Name: detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

Os autores agradecer Sueyoshi DRS e Wang no nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental (NIEHS) por sua leitura crítica do manuscrito e Tanner Jefferson para realizar procedimentos no vídeo. Este trabalho foi apoiado pela 1ZIAES070065 de institutos nacionais de saúde Grant (para K.S.K) da divisão de pesquisa Intramural do NIEHS.

1. preparação de plasmídeos para o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido
<ol><li>Use os seguintes plasmídeos: pG5-Luc, pBIND-ERαEF e ERαEF-pacto. Nota: Os plasmídeos estão disponíveis mediante solicitação, em autores e são enviados em papel de filtro. pG5-Luc é o plasmídeo do repórter que contém cinco repetições de GAL4 elementos responsivos fundiram-se com a unidade de expressão do luciferase (Figura 1A). pBIND-ERαEF é o plasmídeo de expressão d...

<ol>
	<li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F+domain+of+estrogen+receptor+&#945;+is+involved+in+species-specific,+tamoxifen-mediated+transactivation.">The F domain of estrogen receptor &#945; is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li><li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor.">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li><li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+estrogen+receptor/coactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen.">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li><li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization.">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li><li>Montano, M. M., M&#252;ller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor:+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists.">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).</li><li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+&#945;+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions.">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor &#945; that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li><li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. , (2011).</li><li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+&#945;+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element.">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor &#945; Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li><li>Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists.">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).</li><li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries:+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta.">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li><li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+L543A,+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists,+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity.">Estrogen receptor &#945; L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li></ol>

Aqui, descrevemos o protocolo para o ensaio de M2H, incidindo sobre as condições de ensaio para a detecção da atividade de homodimerization de ERα LBD como um exemplo. Em geral, o ensaio M2H não é popular para a avaliação da atividade de dimerização ERα LBD ligand-dependente. Isto é devido a ERα LBD possuindo uma função de ativação transcricional; perturba a atividade dos quais, em alguns casos, os resultados do ensaio M2H. No entanto, como demonstramos aqui, o ensaio M2H pode ser usado para analisar a ...

Alfa do receptor de estrógeno (ERα) é um regulador de estrogênicos transcrição dependente de ligante. A sequência de aminoácidos ERα é altamente conservada entre as espécies. Por causa da maior homologia entre humanos e mouse ERα, a função destes receptores é pensada como idêntico, e a atividade diferencial de substâncias estrogênicas (por exemplo, tamoxifeno) dessas espécies é causada por diferenças da espécie em metabolismos químicos em vez das diferenças estruturais de ERα. ERα tem altamente conservadas estruturas de domínio que são comuns entre a superfamília do receptor nuclear (NR), designada aos domínios de F. E domínio ou domínio ligand-ligando (LBD) inclui o bolso de vinculação de ligante e a função de ativação transcricional 2, chamado de AF-2. O domínio de F é localizado imediatamente adjacente ao domínio E e é o domínio mais variável entre as NRs. Mesmo entre humanos e mouse ERα, a homologia do domínio de F é significativamente menor do que a outros domínios1. O limite a ligante LBD de ERα aumenta a homodimerization da proteína ERα para vincular o elemento específico de DNA hormona-responsivo diretamente para regular a transcrição do gene do ligante-dependentes (ação clássica de ERα). Cristalográficos estudos revelaram o diferencial de posicionamento da hélice 12 (domínio do núcleo do AF-2) com estradiol (E2) - ou 4-hidroxi-tamoxifeno (4OHT) - limite LBD dímeros2,3. O domínio ERα F (45 aminoácidos) conectar diretamente a hélice 12. No entanto, não há nenhuma informação sobre o efeito desta extensão de 45 aminoácidos (domínio de F) da hélice 12 sobre a dimerização ERα LBD. Neste estudo, demonstramos a contribuição do domínio de F para a espécie 4OHT-dependente ERα LBD homodimerization usando um mamífero dois-híbrido (M2H) ensaio.
O ensaio de M2H é um método para demonstrar as interações da proteína-proteína em células de mamíferos introduzindo os DNAs plasmideo diferentes três: dois plasmídeos de expressão de proteínas, que expressam a fusão de domínio (DBD) GAL4 DNA-ligando ERα LBD e VP16AD fusão ERα LBD, e um Plasmídeo do repórter do luciferase fundido GAL4RE expressão. Quando a fusão GAL4DBD ERα LBD e a fusão de VP16AD ERα LBD interagem (fazer um dímero) nas células, este complexo proteico vincula o GAL4RE e, em seguida, ativa a expressão do gene do luciferase através da função de transactivation VP16AD-dependente. O nível de homodimerization LBD pode ser avaliado pela atividade do luciferase.
O ensaio da dois-híbrido de levedura (Y2H) é um método alternativo baseado no mesmo princípio que usa fermento como o ambiente de host. Usando o sistema de Y2H de relatórios anteriores demonstraram que F-domínio-truncada humana ERα LBD aumenta o recrutamento de coactivator E2-dependente, concluindo que o domínio de F impede a transcrição mediada por E24. Esse resultado é incompatível com outros relatórios que demonstraram a atividade transcricional atenuada do F-domínio-truncada ERα humana no pilhas mamíferas5,6. Recentemente, nosso estudo, utilizando o sistema M2H, demonstrou que a atividade de recrutamento coactivator E2 dependentes de humanos ERα LBD é diminuída por truncamento de domínio F em células de mamíferos e é consistente com a atividade de transcrição1. Estas observações sugerem que o papel fisiológico da interação da proteína-proteína difere em uma maneira de tipo específico de célula e contexto. O ensaio M2H pode demonstrar a atividade de interação da proteína-proteína no mesmo contexto celular que é usado para determinar a atividade transcricional. Isso fornece uma vantagem do ensaio M2H comparado com o Y2H ou outras análises de interação em vitro da proteína-proteína.
Continua a haver perguntas sobre os mecanismos moleculares da atividade agonista parcial de moduladores de receptor seletivo de estrogênio (SERMs) (por exemplo, 4OHT) para regular a transcrição mediada por ERα. Ensaios de M2H ERα LBD-based podem ser aplicados para estudar o mecanismo da atividade agonista parcial de SERMs em vários tipos de células de mamíferos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="891">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pG5-Luc</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E249A</td>
			<td style="width:360px;">Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pBIND</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E245A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pACT</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E246A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Rotor</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing Buckets</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Resuspension Solution (CRA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Lysis Solution (CLA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neutralization Solution (NSA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Column Wash Solution (CWB)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midipreps DNA Purification Resin</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midicolumns</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">51200038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BenchMark fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-119</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053028</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Passive Lysis 5X Buffer</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax L microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay

