Name: detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

Författarna tackar Drs. Sueyoshi och Wang på nationella Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) för deras kritisk läsning av manuskript och Tanner Jefferson för att utföra procedurer på videon. Detta arbete stöds av de nationella institut för hälsa Grant 1ZIAES070065 (till K.S.K.) från NIEHS Division av intramurala forskning.

1. beredning av plasmider för däggdjur två-hybrid-analysen
<ol><li>Använda de följande plasmidsna: pG5-Luc, pBIND-ERαEF och pakten-ERαEF. Obs: Plasmidsna är tillgängliga från författarna på begäran och skickas på filterpapper. pG5-Luc är reporter plasmiden som innehåller fem repetitioner av GAL4 responsive element smält med luciferas uttryck enheten (figur 1A). pBIND-ERαEF är protein uttryck plasmiden för GAL4DBD-smält ERα LBD proteiner. pBIND-ERα...

<ol>
	<li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F+domain+of+estrogen+receptor+&#945;+is+involved+in+species-specific,+tamoxifen-mediated+transactivation.">The F domain of estrogen receptor &#945; is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li><li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor.">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li><li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+estrogen+receptor/coactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen.">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li><li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization.">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li><li>Montano, M. M., M&#252;ller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor:+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists.">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).</li><li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+&#945;+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions.">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor &#945; that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li><li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. , (2011).</li><li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+&#945;+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element.">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor &#945; Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li><li>Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists.">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).</li><li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries:+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta.">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li><li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+L543A,+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists,+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity.">Estrogen receptor &#945; L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li></ol>

Häri, beskrev vi protokollet för M2H analysen, med fokus på analys villkoren för att upptäcka homodimerization aktiviteten av ERα LBD som ett exempel. M2H analysen är i allmänhet inte populär för bedömning av ligandberoende ERα LBD dimerization aktivitet. Detta beror på den ERα LBD besitter en transkriptionell aktiveringen funktion; vars verksamhet stör, i vissa fall resultaten av M2H analysen. Men, som vi visar här, M2H analysen kan användas för att analysera LBD dimerization aktiviteten av vissa ämne...

Östrogen receptor alfa (ERα) är en östrogena ligandberoende transkription regulator. Den amino syran sequenceof ERα är mycket bevarad bland arter. På grund av den högre homologi mellan människa och mus ERα, funktionen av dessa receptorer är tänkt som identiska och differentiell aktiviteten av östrogena substanser (t.ex.tamoxifen) hos dessa arter orsakas av artens skillnader i kemiska ämnesomsättning snarare än av de strukturella skillnaderna i ERα. ERα har starkt konservativa domän strukturer som är vanliga bland nukleär receptor (NR) överfamiljen, designerat A till F domäner. Den E domänen eller ligand-bindande domän (LBD) inkluderar ligand-bindande fickan och transkriptionell aktiveringen funktion 2, heter AF-2. Domänen F är lokaliserad direkt anslutning till E-domänen och är mest variabla domänen bland NRs. Även mellan mänskliga och mus ERα, homologi mellan domänen F är betydligt lägre än för andra domäner1. Den ligand-bundna LBD av ERα förbättrar homodimerization av proteinet ERα att binda det specifika östrogenkänsliga DNA elementet direkt för att reglera den ligandberoende gentranskription (klassisk åtgärd av ERα). Kristallografiska studier har avslöjat den differentiella positionering av helix 12 (AF-2 core-domän) med estradiol (E2)- eller 4-hydroxi-tamoxifen (4OHT) - bundna LBD dimerer2,3. Domänen ERα F (45 aminosyror) ansluta helix 12 direkt. Dock finns det ingen information om effekten av denna utvidgning av 45 aminosyror (F domän) från spiralen 12 på den ERα LBD dimerization. I denna studie visar vi bidrag F domänen till den artspecifika 4OHT-beroende ERα LBD homodimerization med ett däggdjur två-hybrid (M2H) analys.
M2H analysen är en metod att påvisa protein-protein interaktioner i däggdjursceller införa de tre olika kontrollplasmid-DNA: två protein uttryck plasmider, som uttrycker GAL4 DNA-bindande domänen (DBD) fusion ERα LBD och VP16AD fusion ERα LBD, och en GAL4RE-smält luciferas uttryck reporter plasmid. När GAL4DBD fusion ERα LBD och VP16AD fusion ERα LBD interagera (göra en dimer) i cellerna, detta proteinkomplex binder till GAL4RE och, sedan, aktiverar luciferas genuttryck genom funktionen VP16AD-beroende transkription. Nivån på LBD homodimerization kan utvärderas av aktiviteten luciferas.
Den jäst två-hybrid (Y2H)-analysen är en alternativ metod baserat på samma princip som använder jäst som värdmiljön. Tidigare rapporter med hjälp av Y2H systemet visade att F-domän-stympad människa ERα LBD ökar E2-beroende coactivator rekrytering, sluta att F domänen förhindrar E2-medierad transkription4. Detta resultat är oförenligt med andra rapporter som visat försvagat transkriptionell aktiviteten av F-domän-trunkeras mänskliga ERα i däggdjursceller5,6. Nyligen visat vår studie, använda M2H, att aktiviteten E2-beroende coactivator rekrytering av mänskliga ERα LBD är minskade F domän trunkering i däggdjursceller och överensstämmer med transkription aktivitet1. Dessa observationer tyder på att den fysiologiska rollen protein-protein interaktioner skiljer sig i en cell typspecifika sätt och sammanhang. M2H analysen kan påvisa protein-protein interaktioner aktivitet i samma cellulära sammanhang som används för att bestämma aktiviteten transkriptionell. Detta ger en fördel M2H analysens jämfört med Y2H eller annan in vitro- protein-protein interaktioner analyser.
Det finns fortfarande frågor rörande de molekylära mekanismerna för aktiviteten partiell agonist av selektiva östrogenreceptormodulatorer (SERMs) (t.ex., 4OHT) att reglera ERα-medierad transkription. ERα LBD-baserade M2H analyser kan användas för att studera mekanismen för partiell agonist aktiviteten av SERMs i olika proteintillverkningen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="891">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pG5-Luc</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E249A</td>
			<td style="width:360px;">Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pBIND</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E245A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pACT</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E246A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Rotor</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing Buckets</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Resuspension Solution (CRA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Lysis Solution (CLA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neutralization Solution (NSA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Column Wash Solution (CWB)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midipreps DNA Purification Resin</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midicolumns</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">51200038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BenchMark fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-119</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053028</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Passive Lysis 5X Buffer</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax L microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay

Östrogen receptor alfa (ERα) är en östrogena ligandberoende transkription regulator. Sekvensen av ERα protein är starkt bevarad bland arter. Det har varit tänkt att fungera av mänskliga och mus ERαs är identiska. Vi visar differentiell 4-hydroxi-tamoxifen (4OHT) på mus och mänsklig ERα ligand-bindande domänen (LBD) dimerization verksamhet med däggdjur två-hybrid (M2H) analys. M2H analysen kan påvisa effektiviteten hos LBD homodimerization aktivitet i däggdjursceller, utnyttja transfection av två protein uttryck plasmider (GAL4 DNA-bindande domänen [DBD] fusion LBD och VP16 transkription domänen [VP16AD] fusion LBD) och en GAL4-responsive element (GAL4RE) smält luciferas reporter plasmid. När GAL4DBD fusion LBD och VP16AD fusion LBD gör en dimer i cellerna, detta proteinkomplex binder till GAL4RE och sedan aktiverar ett luciferas genuttryck genom aktiviteten VP16AD beroende transkription. 4OHT-medierad luciferas aktiveringen är högre i HepG2 celler som var transfekterade med musen ERα LBD fusion protein uttryck plasmidsna än i de mänskliga ERα LBD fusion protein uttryck plasmid transfekterade cellerna. Detta resultat tyder på att effekten av 4OHT-beroende musen ERα LBD homodimerization aktivitet är högre än mänsklig ERα LBD. Utnyttjandet av M2H analysen är i allmänhet inte idealisk för utvärdering av nukleär receptor LBD dimerization aktivitet, eftersom agonistiska ligander öka den basala nivån för aktiviteten LBD och som försvårar upptäckten av LBD dimerization aktivitet. Vi hittade att 4OHT inte ökar ERα LBD basal aktivitet. Det är en nyckelfaktor för att kunna avgöra och detektera 4OHT-beroende LBD dimerization aktiviteten för framgångsrikt med M2H analys. ERα LBD-baserade M2H analyser kan användas för att studera aktiviteten partiell agonist av selektiv östrogen receptor modulatorer (t.ex., 4OHT) i olika proteintillverkningen.

Figur 3 visar systematiken i möjliga svar i kombination (i) och kombination (ii) plasmid-transfekterade celler. Experimentella resultat visas i figur 4. Aktiviteten av kombination (a pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pakten) visar stimulering av 10 nM E2 (figur 4A), eftersom den ERα LBD innehåller domänen ligandberoende transkription funktionella, AF-2. Agonist (t.ex., E2) som b...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

Vi presenterar en metod för att analysera 4-hydroxi-tamoxifen-beroende östrogen receptor ligand-bindande domänen dimerization alfaaktiviteten med däggdjur två-hybrid-analys.

