Name: detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00
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Los autores agradecen a los Drs. Sueyoshi y Wang en el nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (NIEHS) para su lectura crítica del manuscrito y Jefferson de Tanner para realizar procedimientos en el video. Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud beca 1ZIAES070065 (a K.S.K.) de la división de investigación intramuros de la NIEHS.

1. preparación de plásmidos para el ensayo de híbridos de dos mamífero
<ol><li>Utilice el siguiente plásmidos: pG5-Luc, pBIND-ERαEF y ERαEF Pacto. Nota: La plásmidos son de los autores a petición y se envían en papel de filtro. pG5-Luc es el plásmido reportero que contiene cinco repeticiones de GAL4 sensibles elementos fusionados con la unidad de expresión de luciferasa (figura 1A). pBIND-ERαEF es el plásmido de expresión de proteína las proteínas fusio...

<ol>
	<li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F+domain+of+estrogen+receptor+&#945;+is+involved+in+species-specific,+tamoxifen-mediated+transactivation.">The F domain of estrogen receptor &#945; is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li><li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor.">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li><li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+estrogen+receptor/coactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen.">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li><li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization.">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li><li>Montano, M. M., M&#252;ller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor:+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists.">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).</li><li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+&#945;+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions.">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor &#945; that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li><li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. , (2011).</li><li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+&#945;+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element.">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor &#945; Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li><li>Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists.">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).</li><li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries:+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta.">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li><li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+L543A,+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists,+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity.">Estrogen receptor &#945; L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li></ol>

Adjunto, describimos el protocolo para el ensayo de M2H, centrándose en las condiciones de ensayo para la detección de la actividad de T329N de ERα LBD como ejemplo. En general, el ensayo M2H no es popular para la evaluación de la actividad de dimerización ligand-dependiente ERα LBD. Esto es debido a la LBD ERα poseen una función de activación transcripcional; la actividad que molesta, en algunos casos, los resultados del ensayo M2H. Sin embargo, como se demuestra aquí, el ensayo M2H puede ser usado para el an?...

Receptor de estrógenos alfa (ERα) es un regulador de transcripción ligando-dependiente estrogénica. El aminoácido sequenceof ERα es altamente conservada entre especies. Debido a la mayor homología entre humanos y ratón ERα, la función de estos receptores es considerada como idéntico, y la actividad diferencial de sustancias estrogénicas (p. ej., tamoxifeno) en las especies es causada por las diferencias de las especies de metabolismos químicos en lugar de por las diferencias estructurales de ERα. ERα altamente ha conservado las estructuras de dominio que son comunes entre la superfamilia de receptores nucleares (NR), señalada A que dominios de F. El dominio E o dominio de unión a ligando (LBD) incluye el bolsillo del atascamiento del ligand y la función de activación transcripcional 2, llamado AF-2. El dominio de F se localiza inmediatamente adyacente al dominio E y es el dominio más variable entre lo NRs. Incluso entre humanos y ratón ERα, la homología del dominio de F es menor que el de los otros dominios1. El LBD ligando enlazado de ERα mejora T329N de la proteína ERα para enlazar el elemento específico de la DNA estrógeno-sensibles directamente para la regulación de la transcripción de genes dependientes de ligando (acción clásica de ERα). Estudios Cristalográficos han revelado el posicionamiento diferencial de la hélice 12 (dominio de base de AF-2) con estradiol (E2) o 4-hidroxi-tamoxifeno (4OHT) - límite LBD dímeros2,3. El dominio de F ERα (45 aminoácidos) Conecte hélice 12 directamente. Sin embargo, no hay información sobre el efecto de esta extensión de 45 aminoácidos (dominio de F) de la hélice 12 en la dimerización de ERα LBD. En este estudio, se demuestra la contribución del dominio de F para lo específicos dependientes de la 4OHT LBD ERα T329N usando un mamífero dos hybrid (M2H) análisis.
El ensayo de M2H es un método para demostrar las interacciones de la proteína-proteína en células de mamíferos introducción los DNAs de distintos plásmidos tres: dos plásmidos de expresión de la proteína, que expresan la fusión de dominio (DBD) de ADN de GAL4 LBD de ERα y VP16AD fusión ERα LBD, y un Plásmido de reportero de luciferasa fusionados con GAL4RE expresión. Cuando la fusión de GAL4DBD LBD ERα y la fusión de VP16AD LBD ERα interactuan (hacer un dimer) en las células, este complejo de la proteína se une a la GAL4RE y, luego, activa la expresión de genes de la luciferasa a través de la función de transactivación dependiente de la VP16AD. El nivel de LBD T329N puede evaluarse por la actividad de luciferasa.
La levadura dos híbridos (Y2H) es un método alternativo basado en el mismo principio que utiliza la levadura como el entorno de host. Informes anteriores mediante el sistema de Y2H demostraron que F-dominio-truncado humano ERα LBD aumenta reclutamiento de E2 dependiente del coactivator, concluyendo que el dominio de F previene la transcripción mediada por E24. Este resultado es coherente con otros informes que han demostrado la actividad transcripcional atenuada de ERα humano F-dominio-truncado en células de mamíferos5,6. Recientemente, nuestro estudio, utilizando el sistema M2H, demostró que la actividad de contratación del coactivator de E2 dependiente de humano ERα LBD disminuye por truncamiento del dominio de F en células de mamífero y es consistente con transcripción actividad1. Estas observaciones sugieren que el papel fisiológico de la interacción proteína-proteína es diferente en un contexto y forma de tipo específico de célula. El ensayo de M2H puede demostrar actividad de interacción de proteínas en el mismo contexto celular que se utiliza para la determinación de la actividad transcripcional. Esto proporciona una ventaja del ensayo M2H comparado con el Y2H u otros análisis de interacción en vitro proteínas.
Quedan preguntas con respecto a los mecanismos moleculares de la actividad de agonista parcial de moduladores de receptores de estrógeno selectivo (SERM) (e.g., 4OHT) para regular la transcripción mediada por el ERα. M2H ensayos de ERα LBD pueden ser aplicados para estudiar el mecanismo de la actividad de agonista parcial de los SERM en varios tipos de células de mamífero.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="891">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pG5-Luc</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E249A</td>
			<td style="width:360px;">Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pBIND</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E245A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pACT</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E246A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Rotor</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing Buckets</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Resuspension Solution (CRA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Lysis Solution (CLA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neutralization Solution (NSA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Column Wash Solution (CWB)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midipreps DNA Purification Resin</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midicolumns</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">51200038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BenchMark fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-119</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053028</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Passive Lysis 5X Buffer</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax L microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay

Receptor de estrógenos alfa (ERα) es un regulador de transcripción ligando-dependiente estrogénica. La secuencia de la proteína ERα es altamente conservada entre especies. Se ha pensado que la función del ser humano y el ratón ERαs es idéntico. Demostramos el efecto diferencial 4-hidroxi-tamoxifeno (4OHT) en ratón y ERα ligand-atar dominio (LBD) dimerización actividad humana usando el análisis de (M2H) híbrido de dos mamífero. El ensayo de M2H puede demostrar la eficacia de la actividad de T329N LBD en células de mamíferos, mediante la transfección de plásmidos de expresión de dos proteínas (ADN GAL4 dominio [DBD] fusión LBD y VP16 transactivation dominio [VP16AD] fusión LBD) y un Elemento GAL4-sensible (GAL4RE) fusionados con el plásmido reportero de luciferasa. Cuando la fusión de GAL4DBD LBD y la fusión de VP16AD DLB un dimer en las células, este complejo de la proteína se une a la GAL4RE y, luego, activa una expresión de gen de luciferasa a través de la actividad de transcripción dependiente de VP16AD. La activación mediada por 4OHT luciferase es mayor en las células HepG2 fueron transfectadas con el ratón ERα LBD fusión proteína expresión plásmidos que el ERα LBD fusión proteína expresión plásmido transfectada las células humanas. Este resultado sugiere que la eficacia del ratón 4OHT-dependiente de la actividad de T329N ERα LBD es superior a la humana ERα LBD. En general, la utilización del ensayo M2H no es ideal para la evaluación de la actividad de dimerización de receptores nucleares LBD, porque ligandos agonistas realzar el nivel basal de la actividad LBD e impide la detección de actividad de dimerización de LBD. Se encontró que 4OHT no mejorar la actividad basal de ERα LBD. Es un factor clave para poder determinar y detectar la actividad de dimerización de LBD dependiente de la 4OHT para usar con éxito el ensayo de M2H. M2H ensayos de ERα LBD pueden aplicarse para estudiar la actividad de agonista parcial de moduladores selectivos de estrógeno receptor (e.g., 4OHT) en varios tipos de células de mamífero.

Figura 3 muestra el esquema de posibles respuestas en la combinación (i) y combinación (ii) plásmido transfected células. Los resultados experimentales se muestran en la figura 4. La actividad de combinación (i) (pG5-Luc + pBIND mERαEF Pacto) muestra estímulo de 10 nM E2 (figura 4A), porque el ERα LBD contiene el dominio funcional del transactivation dependiente de ligando, A...

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Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

Se presenta un método para el análisis de la 4-hidroxi-tamoxifeno-dependiente de estrógeno actividad del receptor alfa-ligando dominio dimerización usando el ensayo de híbridos de dos mamífero.