Alfa do receptor de estrógeno (ERα) é um regulador de estrogênicos transcrição dependente de ligante. A sequência da proteína ERα é altamente conservada entre as espécies. Acredita-se que a função de humanos e mouse ERαs é idêntico. Vamos demonstrar o efeito diferencial 4-hidroxi-tamoxifeno (4OHT) no mouse e ERα ligação ligante domínio (LBD) dimerização atividade humana usando o mamíferas dois-híbrido (M2H) ensaio. O ensaio de M2H pode demonstrar a eficiência da atividade homodimerization LBD em células de mamíferos, utilizando o transfection de plasmídeos de expressão duas proteínas (GAL4 DNA-ligando domínio [DBD] fusão LBD e VP16 transactivation domínio [VP16AD] fusão LBD) e um O elemento GAL4-responsivos (GAL4RE) fundido plasmídeo do repórter do luciferase. Quando a fusão GAL4DBD LBD e a fusão de VP16AD LBD fazem um dímero nas células, este complexo proteico vincula o GAL4RE e, em seguida, ativa uma expressão de gene do luciferase através da atividade de transcrição dependente de VP16AD. A ativação do luciferase mediada por 4OHT é maior nas células HepG2 que foram transfectadas com plasmídeos de expressão de proteínas de fusão da LBD ERα o rato do que em ERα LBD fusão proteína expressão plasmídeo transfectada células humanas. Este resultado sugere que a eficácia do mouse 4OHT-dependente da atividade de homodimerization ERα LBD é superior a humana ERα LBD. Em geral, a utilização do ensaio M2H não é ideal para a avaliação da actividade de dimerização do receptor nuclear LBD, porque ligantes agonísticos melhorar o nível basal da atividade LBD e que impede a detecção de atividade de dimerização LBD. Encontramos que essa 4OHT não aumentar a atividade basal ERα LBD. Isso é um fator chave para ser capaz de determinar e detectar a atividade de dimerização LBD 4OHT-dependente para com êxito usando o ensaio de M2H. Ensaios de M2H ERα LBD-based podem ser aplicados para estudar a atividade agonista parcial de moduladores de receptor de estrogênio seletivo (por exemplo, 4OHT) em vários tipos de células de mamíferos.