Att upptäcka Ligand-bindande domänen Dimerization aktiviteten av östrogen Receptor alfa med däggdjur två-Hybrid-analys

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

Så denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor om förmågan hos östrogena ligander att reglera östrogenreceptorn alfa och mekanismerna för selektiv östrogenreceptormodulatorer. Den största fördelen med denna teknik är att det är en enkel metod. det visar ligand-beroende östrogen receptor alfa ligand bindande domän dimerization aktivitet i cellerna.Demonstrera förfarandet kommer att Tanner Jefferson, en postdoc student från vår grupp. Denna metod använder tre olika plasmider för att upptäcka östrogenreceptoren ligand bindande domän dimerisering aktivitet i celler. pG5-Luc är luciferas reporter plasmid för att upptäcka effekten av dimerisering aktivitet.pBIND mus östrogen receptorn alfa EF är en galaktos-lyhörd transkriptionsfaktor GAL4 DNA bindande till en huvudsaklig smält mus östrogen alfa ligand bindande domän uttryck plasmid som binder till GAL4 lyhörd elementet på pG5-Luc reporter. pACT mus östrogen receptorn alpha EF är en herpes simplex virus transactivating segment protein VP16 aktivering domän smält mus östrogen receptor alfa ligand bindande domän uttryck plasmid som inte binder direkt till pG5-Luc reporter. När den rätta liganden är närvarande, proteinerna som härrör från pBIND mus östrogenreceptorn alpha EF och pACT mus östrogenreceptorn alfa EF plasmider binda genom östrogenreceptorn alfa ligand bindande domän.Effektiviteten av dimerizationen är beslutsam vid luciferasaktiviteten. Det viktigaste steget är att styra aktiviteten hos pBIND mus östrogenreceptorn alfa EF härledda protein. Aktiviteten av pBIND-härledda östrogen receptor alfa ligand binda domän i varje ligand utan pACT östrogen receptorn alfa EF plasmid måste utvärderas innan analysera ligand-beroende östrogen receptor ligand bindande domän dimerization aktivitet.Börja med att lägga till lämpliga plasmidkombinationer i två 1,5-milliliter mikrocentrifugrör per kombination. Bered dna-blandningens två kombinationer. Första röret innehåller pG5-Luc, pBIND-östrogen receptor-alfa EF, och tomma pACT plasmider.Andra röret innehåller pG5-Luc, pBIND-östrogen receptor-alfa EF, och pACT-östrogen receptor-alfa EF plasmider. För att fälla ut DNA:t, tillsätt en 1/9 av DNA-blandningsvolymen av tre molarnatriumacetat och en 20X tre molarnatriumacetatvolym på 100%etanol till DNA-blandningen i varje rör och vortexa rören. Förvara blandningarna på 20 grader Celsius över natten innan centrifugering vid maximal hastighet nästa morgon.Kassera supernatanterna och resuspend den osynliga pellets i 120 mikroliter av 75%etanol per rör, var noga med att skölja ner eventuellt DNA fastnat på insidan av rören. Efter en andra centrifugering under samma förhållanden, kassera supernatanterna och torka DNA:t i en vakuumkoncentrator i 30 minuter. För transfection, tvätta den beredda mänskliga hepatocellular carcinom celler två gånger med 0,5 milliliter rumstemperatur PBS per brunn per tvätt och mata cellerna med 0,5 milliliter av färska 37 grader Celsius fenol röd-fri MEM kompletteras med 10%kol-avskalade värme-inaktiverade fetala nötkreatur serum och två millimol L-amine glut.Därefter suspendera torkad plasmid DNA-blandning och transfektionsreagens i lämplig volym dmem per antal brunnar i enskilda 1,5-milliliter mikrocentrifugrör. Tillsätt en lika stor volym av reagensmedel för transfection till varje DMEM-suspenderad plasmid DNA-blandningsrör. Efter en fem till 10-minuters inkubation vid rumstemperatur, lägga till 25 mikroliter av DNA-blandning till lämpliga experimentella brunnar av 24-väl mänskliga hepatocellular carcinom cell kultur plattan för en sex timmars transfection i cellkultur inkubatorn.Och i slutet av inkubationen, ersätta transfection mediet med 0,5 milliliter av färska 37 grader Celsius fenol rödfri MEM kompletteras med 10%kol-strippad värme-inaktiverad FBS, två millimolar L-glutamin, 1%penicillin streptomycin, och ligand per brunn och returnera cellerna till cellkultur inkubatorn för en annan 16 till 18 timmar. Nästa morgon, tvätta cellerna med en milliliter PBS per brunn och fäst cellerna från varje brunn med 100 mikroliter passiv lysbuffert per brunn och kraftig skakning med en virvelblandare. Frys sedan cellen lysater i flytande kväve.På dagen för den dubbla luciferas analysen, skaka lysates på en shaker tills plattan når rumstemperatur, och överföra 10 mikroliter av