Name: detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

Авторы благодарят Drs. отдела и Ван на Национальный институт окружающей среды медицинских наук (NIEHS) за их критического чтения рукописи и Таннер Джефферсон для выполнения процедуры на видео. Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения грант 1ZIAES070065 (для K.S.K.) из отдела интрамуральных исследования NIEHS.

1. Подготовка плазмид млекопитающих Assay 2 гибрида
<ol><li>Используйте следующие плазмидов: pG5-люк, pBIND-ERαEF и Пакт ERαEF. Примечание: Плазмиды доступны от авторов по запросу и отправляются на фильтровальной бумаге. pG5-Люк является репортером плазмида, содержащий пять повторяет GAL4 реагировать ?...

<ol>
	<li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F+domain+of+estrogen+receptor+&#945;+is+involved+in+species-specific,+tamoxifen-mediated+transactivation.">The F domain of estrogen receptor &#945; is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li><li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor.">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li><li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+estrogen+receptor/coactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen.">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li><li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization.">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li><li>Montano, M. M., M&#252;ller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor:+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists.">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).</li><li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+&#945;+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions.">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor &#945; that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li><li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. , (2011).</li><li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+&#945;+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element.">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor &#945; Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li><li>Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists.">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).</li><li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries:+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta.">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li><li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+L543A,+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists,+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity.">Estrogen receptor &#945; L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li></ol>

Здесь мы описали протокол M2H assay, сосредоточив внимание на условиях анализа для обнаружения homodimerization деятельность ERα LBD качестве примера. В общем м2ч пробирного не популярен для оценки лиганд зависимой ERα LBD димеризации активности. Это объясняется ERα LBD, обладающие transcriptional активации фун?...

Эстрогеновых рецепторов альфа (ERα) является регулятором эстрогенных лиганд зависимых транскрипции. Амино кислоты sequenceof ERα высоко сохраняется среди видов. Из-за более высоких гомологии между человека и мыши ERα, функция этих рецепторов мыслится как идентичные и дифференциального активность эстрогенных веществ (например, тамоксифен) в этих видов вызвана Межвидовые различия в химические метаболизмом, а не структурных различий ERα. ERα хорошо сохранились доменных структур, которые являются общими среди ядерных рецепторов (NR) надсемейства, поручено A F доменов. E домена или лиганд связывающий домен (ОДД) включает в себя лиганд привязки карман и transcriptional активации функции 2, названный AF-2. F домен локализован непосредственно примыкает к области E и является наиболее переменной домен среди НСП. Даже между человека и мыши ERα, гомологии F домена значительно ниже, чем у других доменов1. Лиганд прыгните LBD ERα повышает homodimerization белка ERα, чтобы связать определенный элемент эстроген отзывчивым ДНК непосредственно для регулирования транскрипции гена лиганд зависимые (классическое действие ERα). Кристаллографическая исследования показали дифференциального позиционирования спираль 12 (AF-2 основной домен) с эстрадиола (Е2) - или 4-гидрокси тамоксифен (4OHT) - привязанное LBD димеров2,3. Домен ERα F (45 аминокислоты) Подключите спираль 12 непосредственно. Однако нет никакой информации относительно последствий этого расширения 45 аминокислот (F домен) от спирали 12 на ERα LBD димеризации. В этом исследовании мы продемонстрировать вклад F домена для вегетационных ERα LBD homodimerization 4OHT-зависимых, используя млекопитающих пробирного (м2ч) 2 гибрида.
Assay м2ч способ продемонстрировать белок белковых взаимодействий в mammalian клетках, представляя три различных плазмида ДНК: два белка выражение плазмиды, которые выражают GAL4 ДНК-связывающих доменов (DBD) фьюжн ERα LBD и VP16AD fusion ERα LBD, и GAL4RE-кварцевое Люцифераза выражение репортер плазмиды. Когда GAL4DBD fusion ERα LBD и VP16AD синтеза ERα LBD взаимодействуют (сделать димер) в клетках, этот комплекс белков привязывается к GAL4RE и, затем, активирует Люцифераза экспрессии генов через функцию transactivation VP16AD-зависимых. Уровень LBD homodimerization могут быть оценены Люцифераза деятельности.
Assay (Y2H) 2 гибрида дрождей-альтернативный метод, основанный на тот же принцип, который использует дрожжей в качестве хост-среды. Предыдущие доклады, с использованием системы Y2H продемонстрировал, что F-домен усечение человека ERα LBD увеличивает E2-зависимой coactivator набора, заключение, что домен F предотвращает E2-опосредованной транскрипции4. Этот результат является несовместимым с другими докладами, которые продемонстрировали аттенуированные транскрипционный анализ деятельности F-домен усечение человека ERα в mammalian клеток5,6. Недавно наше исследование, с использованием системы M2H, показали, что активность набора E2-зависимой coactivator человека ERα LBD уменьшается на F домена усечения в mammalian клетках и согласуется с транскрипции деятельность1. Эти наблюдения предполагают, что Физиологическая роль взаимодействия протеин протеина отличается в манере определенного типа клеток и контекст. М2ч assay может продемонстрировать деятельность взаимодействия протеин протеина в том же контексте сотовой, который используется для определения транскрипционный анализ активности. Это обеспечивает преимущество пробирного M2H, по сравнению с Y2H или других в vitro анализ взаимодействия протеин протеина.
Остаются вопросы относительно молекулярные механизмы активность частичный агонист модуляторы рецептора селективного эстрогена (SERM) (например, 4OHT) для регулирования ERα-опосредованной транскрипции. На основе ERα LBD м2ч анализов могут быть применены для изучения механизм частичного агониста деятельности SERM в различных типах клеток млекопитающих.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="891">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pG5-Luc</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E249A</td>
			<td style="width:360px;">Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pBIND</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E245A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pACT</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E246A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Rotor</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing Buckets</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Resuspension Solution (CRA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Lysis Solution (CLA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neutralization Solution (NSA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Column Wash Solution (CWB)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midipreps DNA Purification Resin</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midicolumns</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">51200038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BenchMark fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-119</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053028</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Passive Lysis 5X Buffer</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax L microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay

Эстрогеновых рецепторов альфа (ERα) является регулятором эстрогенных лиганд зависимых транскрипции. Среди видов высоко сохраняется последовательность ERα белка. Считалось, что функция человека и мыши ERαs идентичны. Мы продемонстрировать эффект дифференциальной 4-гидрокси тамоксифен (4OHT) на мышь и человека ERα лиганд привязки (ОДД) димеризации доменами с помощью млекопитающих assay (м2ч) 2 гибрида. М2ч assay может продемонстрировать эффективность деятельности LBD homodimerization в клетках млекопитающих, используя трансфекции двух плазмид выражение протеина (GAL4 ДНК-связывающих домена [DBD] Сплавливание LBD и VP16 transactivation домена [VP16AD] Сплавливание LBD) и GAL4-отзывчивым элемент (GAL4RE) снаряжен Люцифераза репортер плазмиды. Когда GAL4DBD fusion LBD и VP16AD фьюжн LBD димер в клетках, этот комплекс белков связывается с GAL4RE и, затем, активирует экспрессии генов Люцифераза через деятельность зависимых транскрипции VP16AD. Активация 4OHT-опосредованной Люцифераза выше в HepG2 клетки, которые были transfected с мыши ERα LBD синтеза белка выражение плазмид чем ERα LBD синтеза белка выражение плазмида transfected клеток человека. Этот результат свидетельствует о том, что эффективность 4OHT-зависимых мыши ERα LBD homodimerization активность выше, чем человеческий ERα LBD. В общем использование м2ч assay не подходит для оценки деятельности димеризации LBD ядерных рецепторов, потому что агонистических лигандов повысить базальный уровень активности LBD и что затрудняет обнаружение LBD димеризации активности. Мы обнаружили, что 4OHT не повысить ERα LBD базальную активность. Что является ключевым фактором для того определить и обнаружить 4OHT-зависимых LBD димеризации деятельность для успешно используя assay м2ч. На основе ERα LBD м2ч анализов могут применяться для изучения деятельности частичный агонист селективного эстроген модуляторов рецепторов (например, 4OHT) в различных типах клеток млекопитающих.

Рисунок 3 показывает схема возможных ответов в сочетании (i) и (ii) плазмида transfected клеток комбинации. Экспериментальные результаты показаны на рисунке 4. Деятельность комбинации (i) (pG5-Люк + pBIND-mERαEF пакт) показывает стимуляции на 10 Нм E2 (<strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

Мы представляем метод для анализа 4-гидрокси тамоксифен зависимой эстроген рецептор альфа-лиганд привязки димеризации доменами с помощью млекопитающих assay 2 гибрида.