Figura 3 exibe o esquema de respostas possíveis na combinação (i) e células de combinação (ii) do plasmídeo-transfectadas. Os resultados experimentais são mostrados na Figura 4. A atividade de combinação (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pacto) mostra a estimulação por 10 nM E2(Figura 4),porque o ERα LBD contém o domínio funcional dependente de ligante transactivation, AF...

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Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

Apresentamos um método para analisar a 4-hidroxi-tamoxifeno-dependente de estrogênio receptor alfa ligand domínio dimerização actividade de ligação usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido.

Detectando a actividade de dimerização de domínio ligante-ligação do Receptor de estrogênio alfa usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

Assim, este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a capacidade dos ligantes estrogênicos de regular o receptor de estrogênio alfa e os mecanismos dos moduladores seletivos do receptor de estrogênio. A principal vantagem dessa técnica é que é um método simples. Demonstra o receptor de estrogênio dependente do ligagênio alfa, atividade de dimerização de domínio nas células.Demonstrando o procedimento será Tanner Jefferson, um estudante de pós-doutorado do nosso grupo. Este método usa três plasmídeos diferentes para detectar a atividade de dimerização de domínio de ligação do receptor de estrogênio nas células. pG5-Luc é o repórter de luciferase plasmid para detectar a eficácia da atividade de dimerização.pBIND mouse estrogen receptor alpha EF é um fator de transcrição galactose-responsivo fator de transcrição GAL4 DNA vinculando-se a um principal mouse fundido estrogen alfa ligante expressão de domínio de ligação plasmid que se liga ao elemento responsivo GAL4 no repórter pG5-Luc. pACT mouse estrogen receptor alpha EF é um vírus herpes simplex transativando proteína segmento VP16 ativação domínio fundido mouse estrogen receptor alfa ligante e expressão de domínio de ligação plasmid que não se liga diretamente ao repórter pG5-Luc. Quando o ligante adequado está presente, as proteínas derivadas do receptor de estrogênio do rato pBIND alfa EF e do receptor de estrogênio do rato pACT alfa EF plasmids se ligam através do domínio de ligação de ligas de ligação alfa do receptor de estrogênio.A eficiência da dimerização é determinada pela atividade da luciferase. O passo mais importante é controlar a atividade do receptor de estrogênio alfa EF do rato pBIND. A atividade do receptor de estrogênio derivado do pBIND, o domínio alfa ligante alfa em cada ligante sem o receptor de estrogênio pACT alfa EF plasmid deve ser avaliado antes de analisar a atividade de dimerização do domínio de ligação do receptor de estrogênio dependente do ligante dependente do ligante.Comece adicionando as combinações plasmidas apropriadas em dois tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro por combinação. Prepare as duas combinações da mistura de DNA. O primeiro tubo contém o pG5-Luc, o receptor pBIND-estrogen-alfa EF, e os plasmídeos pACT vazios.O segundo tubo contém o pG5-Luc, o receptor pBIND-estrogen-alfa EF, e os plasmídeos EF do receptor pACT-estrogen. Para precipitar o DNA, adicione 1/9 do volume de mistura de DNA de três acetatos de sódio molar e um volume de acetato de sódio molar de 20X de 100% etanol à mistura de DNA em cada tubo e vórtice dos tubos. Armazene as misturas a 20 graus Celsius durante a noite antes de centrifugar em velocidade máxima na manhã seguinte.Descarte os supernantes e resuspenque as pelotas invisíveis em 120 microliters de 75% de etanol por tubo, tomando o cuidado de enxaguar qualquer DNA preso ao interior dos tubos. Após uma segunda centrifugação sob as mesmas condições, descarte os sobrenantes e seque o DNA em um concentrador de vácuo por 30 minutos. Para a transfecção, lave as células hepatocelulares hepatocelulares preparadas duas vezes com 0,5 mililitros de PBS de temperatura ambiente por poço por lavagem e alimente as células com 0,5 mililitros de MEM fresco de 37 graus Celsius sem fenol, complementado com soro bovino fetal inativado de 10% de carvão e dois milimolar de L-glutamina.Em seguida, suspenda a mistura de DNA plasmídeo seco e reagente de transfecção no volume apropriado de DMEM por número de poços em tubos individuais de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione um volume igual de médio reagente de transfecção a cada tubo de mistura de DNA plasmídeo suspenso pelo DMEM. Após uma incubação de cinco a dez minutos à temperatura ambiente, adicione 25 microliters de mistura de DNA aos poços experimentais apropriados da placa de cultura celular hepatocelular de 24 poços humanos para uma transfecção de seis horas na incubadora de cultura celular.E o fim da incubação, substitua o meio de transfecção por 0,5 mililitros de MEM fresco de 37 graus Celsius sem fenol, complementado por FBS inativado por 10%carvão, dois