Name: detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Sueyoshi og Wang på National Institute of Environmental helse Sciences (NIEHS) for deres kritisk lesing av manuskriptet og Tanner Jefferson til å utføre prosedyrer på videoen. Dette arbeidet ble støttet av den nasjonale institutter for helse Grant 1ZIAES070065 (til K.S.K.) fra delingen av Intramural forskning av NIEHS.

1. utarbeidelse av plasmider for pattedyr to-hybrid analysen
<ol><li>Bruk følgende plasmider: pG5-Luc pBIND-ERαEF og pakt-ERαEF. Merk: Plasmider er tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel og sendes filter papir. pG5-Luc er reporter plasmider som inneholder fem ganger i GAL4 forståelsesfull elementer smeltet sammen med luciferase uttrykk enheten (figur 1A). pBIND-ERαEF er protein uttrykk plasmider for GAL4DBD-smeltet ERα LBD proteiner. pBIND-ERαEF inneholder...

<ol>
	<li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F+domain+of+estrogen+receptor+&#945;+is+involved+in+species-specific,+tamoxifen-mediated+transactivation.">The F domain of estrogen receptor &#945; is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li><li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor.">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li><li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+estrogen+receptor/coactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen.">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li><li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization.">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li><li>Montano, M. M., M&#252;ller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor:+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists.">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).</li><li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+&#945;+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions.">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor &#945; that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li><li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. , (2011).</li><li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+&#945;+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element.">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor &#945; Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li><li>Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists.">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).</li><li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries:+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta.">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li><li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+L543A,+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists,+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity.">Estrogen receptor &#945; L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li></ol>

Her, beskrev vi protokollen for M2H analysen, med fokus på analysen betingelsene for å oppdage homodimerization aktiviteten til ERα LBD som et eksempel. Generelt er M2H analysen ikke populær for vurdering av ligand-avhengige ERα LBD dimerization aktivitet. Dette skyldes ERα LBD har en transcriptional aktivering funksjon; aktiviteten som forstyrrer, i noen tilfeller resultatene av M2H analysen. Som vi viser her, kan imidlertid M2H analysen brukes for å analysere LBD dimerization aktiviteten visse stoffer som ikke a...

Østrogen reseptor alfa (ERα) er en estrogenic ligand-avhengige transkripsjon regulator. Aminosyren sequenceof ERα er svært bevart blant arter. På grunn av den høyere homologi mellom menneske og mus ERα funksjonen til disse reseptorene er tenkt som identiske og differensial aktiviteten til estrogenic stoffer (f.eks, tamoxifen) i disse arter er forårsaket av arten forskjeller i kjemisk metabolisms i stedet for de strukturelle forskjellene i ERα. ERα har svært bevart domene strukturer som er vanlig blant kjernefysiske reseptor (NR) gruppe, utpekt A til F domener. E-domenet eller ligand-bindende domene (LBD) inneholder ligand-bindende lommen og transcriptional aktiveringsforespørselen 2, kalt AF-2. F domenet er lokalisert umiddelbart tilstøtende E domenet og mest variabel domenet blant NRs. Selv mellom menneske og musa ERα, homologi F domenet er betydelig lavere enn i andre domener1. Det ligand binding LBD ERα forbedrer homodimerization av ERα protein binde det spesifikke østrogen-responsive DNA elementet direkte for å regulere ligand-avhengige genet transkripsjon (klassisk handling av ERα). Krystallografisk undersøkelser avdekket differensial plasseringen av Spiralen 12 (AF-2 kjernen domene) med østradiol (E2)- eller 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) - bundet LBD dimers2,3. ERα F domenet (45 aminosyrer) koble helix 12 direkte. Men er det ingen informasjon om effekten av denne utvidelsen av 45 aminosyrer (F domene) fra helix 12 om ERα LBD dimerization. I denne studien viser vi bidrag av F domenet artsspesifikke 4OHT-avhengige ERα LBD homodimerization med en pattedyr to-hybrid (M2H) analysen.
M2H analysen er en metode for å demonstrere protein-protein interaksjoner i pattedyrceller introdusere de tre forskjellige plasmider DNAs: to protein uttrykk plasmider, som uttrykker GAL4 DNA-bindende domene (DBD) fusion ERα LBD og VP16AD fusion ERα LBD, og GAL4RE-smeltet luciferase uttrykk reporter plasmider. Når GAL4DBD fusion ERα LBD og VP16AD fusion ERα LBD samhandler (gjør således en dimer) i cellene, dette proteinet binder seg til GAL4RE, og deretter aktiverer luciferase genuttrykk gjennom funksjonen VP16AD-avhengige transactivation. Nivået på LBD homodimerization kan evalueres av den luciferase aktiviteten.
Gjær to-hybrid (Y2H) analysen er en alternativ metode basert på samme prinsipp som bruker gjær som vertsmiljøet. Tidligere rapporter ved hjelp av Y2H systemet vist at F-domene-avkuttet menneskelig ERα LBD øker E2-avhengige coactivator rekruttering, konkluderte med at F domenet hindrer E2-mediert transkripsjon4. Dette resultatet er inkonsekvent med andre rapporter som har vist dempes transcriptional aktiviteten til F-domene-avkuttet menneskelige ERα i pattedyrceller5,6. Nylig vist vår studie, bruker M2H systemet, at E2-avhengige coactivator rekruttering aktiviteten til menneskelig ERα LBD er redusert med F domene trunkering i pattedyrceller og samsvarer med transkripsjon aktivitet1. Disse observasjonene foreslår at rollen fysiologiske protein-protein interaksjon er forskjellig i en celle type-spesifikk måte og sammenheng. M2H analysen kan vise protein-protein samhandling aktivitet i samme mobilnettet kontekst som brukes for å bestemme transcriptional aktiviteten. Dette gir en fordel til M2H analysen sammenlignet Y2H eller andre i vitro protein-protein samhandling-analyser.
Det gjenstår spørsmål om molekylære mekanismer for delvis Agonistiske aktiviteten til selektiv østrogen reseptor modulatorer (SERM) (f.eks, 4OHT) å regulere ERα-mediert transkripsjon. ERα LBD-baserte M2H analyser kan brukes for å studere mekanismen for delvis Agonistiske aktiviteten SERM i ulike pattedyr celletyper.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="891">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pG5-Luc</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E249A</td>
			<td style="width:360px;">Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pBIND</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E245A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pACT</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E246A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Rotor</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing Buckets</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Resuspension Solution (CRA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Lysis Solution (CLA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neutralization Solution (NSA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Column Wash Solution (CWB)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midipreps DNA Purification Resin</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midicolumns</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">51200038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BenchMark fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-119</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053028</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Passive Lysis 5X Buffer</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax L microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay

