Name: detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

저자 감사 박사 스에요시와 왕에서 국립 환경 건강 과학 연구소 (NIEHS) 원고, 태 너 제퍼슨의 그들의 중요 한 독서에 대 한 비디오에서 절차를 수행. 이 작품은 NIEHS의 교내 연구 부문에서에서 (K.S.K.)에 국가 학회 건강 그랜트 1ZIAES070065에 의해 지원 되었다.

1. 포유류 2 하이브리드 분석 결과 대 한 플라스 미드의 준비
<ol><li>다음 플라스 미드를 사용 하 여: pG5 뤽, pBIND-ERαEF, 그리고 협정-ERαEF. 참고:는 플라스 미드는 요청 시 저자에서 고 필터 종이에 전송 됩니다. pG5 뤽 기자 플라스 미드 GAL4 응답 요소 luciferase 식 장치(그림 1)융합의 5 개의 반복을 포함 하는. pBIND-ERαEF ERα LBD GAL4DBD 융합 단백질의 단백질 식 플라스 ?...

<ol>
	<li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F+domain+of+estrogen+receptor+&#945;+is+involved+in+species-specific,+tamoxifen-mediated+transactivation.">The F domain of estrogen receptor &#945; is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li><li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor.">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li><li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+estrogen+receptor/coactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen.">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li><li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization.">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li><li>Montano, M. M., M&#252;ller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor:+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists.">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).</li><li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+&#945;+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions.">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor &#945; that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li><li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. , (2011).</li><li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+&#945;+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element.">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor &#945; Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li><li>Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists.">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).</li><li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries:+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta.">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li><li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+L543A,+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists,+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity.">Estrogen receptor &#945; L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li></ol>

여기, 우리는 예를 들어 ERα LBD의 homodimerization 활동을 탐지 하기 위한 시험 조건에 초점을 맞추고 M2H 분석 결과 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 일반적으로, M2H 분석 결과 ligand 의존 ERα LBD 이합체 화 활동의 평가 대 한 인기가 되지 않습니다. 이것은 보유 transcriptional 활성화 함수; ERα LBD 활동 방해, 경우도 M2H 분석 결과의 결과. 그러나, 우리가 여기 보여줍니다 M2H 분석 결과 LBD (예를 들어, 4OHT...