milimolas L-glutamina, 1%de estreptomicina de penicilina e ligadura por poço e retornar as células à incubadora de cultura celular por mais 16 a 18 horas. Na manhã seguinte, lave as células com um mililitro de PBS por poço e conecte as células de cada poço com 100 microliters de tampão de lise passiva por poço e agitação vigorosa com um misturador de vórtice. Em seguida, congele as células lísatos em nitrogênio líquido.No dia do ensaio de dupla luciferase, agite os lises em um shaker até que a placa atinja a temperatura ambiente, e transfira 10 microliters de lise para poços individuais de uma placa de plástico branca de 96 poços. Em seguida, leia a atividade luciferase de cada amostra de lisato celular em um leitor de microplacão. O tratamento do receptor de estrogênio pBIND alfa EF e pACT plasmids células transfectadas com 10 nanomolares estradiol estimula a atividade da luciferase, pois o domínio de ligação de ligantes alfa do receptor de estrogênio contém o domínio funcional de transativação dependente de ligante, AF-2.No entanto, 1 e 10 concentrações de nanomolar, induzem a atividade da luciferase nas células transfeinadas com a combinação de plasmídeos alfa EF do receptor de estrogen pBIND e pACT, sugerindo a viabilidade deste procedimento para avaliar a atividade de dimerização do domínio do receptor de estrogênio e de estrogen em até um nanomolar de tratamento estradiol. O tratamento com 4-hidroxifeno-tamoxifeno não provoca atividade luciferase no receptor de estrogênio do camundongo pBIND alfa EF e células transfetóides plasmidas pACT, sugerindo que a função AF-2 do receptor de estrogênio alfa não é ativada por este ligante. No entanto, até 10 concentrações de nanomolar, induz a atividade da luciferase nas células transfeinadas com a combinação de plasmídeos alfa EF do receptor de estrógeno pBIND e pACT, sugerindo que este procedimento é viável para avaliar a atividade de dimerização do domínio do receptor de estrogênio e estrógeno em até 10 nanomolar de tratamento 4-hidroxi-tamoxifen.A atividade da combinação de pBIND e pACT mouse estrogen receptor alfa ligante expressão de domínio de ligação plasmídeos com 4-hidroxi-tamoxifen é significativamente maior do que a combinação de pBIND e pACT receptor humano de ligantes alfa ligante de expressão de domínio de ligação plasmídeos. Isso indica que a atividade de homodimerização dependente de 4-hidroxifen do domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio do rato é mais potente do que o domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio humano. Além disso, a atividade de homodimerização dependente de 4-hidroxifen-tamoxifen do domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio do rato contendo um domínio F humano é significativamente menor do que a do domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio do tipo selvagem.Em contraste, a atividade de homodimerização dependente de 4-hidroxifen-tamoxifen do domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio humano contendo um domínio F do mouse é significativamente maior do que a do tipo selvagem do receptor de estrogênio humano domínio de ligação alfa. Isso sugere que o domínio F tem uma influência na atividade de homodimerização do receptor alfa de 4-hidroxifen-tamoxifen dependente da espécie. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de testar a atividade basal do domínio de ligação de DNA GAL4 fundiu o receptor de estrogênio alfa ligante alfa com o seu ligante.Essa atividade deve ser a mesma que o tratamento do veículo.

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The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Usando o ensaio de ponto para analisar a migração de células de folhas

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Usando CRISPR/Cas9 Gene edição para investigar a atividade oncogênica do mutante Calreticulin em células hematopoiéticas dependentes de Cytokine

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Um procedimento abrangente para avaliar o desempenho In Vitro da neovascularização de Hemangioblastoma putativo usando o Spheroid brotando do ensaio

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modelagem de osteossarcoma usando síndrome de Li-Fraumeni paciente-derivado induzido Pluripotent Stem Cells

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

Ressonância de superfície melhorada Raman dispersão nano-sonda Ratiometry para detecção de câncer de ovário microscópico através do Receptor de folato como alvo

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) para imunoterapia adotiva

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In Vitro Estabelecimento de uma linha de células de câncer de urina de urina geneticamente modificada usando um sistema adeno associado de vírus-cas9

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Mapeando as Relações Estrutura-Função de Fatores de Transcrição Oncogênica Desordenados usando análise transcriômica

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...