Østrogen reseptor alfa (ERα) er en estrogenic ligand-avhengige transkripsjon regulator. Sekvensen av ERα protein er svært bevart blant arter. Det har blitt antatt at funksjonen av menneskelige og mus ERαs er identiske. Vi demonstrere differensial 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) på mus og menneskelig ERα ligand-bindende domene (LBD) dimerization aktivitet ved hjelp av pattedyr to-hybrid (M2H) analysen. M2H analysen kan demonstrere effektiviteten av LBD homodimerization aktivitet i pattedyrceller, utnytte transfection av to protein uttrykk plasmider (GAL4 DNA-bindende domene [DBD] fusion LBD og VP16 transactivation [VP16AD]-domene fusjon LBD) og GAL4 svarer element (GAL4RE) smeltet luciferase reporter plasmider. Når GAL4DBD fusion LBD og den VP16AD fusion LBD gjør således en dimer i cellene, dette proteinet binder seg til GAL4RE og deretter aktiverer en luciferase genuttrykk gjennom VP16AD avhengige transkripsjon aktiviteten. 4OHT-mediert luciferase aktivisering er høyere i HepG2 cellene som var transfekterte med musen ERα LBD fusion protein uttrykk plasmider enn i de menneskelige ERα LBD fusion protein uttrykk plasmider transfekterte cellene. Dette resultatet antyder at effekten av 4OHT-avhengige musen ERα LBD homodimerization aktivitet er høyere enn menneskelig ERα LBD. Generelt, er utnyttelse av M2H analysen ikke ideelt for vurdering av kjernefysiske reseptoren LBD dimerization aktivitet, fordi agonistic ligander forbedrer basale nivået av LBD aktivitet, og som hindrer oppdagelsen av LBD dimerization aktivitet. Vi fant at 4OHT ikke styrkes ERα LBD basale aktiviteten. Det er en nøkkelfaktor for å bestemme og oppdage 4OHT-avhengige LBD dimerization aktivitet for å kunne bruke M2H analysen. ERα LBD-baserte M2H analyser kan brukes for å studere delvis Agonistiske aktiviteten til selektiv østrogen reseptor modulatorer (f.eks, 4OHT) i ulike pattedyr celletyper.

Figur 3 viser ordningen av mulige svar i kombinasjon (i) og kombinasjon (ii) plasmider-transfekterte celler. Eksperimentelle resultater er vist i Figur 4. Aktiviteten i kombinasjon (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pakten) viser stimulering av 10 nM E2 (Figur 4A), fordi det ERα LBD inneholder ligand-avhengige transactivation funksjonelle domenet, AF-2. Agonistiske (f.eksE2) so...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

Vi presenterer en metode for å analysere 4-hydroxy-tamoxifen-avhengige østrogen reseptor alfa ligand-bindende domene dimerization aktiviteten bruker pattedyr to-hybrid analysen.