에스트로겐 수용 체 알파 (ERα)는 estrogenic ligand 의존 전사 레 귤 레이 터 이다. 아미노산 sequenceof ERα이 높은 종 가운데 보존 됩니다. 인간 사이의 높은 상 동 때문에 및 ERα 마우스,이 수용 체의 기능으로 동일의 생각 하 고 그 종에서 estrogenic 물질 (예, tamoxifen)의 차동 활동은 종족의 차이에 의해 발생 화학 물질 대사 보다는 ERα의 구조적 차이 의해. ERα 높은 F 도메인 A를 지정 하는 핵 수용 체 (NR) superfamily 중 공통 되는 도메인 구조를 보존 했다. E 도메인 또는 ligand 바인딩 도메인 (LBD) 포함 ligand 바인딩 주머니와 transcriptional 활성화 기능 2, AF-2 라는. F 도메인 E 도메인에 인접 한 지역화 이며이 NRs 중 가장 변수 도메인. 인간 사이도 마우스 ERα, F 도메인의 homology 다른 도메인1보다 크게 낮습니다. Ligand 바인딩 ERα LBD ligand 의존 유전자 전사 (ERα의 고전 액션) 규제에 대 한 직접 특정 스 트로 겐-응답 DNA 요소를 바인딩할 ERα 단백질의 homodimerization 향상. 결정학 연구 LBD 이합체2,3바운드 나선 estradiol (e 2)-또는 4-hydroxy-타 목 시 펜 (4OHT)-12 (AF-2 핵심 도메인)의 차동 위치를 계시 했다. ERα F 도메인 (45 아미노산) 나선 12를 직접 연결 합니다. 그러나, ERα LBD 이합체 화에 나선 12에서에서 45 아미노산 (F 도메인)의이 확장의 효과 관한 어떠한 정보도가 있다. 이 연구는 포유류 2-하이브리드 (M2H) 분석 결과 사용 하 여 종의 4OHT 종속 ERα LBD homodimerization F 도메인의 기여 보여 줍니다.
M2H 분석 결과 3 개의 다른 플라스 미드 DNAs를 소개 하는 포유류 세포에 있는 단백질 단백질 상호 작용을 설명 하는 방법: GAL4 DNA 바인딩 도메인 (DBD) 퓨전 ERα LBD와 VP16AD 퓨전 ERα LBD, 표현 하는 두 단백질 식 플라스와 GAL4RE 융합 luciferase 식 기자 플라스 미드 GAL4DBD 퓨전 ERα LBD와 VP16AD 퓨전 ERα LBD의 상호 작용 (게는 이합체)는 세포에이 단백질 복잡 한에 GAL4RE 바인딩하고, 다음, VP16AD-종속 transactivation 기능을 통해 luciferase 유전자 발현을 활성화. LBD homodimerization의 수준 luciferase 활동에 의해 평가할 수 있습니다.
효 모 2 잡종 (Y2H) 분석 결과 호스트 환경으로 누 룩을 사용 하는 동일한 원리에 따라 대체 방법입니다. Y2H 시스템을 사용 하 여 이전 보고서 인간 ERα LBD F 도메인 잘립니다 F 도메인 E2 중재 전사4방지 결론 E2-종속 coactivator 모집 증가 설명 했다. 이 결과 포유류 세포5,6에 인간 ERα F 도메인 잘릴 감쇠 transcriptional 활동 증명 다른 보고서와 일치 하지 않습니다. 최근, M2H 시스템을 사용 하 여 우리의 연구는 인간 ERα LBD의 E2-종속 coactivator 모집 활동 F 도메인 잘림 포유류 세포에 의해 감소 하 고 전사 활동1와 일치 하는 설명 했다. 이러한 관측 단백질 단백질 상호 작용의 생리 적 역할 컨텍스트에 셀 형식별 방식으로 다른 것이 좋습니다. M2H 분석 transcriptional 활동을 결정 하는 데 사용 되는 동일한 세포 컨텍스트에서 단백질 단백질 상호 작용 활동을 설명할 수 있다. 이 Y2H 또는 다른 시험관에 단백질-단백질 상호 작용 분석에 비해 M2H 분석 결과의 이점을 제공 합니다.
선택적 에스트로겐 수용 체 (serm) (예, 4OHT) ERα 중재 전사 조절 하의 부분적인 주 작동 근 활동의 분자 메커니즘에 대 한 질문에 남아 있다. ERα LBD 기반 M2H 분석 다양 한 포유류 세포 유형에 SERMs의 부분적인 주 작동 근 활동의 메커니즘 연구에 적용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="891">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pG5-Luc</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E249A</td>
			<td style="width:360px;">Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pBIND</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E245A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pACT</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E246A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Rotor</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing Buckets</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Resuspension Solution (CRA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Lysis Solution (CLA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neutralization Solution (NSA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Column Wash Solution (CWB)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midipreps DNA Purification Resin</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midicolumns</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">51200038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BenchMark fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-119</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053028</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Passive Lysis 5X Buffer</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax L microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay

에스트로겐 수용 체 알파 (ERα)는 estrogenic ligand 의존 전사 레 귤 레이 터 이다. ERα 단백질의 순서는 높은 종 가운데 보존 됩니다. 그것은 인간의 기능 및 마우스 ERαs는 동일 생각 되었습니다. 우리는 쥐와 인간 ERα ligand 바인딩 도메인 (LBD) 이합체 화 활동 포유류 2-하이브리드 (M2H) 분석 결과 사용 하 여 차동 4-hydroxy-타 목 시 펜 (4OHT) 효과를 보여줍니다. M2H 분석 결과 LBD homodimerization 활동의 포유류 세포, 2 개의 단백질 식 플라스 미드 (GAL4 DNA 바인딩 도메인 [DBD] 퓨전 LBD와 VP16 transactivation 도메인 [VP16AD] 퓨전 LBD)의 transfection를 활용 하 여 효율을 보여줄 수와 GAL4 응답 요소 (GAL4RE) 융합 luciferase 기자 플라스 미드. 때 GAL4DBD 퓨전 LBD와 VP16AD 퓨전 LBD는 이합체 셀에, 복잡 한이 단백질이는 GAL4RE를 한다, 다음, VP16AD 종속 전사 활동을 통해 luciferase 유전자 발현을 활성화. 4OHT 중재 luciferase 활성화는 마우스 ERα LBD 퓨전 단백질 식 플라스 미드 보다 인간 ERα LBD 퓨전 단백질 식 플라스 미드 transfected 세포에서와 페 된 HepG2 세포에서 높다. 이 결과 4OHT 종속 마우스 ERα LBD homodimerization 활동의 효능은 인간의 ERα LBD 보다 나왔다. Agonistic ligands LBD 활동의 기저 수준 향상과 그 LBD 이합체 화 활동의 탐지를 방해 하기 때문에 일반적으로, M2H 분석 결과의 활용, 핵 수용 체 LBD 이합체 화 활동의 평가 위해 적합 하지 않습니다. 우리는 4OHT ERα LBD 기저 활동을 강화 하지 않습니다 발견. 그것은 결정 하 고 성공적으로 M2H 분석 결과 사용 하 여 4OHT 종속 LBD 이합체 화 활동 감지 수 있는 위한 핵심 요소 이다. ERα LBD 기반 M2H 분석 다양 한 포유류 세포 유형에 선택적 에스트로겐 수용 체 변조기 (예, 4OHT)의 부분적인 주 작동 근 활동 연구에 적용할 수 있습니다.

그림 3 조합 (i) 및 (ii) 플라스 미드 페 셀 조합에 가능한 응답의 구조를 표시합니다. 실험 결과 그림 4에 나와 있습니다. 조합 (i) (pG5 뤽 + pBIND mERαEF + 협정)의 활동 보여준다 자극 10 nM E2(그림 4),ERα LBD ligand 의존 transactivation 기능 도메인, AF-2을 포함 하기 때문에. 길 항 제 (예를 들어, E2)는...

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Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

우리는 4 hydroxy tamoxifen 종속 에스트로겐 수용 체 알파 ligand 바인딩 도메인 이합체 화 활동 포유류 2 하이브리드 분석 결과 사용 하 여 분석 하는 방법을 제시.

