドメイン切り捨てによる減少は、転写アクティビティ1と一致を示した。タンパク質間相互作用の生理的役割細胞型固有の方法でコンテキストとは異なることが示唆されました。M2H アッセイは、転写活性を決定するために使用される同じ細胞コンテキストのタンパク質-タンパク質相互作用アクティビティをデモンストレーションできます。これは、Y2H や他の in vitroタンパク質-タンパク質相互作用解析に比べて M2H アッセイの利点を提供します。
選択的エストロゲン受容体モジュレーター (Serm) (例えば4OHT) ERα を介した転写を調節する部分アゴニスト活性の分子メカニズムに関する質問が残っています。ERα LBD M2H アッセイは、様々 な哺乳類の細胞タイプの Serm の部分アゴニスト活性のメカニズムを研究に適用あります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="891">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pG5-Luc</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E249A</td>
			<td style="width:360px;">Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pBIND</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E245A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pACT</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E246A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Rotor</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing Buckets</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Resuspension Solution (CRA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Lysis Solution (CLA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neutralization Solution (NSA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Column Wash Solution (CWB)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midipreps DNA Purification Resin</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midicolumns</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">51200038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BenchMark fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-119</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053028</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Passive Lysis 5X Buffer</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax L microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay

エストロゲンの受容器のアルファ (ERα) は、エストロゲンのリガンド依存性転写レギュレータです。ERα タンパク質のシーケンスは、種間保存性が高い。それは人間の機能およびマウス ERαs が同じであると考えられています。マウスと人間の ERα リガンド結合ドメイン (LBD) 二量体化活動哺乳類 2 ハイブリッド (M2H) アッセイを用いた差動 4-ヒドロキシ-タモキシフェン (4OHT) の効果を実証します。M2H アッセイは 2 つ蛋白質発現プラスミド (GAL4 DNA 結合ドメイン [DBD] 融合 LBD と VP16 転写活性化ドメイン [VP16AD] フュージョン LBD) のトランスフェクションを利用した哺乳類セルの LBD ダイマー化活動の効率性を示すことができるとGAL4 応答性エレメント (GAL4RE) は、ルシフェラーゼ レポーター プラスミドを融合しました。GAL4DBD 融合 LBD と LBD VP16AD 融合細胞の二量体を作る、この蛋白質の複合体は、GAL4RE に結合し、その後、VP16AD 依存性転写活動を通じてルシフェラーゼ遺伝子の発現を活性化します。4OHT を介したルシフェラーゼ活性は、マウス ERα LBD 融合タンパク質発現プラスミドよりひと ERα LBD 融合タンパク質発現 transfected プラスミッド細胞を導入させた HepG2 細胞で高い。4OHT 依存マウス ERα LBD ダイマー化活動の有効性は人間の ERα LBD よりも高いと考えられる。一般に、M2H アッセイの使用率は核内受容体 LBD 二量体化活動の評価にとって理想的 LBD 活動の基底のレベルを高め、LBD 二量体化活性の検出を妨げ敵対配位子。その 4OHT に ERα LBD 基底活性強化ないとわかりました。決定および M2H アッセイを正しく使用するための 4OHT 依存 LBD 二量体化活動を検出することの重要な要因であります。ERα LBD M2H アッセイは、様々 な哺乳類の細胞選択的エストロゲン受容体モジュレーター (例えば4OHT) の部分アゴニスト活性を研究する適用できます。

図 3では、組み合わせ (i) と (ii) プラスミド トランスフェクト細胞の組み合わせで可能な応答のスキームが表示されます。実験の結果は図 4のとおりです。(I) (pG5 リュック + へ mERαEF 協定) の組み合わせの活動刺激を示しています 10 nM E2 (図 4A) ERα LBD に AF 2 リガンド依存性転写機能ドメイ?...