Определение активности димеризации лиганд привязки домена Альфа рецептор эстрогена, используя Assay млекопитающих 2 гибрида

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

Таким образом, этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о способности эстрогенных лигандов регулировать альфа-рецептор эстрогена и механизмы селективных модуляторов рецепторов эстрогена. Основным преимуществом этой техники является то, что это простой метод. Он демонстрирует лиганд-зависимых рецепторов эстрогена альфа лиганд связывания домена димеризации деятельности в клетках.Демонстрация процедуры будет Таннер Джефферсон, аспирант из нашей группы. Этот метод использует три различных плазмиды для обнаружения эстрогена рецептора лиганд связывания домена димеризации деятельности в клетках. pG5-Luc является плазмидой люциферазы для определения эффективности активности димеризации.pBIND мыши эстроген рецептор альфа EF является галактозы реагировать транскрипции фактор GAL4 ДНК связывания с основным сплавленных мыши эстроген альфа лиганд связывания домена выражение плазмида, которая связывается с GAL4 отзывчивый элемент на pG5-Luc репортер. pACT мыши эстроген рецептор альфа EF является вирусом простого герпеса, трансактивирующий сегмент белка VP16 активации домена сплавленных мыши эстроген рецептор альфа лиганд связывания домена выражение плазмида, которая не связывается непосредственно с pG5-Luc репортер. При надлежащем лиганд присутствует, белки, полученные из PBIND мыши эстроген рецептор альфа EF и pACT мыши эстроген рецептор альфа ЭФ плазмиды связывают через рецептор эстрогена альфа лиганд связывания домена.Эффективность димеризации определяется активностью люциферазы. Наиболее важным шагом является контроль активности pBIND мыши эстроген рецептор альфа EF производный белок. Активность pBIND-производных рецепторов эстрогена альфа лиганд связывают домена в каждом лиганде без рецептора pACT эстрогена альфа-плазмида EF должны быть оценены, прежде чем анализировать лиганд-зависимых рецепторов эстрогена лиганд связывания домена димеризации деятельности.Начните с добавления соответствующих плазмидных комбинаций в две 1,5-миллилитровые микроцентрифуги на комбинацию. Подготовь две комбинации смеси ДНК. Первая трубка содержит pG5-Luc, рецептор pBIND-эстроген-альфа EF, и пустые плазмиды pACT.Вторая трубка содержит pG5-Luc, рецептор pBIND-эстроген-альфа EF, и pACT-эстрогенный рецептор-альфа-плазмиды EF. Чтобы вызвать ДНК, добавьте 1/9 объема смеси ДНК из трех ацетатов натрия моляра и 20X три молярного ацетата натрия объем 100% этанола в смеси ДНК в каждой трубке и вихрь труб. Храните смеси при 20 градусах по Цельсию на ночь перед центрифугой на максимальной скорости на следующее утро.Отбросьте supernatants и resuspend незримые гранулы в 120 microliters 75% этанола в пробку, заботясь для того чтобы промыть вниз с любой дна вставленной к внутренностям пробок. После второй центрифугации при тех же условиях, отбросить супернатанты и высушить ДНК в вакуумном концентраторе в течение 30 минут. Для трансфекции, мыть подготовленные человеческие гепатоцеллюлярные клетки карциномы два раза с 0,5 миллилитров комнатной температуры PBS на колодец за стирку и кормить клетки с 0,5 миллилитров свежих 37 градусов по Цельсию фенол красный свободный MEM дополнен 10% древесного угля полосатый тепло-инактивированных плода сыворотки крупного рогатого скота и два миллимолара L-glutamine.Далее приостанавливаем высушенную плазмидную смесь ДНК и трансфектический реагент в соответствующем объеме ДМЭМ на количество скважин в отдельных 1,5-миллилитровых микроцентрифуговых трубках. Добавьте равный объем трансфектионные реагенты к каждой DMEM-приостановленной плазмидной трубки смеси ДНК. После пяти-10-минутной инкубации при комнатной температуре добавьте 25 микролитров смеси ДНК в соответствующие экспериментальные скважины 24-хорошо человека гепатоцеллюлярной карциномы клеточной культуры пластины для шестичасовой трансфекции в инкубаторе клеточной культуры.И в конце инкубации, заменить трансфекции среды с 0,5 миллилитров свежих 37 градусов по Цельсию фенол красный свободный MEM дополнен 10% древесного угля полосатый тепло-инактивированных FBS, два миллимолара L-глутамин, 1%пенициллин стрептомицин, и лиганд на колодец и вернуть клетки в инкубатор клеточной культуры еще на 16 до 18 часов. На следующее утро, мыть клетки с одним миллилитров PBS на колодец и прикрепить клетки из каждого хорошо с 100 микролитров пассивного буфера лиза на колодец и энергичные встряхивания с вихрем смесителя. Затем заморозить клетку лизатов в жидком азоте.