포유류 2 하이브리드 분석 결과 사용 하 여 에스트로겐 수용 체 알파의 Ligand 바인딩 도메인 이합체 화 활동을 감지

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

그래서이 방법은 에스트로겐 수용체 알파와 선택적 에스트로겐 수용체 변조기의 메커니즘을 조절하는 에스트로겐 리간드의 능력에 대한 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간단한 방법이라는 것입니다. 세포내 리간드 의존성 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인 이질 활성을 입증한다.절차를 시연하는 것은 태너 제퍼슨, 우리 그룹의 포스트 독 학생이 될 것입니다. 이 방법은 세포에서 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인 이산화 활성을 검출하기 위해 세 가지 상이한 플라스미드를 사용합니다. pG5-Luc는 이산화 활성의 효능을 검출하기 위한 루시파라제 기자 플라스미드이다.pBIND 마우스 에스트로겐 수용체 알파 EF는 pG5-Luc 리포터에 대한 GAL4 반응요소에 결합하는 주요 융합 마우스 에스트로겐 알파 리간드 결합 도메인 발현 플라스미드에 갈라토세 반응성 전사 인자 GAL4 DNA 결합이다. pACT 마우스 에스트로겐 수용체 알파 EF는 포진 심플렉스 바이러스 를 변형시키는 세그먼트 단백질 VP16 활성화 도메인 융합 마우스 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인 발현 플라스미드pG5-Luc 리포터에 직접 결합하지 않는다. 적절한 리간드가 존재할 때, pBIND 마우스 에스트로겐 수용체 알파 EF 및 pACT 마우스 에스트로겐 수용체 알파 EF 플라스미드에서 유래된 단백질은 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인을 통해 결합한다.이산화의 효율은 루시파아제 활성에 의해 결정된다. 가장 중요한 단계는 pBIND 마우스 에스트로겐 수용체 알파 EF 유래 단백질의 활성을 제어하는 것이다. pBIND 유래 에스트로겐 수용체 알파 리간드 의 활성은 pACT 에스트로겐 수용체 알파 EF 플라스미드없이 각 리간드에서 도메인을 결합하여 리간드 의존형 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인 이질 활성을 분석하기 전에 평가되어야 한다.먼저 적절한 플라스미드 조합을 조합당 1.5밀리터 마이크로센심분리기 튜브 2개에 추가합니다. DNA 혼합물의 두 가지 조합을 준비한다. 첫 번째 튜브에는 pG5-Luc, pBIND-에스트로겐 수용체 알파 EF 및 빈 pACT 플라스미드가 포함되어 있습니다.두 번째 튜브에는 pG5-Luc, pBIND-에스트로겐 수용체 알파 EF 및 pACT-에스트로겐 수용체-알파 EF 플라스미드가 포함되어 있습니다. DNA를 침전시키기 위하여는, 3개의 어금음 나트륨 아세테이트의 DNA 혼합물 부피의 1/9를 추가하고 각 관에 있는 DNA 혼합물에 100% 에탄올의 20X 3개의 어진 나트륨 아세테이트 부피를 추가하고 관을 소용돌이시다. 다음 아침 최대 속도로 원심분리하기 전에 밤새 20도의 혼합물을 보관하십시오.수퍼네이터를 버리고 튜브 당 75 %에탄올의 120 마이크로 리터에서 보이지 않는 펠릿을 다시 일시 중단하여 튜브 내부에 붙어있는 DNA를 헹구십시오. 동일한 조건에서 두 번째 원심 분리 후, 슈퍼 나티츠를 버리고 진공 농축기에서 DNA를 30 분 동안 건조시십시오. 트랜스펙트의 경우, 준비된 인간 간세포 암종 세포를 세척당 0.5 밀리리터의 실온 PBS로 두 번 세척하고 10% 숯제거 된 열 불활성 태아 소 소 럼과 2 개의 라밀라로 보충된 신선한 37도 의 0.5 밀리리터로 세포를 공급하십시오.다음으로, 개별 1.5 밀리리터 미세센심분리기 튜브에서 우물 수당 DMEM의 적절한 부피에서 건조 된 플라스미드 DNA 혼합물 및 형질 시약을 일시 중단합니다. 각 DMEM 중단 된 플라스미드 DNA 혼합물 튜브에 동일한 양의 형질 전환 시약 배지를 추가합니다. 실온에서 5-10분 동안 배양한 후, 세포 배양기 인큐베이터에서 6시간 간 배분하기 위해 24웰의 인간 간세포 암세포 세포 배양판의 적절한 실험용 웰에 DNA 혼합물 25마이크로리터를 첨가한다.그리고 인큐베이션의 끝은, 10%의 숯 제거 열활성화 FBS, 2밀리머 L-글루타민, 1%페니실린 연쇄상 구균, 그리고 리간드 퍼11시간 동안 세포를 16시간 동안 보충한 신선한 37도 페놀 무적무합한 MEM의 0.5 밀리리터로 트랜스페션 배지를 대체한다. 다음 날 아침, 우물당 PBS 1밀리리터로 세포를 씻고 각 웰의 세포를 잘 부착하고 100 마이크로리터당 수동 리시스 버퍼를 잘 부착하고 소용돌이 믹서로 활발한 흔들림을 합니다. 그런 다음 액체 질소에서 세포 용액을 동결합니다.이중 루시파라기 분석 의 날에, 접시가 실온에 도달 할 때까지 셰이커에 lysates를 흔들어, 96 잘 흰색 플라스틱 플레이트의 개별 우물에 용해의 10 마이크로 리터를 전송합니다. 그런 다음 마이크로 플레이트 판독기에서 각 셀 리세이트 샘플의 루시파아제 활성을 읽습니다. pBIND 마우스 에스트로겐 수용체 알파 EF 및 pACT 플라스미드의 치료는 10 나노몰러 estradiol을 가진 세포에 체형 세포를 자극하여 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인으로 루시파아제 활성을 자극하여 리간드 의존성 트랜스활성화 기능 도메인, AF-2를 포함한다.