lysate till enskilda brunnar av en 96-väl vit plastplatta. Läs sedan luciferasaktiviteten hos varje cell lysateprov på en mikroplattläsare. Behandlingen av pBIND mus östrogen receptorn alpha EF och pACT plasmider transfected celler med 10 nanomolar östradiol stimulerar luciferas aktivitet som östrogen receptorn alfa ligand bindande domän innehåller ligand-beroende transaktivering funktionell domän, AF-2.En och 10-nanomolar koncentrationer dock inducera luciferas aktivitet i cellerna transfected med kombinationen av pBIND och pACT mus östrogen receptorn alfa EF plasmider, vilket tyder på genomförbarheten av detta förfarande för att utvärdera östrogen receptor alfa ligand bindande domän dimerization aktivitet på upp till en nanomolar av östradiol behandling. Behandling med 4-hydroxi-tamoxifen framkallar inte luciferasaktivitet i pBIND-musens östrogenreceptor alfa EF och pACT plasmidtransfekterade celler, vilket tyder på att funktionen AF-2 av östrogenreceptor alfa inte aktiveras av denna ligand. Upp till 10 nanomolar koncentrationer dock inducerar luciferas aktivitet i cellerna transfected med kombinationen av pBIND och pACT mus östrogen receptorn alfa EF plasmider, vilket tyder på att detta förfarande är genomförbart för att utvärdera östrogen receptor alfa ligand bindande domän dimerization aktivitet vid upp till 10 nanomolar av 4-hydroxy-tamoxifen behandling.Aktiviteten från kombinationen av pBIND och pACT mus östrogen receptor alfa ligand bindande domän uttryck plasmider med 4-hydroxy-tamoxifen är betydligt högre än kombinationen av pBIND och pACT mänskliga östrogen receptor alfa ligand bindande domän uttryck plasmider. Detta indikerar att 4-hydroxy-tamoxifen-beroende homodimerization aktivitet av musen östrogen receptorn alfa ligand bindande domän är mer potent än den mänskliga östrogen receptorn alfa ligand bindande domän. Vidare, den 4-hydroxi-tamoxifen-beroende homodimerization aktivitet av musen östrogen receptor alfa ligand bindande domän som innehåller en mänsklig F domän är betydligt lägre än den för vilda typ mus östrogen receptor alfa ligand bindande domän.Däremot är 4-hydroxi-tamoxifen-beroende homodimerization verksamhet av den mänskliga östrogen receptorn receptorn alfa ligand bindande domän som innehåller en mus F domän betydligt högre än den vilda typen mänskliga östrogen receptor alfa ligand bindande domän. Detta tyder på att F domänen har ett inflytande på artspecifika 4-hydroxi-tamoxifen-beroende östrogen receptor alfa ligand bindande domän homodimerization verksamhet. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att testa den basala aktiviteten av GAL4 DNA bindande domän smält östrogen receptor alfa ligand binda domän aktivitet med din ligand.Den aktiviteten ska vara samma som fordonsbehandling.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

En allmän metod för att upptäcka Nitrosamide bildning i In Vitro metabolismen av nitrosaminer genom cytokrom P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Utvärdering av Cell Invasion och migreringsprocessen: en jämförelse av Video Mikroskop-baserade Scratch sår Assay och Boyden kammare analysen

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Med Dot-analys att analysera Migration av Cell ark

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Med hjälp av CRISPR/Cas9 gen redigering för att undersöka onkogena aktiviteten av muterade Calreticulin i cytokin beroende av hematopoetiska celler

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Ett omfattande förfarande för att utvärdera In Vitro den förmodade hemangioblastom kärlnybildning använder den sfäroid groning Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modeling osteosarkom med Li-Fraumeni syndrom patientderiverade inducerade pluripotenta stamceller

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

Surface-förbättrade resonans Raman spridning Nanoprobe Ratiometry för att upptäcka mikroskopisk äggstockscancer via folat Receptor inriktning

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Tillverkning chimeric antigen receptor (bil) T celler för adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In vitro inrättande av en genetiskt modifierad murin huvud och hals cancer cellinjer med ett Adeno-associerat virus-Cas9 system

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Kartläggning av strukturfunktionsrelationer för oordnade onkogena transkriptionsfaktorer med transkriptomisk analys

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...