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Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

4-ヒドロキシ タモキシフェン-依存性エストロゲン受容体 α リガンド結合ドメイン二量体化アクティビティ哺乳類の 2 つのハイブリッド試金を使用しての解析法を提案します。

哺乳類 2 ハイブリッド法によるエストロゲン受容体 α リガンド結合ドメインの二量体化活性の検出

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

したがって、この方法は、エストロゲン受容体αを調節するエストロゲンリガンドの能力と選択的エストロゲン受容体モジュレーターのメカニズムに関する重要な質問に答えることができます。この手法の主な利点は、単純な方法です。細胞内のリガンド依存性エストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン二量体化活性を示す。手順をデモンストレーションするタナー・ジェファーソン、私たちのグループのポスドクの学生になります。この方法は、細胞内のエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン二量体化活性を検出するために3つの異なるプラスミドを使用する。pG5-Lucは、二量体化活性の有効性を検出するためのルシファーゼレポータープラスミドである。pBINDマウスエストロゲン受容体αEFは、pG5-Lucレポーター上のGAL4応答性要素に結合する主融合マウスのエストロゲンαリガンド結合ドメイン発現プラスミドに結合するガラクトース応答性転写因子GAL4 DNAである。pACTマウスエストロゲン受容体αEFは、pG5-Lucレポーターに直接結合しないマウスエストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン発現プラスミドを融合した単純なウイルストランスアクティベートセグメントタンパク質VP16活性化ドメインである。適切なリガンドが存在する場合、pBINDマウスエストロゲン受容体αEFおよびpACTマウスエストロゲン受容体αEFプラスミド由来のタンパク質は、エストロゲン受容体αリガンド結合ドメインを介して結合する。二量体化の効率は、ルシファーゼ活性によって決定される。最も重要なステップは、pBINDマウスエストロゲン受容体αEF由来タンパク質の活性を制御することである。pACTエストロゲン受容体を含まない各リガンドにおけるpBIND由来エストロゲン受容体αリガンド結合ドメインの活性は、リガンド依存性エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン二量体化活性を分析する前に評価しなければならない。適切なプラスミドの組み合わせを、組み合わせごとに2つの1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに追加します。DNA混合物の2つの組み合わせを準備します。第1の管は、pG5-Luc、pBIND-エストロゲン受容体-αEF、および空のpACTプラスミドを含む。第2の管は、pG5-Luc、pBIND-エストロゲン受容体-αEF、およびpACT-エストロゲン受容体-αEFプラスミドを含む。DNAを沈殿させるために、3つの酢酸モルナトリウムのDNA混合物体積の1/9と20X3酢酸ナトリウム100%エタノールの3倍の大臼歯ナトリウムを各チューブおよび渦管のDNA混合物に加える。翌朝の最高速度で遠心分離機を行う前に、一晩摂氏20度で混合物を保管してください。上澄み液を捨て、チューブあたり75%エタノールの120マイクロリットルで目に見えないペレットを再中断し、チューブの内側に付着したDNAをすすいでください。同じ条件で2回目の遠心分離を行った後、上清を捨てて、真空濃縮器でDNAを30分間乾燥させます。トランスフェクションでは、調製したヒト肝細胞癌細胞を1回の洗浄1回あたり0.5ミリリットルの室温PBSで2回洗浄し、10%炭除去熱不活化ウシシ血清および2ミリモルL-グルタミンを補った新鮮な37度のフェノール赤自由MEMの0.5ミリリットルで細胞を供給する。次に、乾燥プラスミドDNA混合物およびトランスフェクション試薬を、個々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管内のウェル数当たりの適切な量のDMEMで懸濁液。各DMEM懸濁プラスミドDNA混合物チューブに等量のトランスフェクション試薬培地を加える。室温で5〜10分間のインキュベーションの後、24ウェルヒト肝細胞癌細胞培養プレートの適切な実験井戸に25マイクロリットルのDNA混合物を加え、細胞培養インキュベーターで6時間のトランスフェクションを行う。そして、インキュベーションの終わりは、10%の炭を取り除いた熱不活性化FBS、2ミリモルLグルタミン、1%ペニシリンストレプトマイシン、およびリガンドを18時間に細胞培養インキュベーターに戻した新鮮な37°Cフェノール赤自由MEMの0.5ミリリットルでトランスフェクション培地を交換し、細胞を18時間に戻す。翌朝、細胞を井戸1回につき1ミリリットルのPBSで洗い、各ウェルから100マイクロリットルの受動的な溶菌バッファーをボルテックスミキサーで激しく揺れ動かして細胞を取り付けます。その後、液体窒素中の細胞ライセートを凍結します。二重ルシファーゼアッセイの日に、プレートが室温に達するまでシェーカーでライセートを振り、96ウェルの白いプラスチック板の個々の井戸に10マイクロリットルのライセートを移します。次に、マイクロプレートリーダー上の各細胞ライセートサンプルのルシファーゼ活性を読み取る。