하나 및 10 나노 몰러 농도는, pBIND와 pACT 마우스 에스트로겐 수용체 알파 EF plasmids의 조합으로 전염된 세포에서 루시파라제 활성을 유도, 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인 이질 도메인 이질 활성을 평가하기 위한 이 절차의 타당성을 최대 1 나노몰어 치료에서 제시한다. 4-하이드록시-타목시펜을 가진 치료는 pBIND 마우스 에스트로겐 수용체 알파 EF 및 pACT 플라스미드 전세포에서 루시파라제 활성을 유도하지 않으며, 에스트로겐 수용체 알파의 AF-2 기능이 이 리간드에 의해 활성화되지 않음을 시사한다. 그러나 최대 10나노몰러 농도는 pBIND 및 pACT 마우스 에스트로겐 수용체 알파 EF 플라스미드의 조합으로 감염된 세포에서 루시파라제 활성을 유도하며, 이는 이 절차가 4-하이드록시-타목시펜 치료의 최대 10나노몰라에서 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인 이질 활성을 평가하는 것이 가능하다는 것을 시사한다.pBIND 및 pACT 마우스 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인 발현 플라스미드와 4-하이드록시-타목시펜의 조합으로부터의 활성은 pBIND 및 pACT 인간 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인 발현 플라스미드의 조합보다 현저히 높다. 이는 마우스 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인의 4-하이드록시-타목시펜 의존호모세이머화 활성이 인간 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인보다 더 강력하다는 것을 나타낸다. 또한, 인간 F 도메인을 함유한 마우스 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인의 4-하이드록시-타목시펜 의존호모세이머화 활성은 야생형 마우스 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인보다 현저히 낮다.대조적으로, 마우스 F 도메인을 함유하는 인간 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인의 4-하이드록시-타목시펜 의존호모이머화 활성은 인간 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인의 4-하이드록시-타목시펜-의존형 호모디머화 활성보다 현저히 높다. 이것은 F 도메인이 종 특정 4-하이드록시 타목시펜 의존에 의존하는 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인 호모이머화 활동에 영향을 미친다는 것을 시사한다. 이 절차를 시도하는 동안, GAL4 DNA 결합 도메인 융합 에스트로겐 수용체 알파 리간드 의 기저 활성을 리간드로 도메인 활성을 테스트하는 것이 중요합니다.이러한 활동은 차량 치료와 동일해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

체 외에 대사 시 토 크롬 P450s에 의해 니트로의 Nitrosamide 형성을 탐지 하기 위한 일반적인 방법

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

연구

암 연구학

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

셀 시트의 마이그레이션 분석 하 점 분석 결과 사용 하 여

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 돌연변이 Calreticulin Cytokine 종속 조 혈 모 세포에서의 종양 활동을 조사 하기 위해 편집

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

분석 결과 돋 아 회전 타원 체를 사용 하 여 상 상속 Hemangioblastoma Neovascularization의 생체 외에서 성능을 평가 하는 포괄적인 절차

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Li Fraumeni 증후군 환자에서 파생 된 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 다리를 모델링

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

표면 강화 된 공명 라만 뿌리는 Folate 수용 체를 통해 미세한 난소 암 검출을 위한 Nanoprobe Ratiometry 대상

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

입양 면역 요법을 위한 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 제조

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

아데노 관련 바이러스-Cas9 시스템을 사용하여 유전자 조작 된 뮤린 머리와 목 암 세포라인의 시험관 내 설립

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

전사 분석을 사용하여 무질서한 온코겐 전사 요인의 구조 기능 관계 매핑

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...