Detectar la actividad de dimerización de dominio Ligand-obligatorio del Receptor de estrógenos alfa usando el análisis de dos híbridos mamífero

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

Así que este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la capacidad de los ligandos estrogénicos para regular el receptor de estrógeno alfa y los mecanismos de moduladores selectivos del receptor de estrógeno. La principal ventaja de esta técnica es que es un método simple. Demuestra la actividad de dimerización de dominio alfa ligando dependiente del ligando dependiente del ligando en las células.Demostrando el procedimiento estará Tanner Jefferson, un estudiante postdoctorado de nuestro grupo. Este método utiliza tres plásmidos diferentes para detectar la actividad de dimerización de dominio de unión de ligando del receptor de estrógeno en las células. pG5-Luc es el plásmido reportero de luciferasa para detectar la eficacia de la actividad de dimerización.pBIND receptor de estrógeno ratón alfa EF es un factor de transcripción sensible a la gactosa GAL4 ADN a un plásmido de dominio alfa ligando de ratón principal fusionado que se une al elemento sensible GAL4 en el reportero pG5-Luc. pACT ratón receptor de estrógeno alfa EF es un segmento transactivante de virus de herpes simple proteína VP16 dominio de activación fusionado ratón receptor de estrógeno alfa ligando medio plásmido de expresión de dominio que no se une directamente al reportero pG5-Luc. Cuando el ligando adecuado está presente, las proteínas derivadas del receptor de estrógeno del ratón pBIND alfa EF y pACT ratón receptor de estrógeno alfa EF plásmidos se unen a través del dominio de unión de ligando alfa del receptor de estrógeno.La eficiencia de la dimerización está determinada por la actividad luciferasa. El paso más importante es controlar la actividad de la proteína derivada del receptor de estrógeno del ratón pBIND alpha EF. La actividad del dominio de unión alfa del receptor de estrógeno derivado de pBIND en cada ligando sin el plásmido alfa EF del receptor de estrógeno pACT debe evaluarse antes de analizar la actividad de dimerización de dominio de unión de ligando de estrógeno dependiente del ligando del ligando de ligando dependiente del ligando del ligando.Comience añadiendo las combinaciones de plásmido apropiadas en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros por combinación. Preparar las dos combinaciones de la mezcla de ADN. El primer tubo contiene el pG5-Luc, el receptor-alfa del pBIND-estrógeno-alfa EF, y los plásmidos pACT vacíos.El segundo tubo contiene los plásmidos pG5-Luc, pBIND-estrógeno receptor-alfa EF, y pACT-estrógeno receptor-alfa EF. Para precipitar el ADN, añadir un 1/9 del volumen de la mezcla de ADN de tres molares de acetato de sodio y un volumen de acetato de sodio 20X tres molares de 100% etanol a la mezcla de ADN en cada tubo y vórtice de los tubos. Almacene las mezclas a 20 grados centígrados durante la noche antes de centrifugar a máxima velocidad a la mañana siguiente.Desechar los sobrenadantes y resuspender los pellets invisibles en 120 microlitros de 75% etanol por tubo, teniendo cuidado de enjuagar cualquier ADN pegado a las entrañas de los tubos. Después de una segunda centrifugación en las mismas condiciones, deseche los sobrenadantes y seque el ADN en un concentrador de vacío durante 30 minutos. Para la transfección, lave dos veces las células de carcinoma hepatocelular humano preparadas con 0,5 mililitros de PBS a temperatura ambiente por pozo y alimente las células con 0,5 mililitros de MEM fresco de 37 grados Celsius fenol y rojo complementado con un 10% de suero bovino fetal termoactivado con 10% de carbón y dos milivolares de L-glutamina.A continuación, suspenda la mezcla de ADN plásmido seco y el reactivo de transfección en el volumen adecuado de DMEM por número de pozos en tubos de microcentrífuga individuales de 1,5 mililitros. Añadir un volumen igual de medio de reactivo de transfección a cada tubo de mezcla de ADN plásmido suspendido por DMEM. Después de una incubación de cinco a 10 minutos a temperatura ambiente, agregue 25 microlitros de mezcla de ADN a los pozos experimentales apropiados de la placa de cultivo de células de carcinoma hepatocelular humano de 24 pocillos para una transfección de seis horas en la incubadora de cultivo celular.Y al final de la incubación, reemplace el medio de transfecación con 0,5 mililitros de meM fresco libre de fenol fenol de 37 grados Centígrados libres de rojo complementado con 10%DE FBS inactivado por calor, dos milivola de L-glutamina, 1%estreptomicina de penicilina, y ligando por pozo y devolver las células a la incubadora de cultivo celular durante otras 16 a 18 horas. A la mañana siguiente, lave las células con un mililitro de PBS por pozo y conecte las células de cada pozo con 100 microlitros de tampón de lysis pasiva por pozo y agitación vigorosa con un mezclador de vórtice. A continuación, congele los lysates celulares en nitrógeno líquido.En el día del ensayo de luciferasa doble, agitar los licatos en una coctelera