Oppdage Ligand-bindende domene Dimerization aktiviteten til østrogen reseptor alfa bruker pattedyr to-Hybrid analysen

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

Så denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål om evnen til østrogen ligands å regulere østrogen reseptor alfa og mekanismene for selektiv østrogen reseptor modulatorer. Den største fordelen med denne teknikken er at det er en enkel metode. Det demonstrerer ligand-avhengige østrogen reseptor alfa ligand bindende domene dimerisering aktivitet i cellene.Å demonstrere prosedyren vil være Tanner Jefferson, en postdoktor fra gruppen vår. Denne metoden bruker tre forskjellige plasmider for å oppdage østrogenreseptoren ligand bindende domene dimerisering aktivitet i celler. pG5-Luc er luciferase reporter plasmid for å oppdage effekten av dimerisering aktivitet.pBIND mus østrogen reseptor alfa EF er en galaactose-responsive transkripsjon faktor GAL4 DNA binding til en hoved smeltet mus østrogen alfa ligand bindende domene uttrykk plasmid som binder seg til GAL4 responsive element på pG5-Luc reporter. pACT mus østrogen reseptor alfa EF er en herpes simplex virus transaktiverende segment protein VP16 aktivering domene smeltet mus østrogen reseptor alfa ligand bindende domene uttrykk plasmid som ikke binder direkte til pG5-Luc reporter. Når riktig ligand er til stede, proteiner avledet fra pBIND mus østrogen reseptor alfa EF og pACT mus østrogen reseptor alfa EF plasmids binde gjennom østrogen reseptor alfa ligand bindende domene.Effektiviteten av dimeriseringen bestemmes av luciferase-aktiviteten. Det viktigste trinnet er å kontrollere aktiviteten til pBIND mus østrogen reseptor alfa EF avledet protein. Aktiviteten til pBIND-avledet østrogen reseptor alfa ligand bind domene i hver ligand uten pACT østrogen reseptor alfa EF plasmid må evalueres før analysere ligand-avhengige østrogen reseptor ligand bindende domene dimerisering aktivitet.Begynn med å legge til de riktige plasmidkombinasjonene i to 1,5 milliliter mikrocentrifugerør per kombinasjon. Forbered de to kombinasjonene av DNA-blandingen. Første rør inneholder pG5-Luc, pBIND-østrogen reseptor-alfa EF, og tomme pACT plasmider.Andre rør inneholder pG5-Luc, pBIND-østrogen reseptor-alfa EF, og pACT-østrogen reseptor-alfa EF plasmider. For å utløse DNA, tilsett et 1/9 av DNA-blandingsvolumet på tre molarnatriumacetat og et 20X tre molarnatriumacetatvolum på 100% etanol til DNA-blandingen i hvert rør og virvle rørene. Oppbevar blandingene ved 20 grader Celsius over natten før sentrifugering med maksimal hastighet neste morgen.Kast supernativa og resuspend de usynlige pellets i 120 mikroliter på 75% etanol per rør, og ta vare på å skylle ned dna fast til innsiden av rørene. Etter en ny sentrifugering under samme forhold, kast supernativa og tørk DNA i en vakuumkonsentrator i 30 minutter. For transfection, vask de tilberedte humane hepatocellulære karsinomcellene to ganger med 0,5 milliliter romtemperatur PBS per brønn per vask og mate cellene med 0,5 milliliter friskt 37 grader Celsius fenol rødfri MEM supplert med 10% kull-strippet varme-inaktivert fostervin serum og to millimolar L-glutamin.Deretter suspenderer tørket plasmid DNA-blanding og transfection reagens i riktig volum av DMEM per antall brønner i individuelle 1,5-milliliter mikrocentrifuge rør. Tilsett et likt volum transfection reagens medium til hver DMEM-suspendert plasmid DNA blanding rør. Etter en fem til 10-minutters inkubasjon ved romtemperatur, tilsett 25 mikroliter DNA-blanding til de riktige eksperimentelle brønnene til den 24-brønns humane hepatocellulære karsinomcellekulturplaten for en seks timers transfeksjon i cellekulturinkubatoren.Og slutten av inkubasjonen, erstatt transfection medium med 0,5 milliliter frisk 37 grader Celsius fenol rødfri MEM supplert med 10% kull-strippet varme-inaktivert FBS, to millimolar L-glutamin, 1% penicillin streptomycin, og ligand per brønn og returnere cellene til cellekultur inkubatoren for en annen 16 til 18 timer. Neste morgen vasker du cellene med en milliliter PBS per brønn og fester cellene fra hver brønn med 100 mikroliter passiv lysisbuffer per brønn og kraftig risting med en vortex mikser. Deretter fryse cellen lysates i flytende nitrogen.På dagen for den doble luciferase analysen, rist lysates på en shaker til platen når romtemperatur, og overføre 10 mikroliter av lysat til individuelle brønner av en 96-brønn hvit plastplate. Les deretter luciferaseaktiviteten til hver cellelyatprøve på en mikroplateleser. Behandlingen av pBIND mus østrogen reseptor alfa EF og pACT plasmids trans infiserte celler med 10 nanomolar østradiol stimulerer luciferase aktivitet som østrogen reseptor alfa ligand binding domenet inneholder ligand-avhengig transaktivering funksjonell domene, AF-2.En og 10-nanomolar konsentrasjoner imidlertid indusere luciferase aktivitet i cellene transfected med kombinasjonen av pBIND og pACT mus østrogen reseptor alfa EF plasmids, noe som tyder på gjennomførbarheten av denne prosedyren for å evaluere østrogen reseptor alfa ligand bindende domene dimerisering aktivitet på opptil en nanomolar av østradiol behandling. Behandling med 4-hydroksy-tamoxifen fremkaller ikke luciferase aktivitet i pBIND mus østrogen reseptor alfa EF og pACT plasmid transfected celler, noe som tyder på at AF-2 funksjonen av østrogen reseptor alfa ikke er aktivert av denne ligand. Opptil 10 nanomolarkonsentrasjoner induserer imidlertid luciferase aktivitet i cellene transflettet med kombinasjonen av pBIND og pACT mus østrogen reseptor alfa EF plasmids, noe som tyder på at denne prosedyren er mulig for evaluering av østrogen reseptor alfa ligand bindende domene dimerisering aktivitet på opptil 10 nanomolar av 4-hydroxy-tamoxifen behandling.Aktiviteten fra kombinasjonen av pBIND og pACT mus østrogen reseptor alfa ligand bindende domene uttrykk plasmids med 4-hydroxy-tamoxifen er betydelig høyere enn kombinasjonen av pBIND og pACT menneskelig østrogen reseptor alfa ligand bindende domene uttrykk plasmids. Dette indikerer at den 4-hydroxy-tamoxifen-avhengige homodimeriseringsaktiviteten til musen østrogenreseptor alfa ligand binding domenet er mer potent enn den menneskelige østrogen reseptor alfa ligand bindende domene. Videre er den 4-hydroxy-tamoxifen-avhengige homodimeriseringsaktiviteten til musen østrogenreseptor alfa ligand bindingdomene som inneholder et menneskelig F-domene betydelig lavere enn for den ville typen mus østrogen reseptor alfa ligand binding domene.I motsetning er den 4-hydroxy-tamoxifen-avhengige homodimeriseringsaktiviteten til det menneskelige østrogenreseptoren alfa ligand bindingsdomenet som inneholder et mus F-domene betydelig høyere enn for den ville typen menneskelig østrogenreseptor alfa ligand bindingdomene. Dette tyder på at F-domenet har innflytelse på artsspesifikk 4-hydroksy-tamoxifen-avhengig østrogenreseptor alfa ligand bindende domene homodimerisering aktivitet. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å teste basalaktiviteten til GAL4 DNA bindende domene smeltet østrogen reseptor alfa ligand binde domeneaktivitet med ligand.Den aktiviteten bør være den samme som kjøretøybehandling.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