В день двойного анализа люциферазы встряхните лизаты на шейкере до тех пор, пока пластина не достигнет комнатной температуры, и перенесите 10 микролитров лизата в отдельные колодцы 96-ну белой пластиковой пластины. Затем прочитайте активность люциферазы каждой клетки облеантинировать образец на микроплее считыватель. Лечение pBIND мыши эстроген рецептор альфа EF и pACT плазмиды трансфицированных клеток с 10 наномолярных эстрадиола стимулирует активность люциферазы, как эстроген рецептор альфа лиганд связывания домена содержит лиганд-зависимых трансактивации функционального домена, AF-2.Один и 10-наномоляных концентраций однако, вызывают активность люциферазы в клетках, трансфицированных с сочетанием pBIND и pACT мыши эстроген рецептор альфа-плазмиды EF, предлагая осуществимость этой процедуры для оценки эстрогена рецептор альфа лиганд связывания домена димеризации деятельности до одного наномолярного лечения эстрадиола. Лечение 4-гидрокси-тамоксифен не вызывает активности люциферазы в pBIND мыши эстроген рецептор альфа EF и PACT плазмидных трансфицированных клеток, предполагая, что функция AF-2 рецептора эстрогена альфа не активируется этим лигандом. До 10 концентраций наномолярных однако, индуцирует активность люциферазы в клетках, трансфицированных с сочетанием pBIND и pACT мыши эстроген рецептор альфа ЭФ плазмидов, предполагая, что эта процедура осуществима для оценки эстрогена рецептор альфа лиганд связывания домена димеризации деятельности до 10 наномолярных 4-гидроксифен лечения.Активность от сочетания pBIND и pACT мыши эстроген рецептор альфа лиганд связывания домена выражение плазмидов с 4-гидрокси-тамоксифен значительно выше, чем сочетание pBIND и pACT человеческого рецептора эстрогена альфа-лиганд связывания домена выражения плазмидов. Это указывает на то, что 4-гидрокси-тамоксифен-зависимых гомодимеризации деятельности мыши эстроген рецептор альфа лиганд связывания домена является более мощным, чем человеческий рецептор эстрогена альфа лиганд связывания домена. Кроме того, 4-гидрокси-тамоксифен-зависимых гомодимеризации деятельности мыши эстроген рецептор альфа лиганд связывания домена, содержащего человека F домен значительно ниже, чем у дикого типа мыши эстроген рецептор альфа лиганд связывания домена.В отличие от этого, 4-гидрокси-тамоксифен-зависимых гомодимеризации деятельности человека эстроген рецептор альфа лиганд связывания домена, содержащего мышь F домен значительно выше, чем у дикого типа человеческого рецептора эстрогена альфа лиганд связывания домена. Это говорит о том, что домен F оказывает влияние на вид-специфических 4-гидрокси-тамоксифен-зависимых рецепторов эстрогена альфа лиганд связывания домена гомодимеризации деятельности. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы проверить базальную активность GAL4 ДНК связывания домена сплавленных рецепторов эстрогена альфа лиганд связывают доменной активности с лигандом.Эта деятельность должна быть такой же, как лечение транспортных средств.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

Генеральный метод для обнаружения Nitrosamide формирование в метаболизм в Vitro нитрозамины, цитохром P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Оценка вторжения клеток и процесс миграции: сравнение видео на базе микроскопа нуля раны пробирного и пробирной палаты Бойдена

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Использование Dot пробирного анализа миграции клеток листов

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

С помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена, редактирования для изучения онкогенных активность мутантов Calreticulin в зависимых Cytokine гемопоэтических клеток

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Всеобъемлющей процедуры для оценки производительности в Vitro предполагаемый Гемангиобластома неоваскуляризация, используя сфероида прорастания Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Моделирование остеосаркома, используя синдром ли Фраумени, которую пациент производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

Поверхность расширение резонанс комбинационного рассеяния Nanoprobe Ratiometry для обнаружения микроскопического рака яичников через рецептор фолиевой кислоты ориентации

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Производство химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток для приемной иммунотерапии

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

В vitro Создание генетически инженерии Murine головы и шеи рак овой линии с использованием Адено-ассоциированных Вирус-Cas9 системы

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Отображение структурно-функциональных отношений неупорядоченных онкогенных факторов транскрипции с использованием транскриптомного анализа

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...