hasta que la placa alcance la temperatura ambiente, y transferir 10 microlitros de liso a pozos individuales de una placa de plástico blanco de 96 pozos. Luego lea la actividad luciferasa de cada muestra de lisosato celular en un lector de microplacas. El tratamiento del receptor de estrógeno de ratón pBIND alfa EF y plásmidos pACT células trans infectadas con 10 estradiol nanomolar estimula la actividad de la luciferasa ya que el dominio de unión alfa ligando del receptor de estrógeno contiene el dominio funcional de transactivación dependiente del ligando, AF-2.Sin embargo, una y 10 concentraciones nanomolares inducen la actividad de la luciferasa en las células transfectadas con la combinación de pBIND y pACT receptor de estrógeno alfa PLásmidos EF, lo que sugiere la viabilidad de este procedimiento para evaluar la actividad de dimerización de dominio de unión al ligando alfa del receptor de estrógeno en hasta un nanomolar de tratamiento con estradiol. El tratamiento con 4-hidroxi-tamoxifeno no provoca actividad de luciferasa en el receptor de estrógeno de ratón pBIND alfa EF y pACT plásmido células trans infectadas, lo que sugiere que la función AF-2 del receptor de estrógeno alfa no está activada por este ligando. Hasta 10 concentraciones nanomolares sin embargo, induce la actividad de la luciferasa en las células transfectadas con la combinación de pBIND y pACT receptor de estrógeno alfa PLásmidos EF, lo que sugiere que este procedimiento es factible para evaluar la actividad de dimerización de dominio de unión al ligando alfa del receptor de estrógeno en hasta 10 nanomolares de tratamiento de 4-hidroxi-tamoxifeno.La actividad de la combinación de pBIND y pACT receptor de estrógeno ratón alfa ligando dominio de unión plásmidos de expresión de dominio con 4-hidroxi-tamoxifeno es significativamente mayor que la combinación de pBIND y pACT receptor de estrógeno humano alfa ligando plásmidos de expresión de dominio. Esto indica que la actividad de homodimerización dependiente de 4-hidroxi-tamoxifeno del dominio de unión alfa ligando del receptor de estrógeno del ratón es más potente que el dominio de unión del ligando alfa del receptor de estrógeno humano. Además, la actividad de homodimerización dependiente de 4-hidroxi-tamoxifeno del dominio de unión alfa ligando del receptor de estrógeno del ratón que contiene un dominio F humano es significativamente menor que el del dominio de unión alfa ligando del receptor de estrógeno de ratón salvaje.Por el contrario, la actividad homodimerización dependiente de 4-hidroxi-tamoxifeno del dominio de unión alfa ligando del receptor de estrógeno humano que contiene un dominio F del ratón es significativamente mayor que el del dominio de unión alfa ligando del receptor de estrógeno humano de tipo salvaje. Esto sugiere que el dominio F tiene una influencia en la actividad de homodimerización de dominio de unión de 4-hidroxi-tamoxifeno dependiente de la especie. Al intentar este procedimiento, es importante recordar probar la actividad basal del dominio de unión de ADN GAL4 fusionado con el ligando alfa ligando actividad de dominio con su ligando.Esa actividad debe ser la misma que el tratamiento del vehículo.

Research

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Investigación sobre el cáncer

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Evaluación de la invasión celular y el proceso de migración: una comparación de Video cero basado en el microscopio de la herida el análisis y el análisis de la cámara de Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Usando el análisis de punto para analizar la migración de células de hojas

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Utilizando CRISPR/Cas9 Gene edición para investigar la actividad oncogénica del mutante calreticulina en dependiente de citoquinas de células hematopoyéticas

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Un procedimiento integral para evaluar el rendimiento In Vitro de la neovascularización de Hemangioblastoma putativo con el esferoide brotación ensayo

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modelado de Osteosarcoma usando las células de vástago de Pluripotent inducido derivados del paciente el síndrome de Li-Fraumeni

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

Superficie-realzado resonancia Raman dispersión Nanoprobe Ratiometry para la detección de cáncer ovárico microscópico a través del Receptor del folato dirigidos a

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Fabricación de células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) para inmunoterapia adoptiva

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In Vitro Establecimiento de una línea celular de cáncer de cabeza y cuello de murine genéticamente diseñada utilizando un sistema de virus Cas9 asociado con Adeno

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Mapeo de las relaciones estructura-función de los factores de transcripción oncogénicos desordenados utilizando el análisis transcriptómico

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...