pBINDマウスエストロゲン受容体αEFおよびpACTプラスミドの治療は、10ナノモルエストラジオールを有するトランスフェクト細胞を刺激し、エストロゲン受容体αリガンド結合ドメインがリガンド依存性トランス活性化機能ドメインであるAF-2を含有するようにルシファーゼ活性を刺激する。しかし、1および10ナノモル濃度は、pBINDおよびpACTマウスエストロゲン受容体αEFプラスミドの組み合わせでトランスフェクトされた細胞におけるルシファーゼ活性を誘導し、エストラジオール治療のナノモル1ナノモルでエストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン二量体化活性を評価するためのこの手順の実現可能性を示唆している。4-ヒドロキシタモキシフェンによる治療は、pBINDマウスエストロゲン受容体αEFおよびpACTプラスミドトランスフェクション細胞におけるルシファーゼ活性を惹起せず、エストロゲン受容体αのAF-2機能がこのリガンドによって活性化されないことを示唆している。しかし、最大10ナノモル濃度は、pBINDおよびpACTマウスエストロゲン受容体αEFプラスミドの組み合わせでトランスフェクトされた細胞中のルシファーゼ活性を誘導し、この手順は、4-ヒドロキシタモキシフェン処理の最大10ナノモルでエストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン二量体化活性を評価するために実現可能であることを示唆している。pBINDとpACTマウスの組み合わせから4-ヒドロキシタモキシフェンとの発現プラスミドのエストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン発現プラスミドは、pBINDとpACTヒトエストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン発現プラスミドの組み合わせよりも有意に高い。これは、マウスエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインの4-ヒドロキシタモキシフェン依存性ホモジマー化活性がヒトエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインよりも強力であることを示している。また、ヒトFドメインを含むマウスエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインの4-ヒドロキシタモキシフェン依存性ホモジマー化活性は、野生型マウスのエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインのそれよりも有意に低い。これに対し、マウスFドメインを含むヒトエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインの4-ヒドロキシタモキシフェン依存性ホモジマー化活性は、野生型ヒトエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインのそれよりも有意に高い。これは、Fドメインが種特異的な4-ヒドロキシタモキシフェン依存性エストロゲン受容体αリガンド結合ドメインホモメーラ化活性に影響を及ぼすことを示唆している。この手順を試みている間に、 GAL4 DNA結合ドメインの基底活性をテストすることが重要です エストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン活性をリガンドと結合.その活動は、車両の治療と同じである必要があります。

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The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

ドットの試金を使用して細胞シートの移行を分析するには

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

CRISPR/Cas9 を使用して遺伝子変異カルレティキュリン サイトカイン依存性造血細胞での発癌性の活動を調査する編集

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

発芽アッセイ回転楕円体を使用して推定される芽新生体外パフォーマンスを評価する包括的な手順

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

李 Fraumeni 症候群患者由来の誘導多能性幹細胞を用いた骨肉腫をモデリング

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

表面増強共鳴ラマン葉酸受容体を介して顕微鏡による卵巣癌の検出のためのナノプローブ比を散乱によるターゲット設定

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

キメラ抗原受容体(CAR)T細胞の養子免疫療法用

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

アデノ関連ウイルス-Cas9システムを用いた遺伝子操作マウス頭頸部癌細胞株のインビトロ確立

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

トランスクリプトーム解析を用いた無秩序発がん性転写因子の構造機能関係のマッピング

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...