En generell metode for påvisning av Nitrosamide formasjon i In Vitro metabolismen av nitrosaminer av Cytochrome P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Evaluering av cellen invasjonen og overføringsprosessen: en sammenligning av Video mikroskop-baserte Scratch sår analysen og Boyden kammeret analysen

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Bruke Dot analysen å analysere migrering av cellen ark

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Bruker CRISPR/Cas9 Gene redigering for å undersøke kreftfremkallende aktiviteten av muterte Calreticulin i cytokin avhengige blodkreft cellene

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

En omfattende prosedyre å evaluere In Vitro ytelsen til den antatte Hemangioblastoma Neovascularization bruker Spheroid spirende analysen

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modellering Osteosarcoma bruker Li-Fraumeni syndrom pasient-avledede Induced Pluripotent stamceller

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

Overflaten forbedret resonans Raman spredning Nanoprobe Ratiometry for å oppdage mikroskopiske eggstokkreft via folat reseptor målretting

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Fremstilling chimeric antigen reseptor (CAR) T celler for adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

Opprettelse av en genetisk konstruert murine hode-og nakke kreftcelle linje ved bruk av et Adeno-tilknyttet virus Cas9 system

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Kartlegging av strukturfunksjonsrelasjoner av uordnede onkogene transkripsjonsfaktorer ved hjelp av transkripsjonsanalyse

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...