Name: detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

Yazarlar Drs. Sueyoshi ve Wang, Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (NIEHS) için el yazması ve Tanner Jefferson okuma kritik videoda yordamları gerçekleştirmek için teşekkür ederiz. Bu eser (adı için) Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant 1ZIAES070065 NIEHS, Intramural araştırma bölümü tarafından desteklenmiştir.

1. hazırlanması plazmid memeli iki-hibrid tahlil için
<ol><li>Aşağıdaki plazmid kullanın: pG5-Luc, pBIND-ERαEF ve Paktı-ERαEF. Not: Plazmid yazarlardan istek üzerine mevcuttur ve filtre kağıdı gönderilir. pG5-Luc duyarlı öğeleri luciferase ifade birimi (Şekil 1A) ile erimiş GAL4 beş tekrarlar içeren muhabir plazmid var. pBIND-ERαEF protein ifade plazmid ERα yakın GAL4DBD erimiş proteinler için var. pBIND-ERαEF bir Renilla luciferase ifade tra...

<ol>
	<li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F+domain+of+estrogen+receptor+&#945;+is+involved+in+species-specific,+tamoxifen-mediated+transactivation.">The F domain of estrogen receptor &#945; is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li><li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor.">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li><li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+estrogen+receptor/coactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen.">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li><li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization.">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li><li>Montano, M. M., M&#252;ller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor:+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists.">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).</li><li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+&#945;+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions.">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor &#945; that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li><li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. , (2011).</li><li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+&#945;+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element.">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor &#945; Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li><li>Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists.">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).</li><li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries:+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta.">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li><li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+L543A,+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists,+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity.">Estrogen receptor &#945; L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li></ol>

Burada, ERα yakın homodimerization aktivite örnek olarak algılamak için tahlil koşullar odaklanan M2H tahlil için protokol açıkladığımız. Genel olarak, M2H tahlil ligand-bağımlı ERα yakın dimerization etkinlik değerlendirmesi için popüler değil. Bu ERα bir transkripsiyon etkinleştirme işlev sahip yakın nedeniyle. Hangi etkinlik rahatsız ediyor, bazı durumlarda, M2H tahlil sonuçları. Biz burada göstermek gibi ancak, M2H tahlil yakın (Örneğin, 4OHT, SERMs) AF-2 transactivation iş...

Östrojen reseptör Alfa (ERα) östrojenik ligand-bağımlı transkripsiyonu düzenleyicisidir. Amino asit sequenceof ERα türler arasında son derece korunmuş. İnsan arasında daha yüksek Homoloji nedeniyle ve ERα fare, bu reseptörleri işlevini, aynı düşünce ve östrojenik maddeler (Örneğin, Tamoksifen) bu türlerin farklı etkinlik türün farklılıkları nedeniyle oluşur kimyasal metabolizmaları ERα yapısal farklılıklar tarafından değil. ERα son derece A F etki alanlarına belirlenmiş nükleer reseptör (NR) üst aile arasında yaygın etki alanı yapılarına korunmuş. E veya ligand bağlayıcı etki alanı (yakın)-ligand taşıması cep ve transkripsiyon aktivasyon fonksiyonu 2, içerir AF-2 adlı. F etki alanı hemen E etki alanına bitişik yerelleştirilmiştir ve NRs arasında en değişken etki alanıdır. Hatta insan arasında ve ERα fare, Homoloji F etki alanının önemli ölçüde diğer etki alanları1daha düşüktür. ERα ligand bağlı yakın (ERα klasik eylem) ligand-bağımlı Gen transkripsiyonu düzenleyen için doğrudan belirli östrojen duyarlı DNA öğeyi bağlamak için ERα protein homodimerization artırır. Helix 12 (AF-2 çekirdek etki alanı) ile estradiol (E2) - ya da 4-hidroksi-tamoxifen (4OHT) - Diferansiyel konumlandırma bağlı yakın dimer2,3Crystallographic çalışmalar ortaya koymuştur. ERα F etki alanı (45 amino asitler) helix 12 doğrudan bağlayın. Ancak, ERα yakın dimerization bu eklentinin helix 12 üzerinden 45 amino asitlerin (F etki alanı) etkisi ile ilgili hiçbir bilgi yoktur. Bu çalışmada, bir memeli iki-hibrid (M2H) tahlil kullanarak species-specific 4OHT bağlı ERα yakın homodimerization F etki alanına katkısını göstermek.
M2H tahlil üç farklı plazmid DNA'lar tanıtımı memeli hücrelerinde protein-protein etkileşimlerini göstermek için bir yöntemdir: GAL4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı (DBD) füzyon ERα yakın ve VP16AD füzyon ERα yakın hızlı, iki protein ifade plazmid ve bir GAL4RE erimiş luciferase ifade muhabir plazmid. Ne zaman GAL4DBD füzyon ERα yakın ve VP16AD füzyon ERα yakın etkileşim (yapmak bir dimer) hücrelerde bu protein kompleksi için GAL4RE bağlar ve, sonra luciferase gen ekspresyonu VP16AD bağlı transactivation işlevi aracılığıyla etkinleştirir. YAKIN homodimerization düzeyini luciferase aktivite değerlendirilebilir.
Maya iki-hibrid (Y2H) tahlil Maya ana bilgisayar ortamı olarak kullanır aynı ilkeye göre alternatif bir yöntemdir. Y2H sistemi kullanarak önceki raporları F-etki alanı-kesme insan ERα yakın E2 bağımlı coactivator işe alım, F etki alanı E2-aracılı transkripsiyon4engeller sonuç artar gösterdi. Bu sonuç hangi insan ERα memeli hücreleri5,6F-etki alanı-kesme zayıflatılmış transkripsiyon faaliyet gösterdiği diğer Özet Tablo raporları ile tutarsız. Son zamanlarda, bizim çalışma M2H sistemiyle, insan ERα yakın E2 bağımlı coactivator işe alım etkinliği tarafından F etki alanı kesme memeli hücrelerinde azalma ve transkripsiyon etkinlik1ile tutarlıdır gösterdi. Bu gözlemler protein-protein etkileşim fizyolojik rolü bir hücre türüne özgü şekilde ve içeriği farklıdır öneririm. M2H tahlil protein-protein etkileşim Etkinlik transkripsiyon etkinliğini belirlemek için kullanılan aynı hücresel bağlamında kanıtlamanın. Bu Y2H ya da diğer vitro protein-protein etkileşim analizleri ile karşılaştırıldığında M2H testin bir avantaj sağlar.
Seçici östrojen reseptör modülatörleri (SERMs) (Örneğin, 4OHT) ERα-aracılı transkripsiyonu düzenleyen kısmi agonist etkinliğinin moleküler mekanizmaları ile ilgili sorular kalır. M2H deneyleri ERα yakın tabanlı kısmi agonist aktivitesinde SERMs çeşitli memeli hücre türleri mekanizması çalışmaya uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="891">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pG5-Luc</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E249A</td>
			<td style="width:360px;">Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pBIND</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E245A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pACT</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E246A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Rotor</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing Buckets</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Resuspension Solution (CRA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Lysis Solution (CLA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neutralization Solution (NSA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Column Wash Solution (CWB)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midipreps DNA Purification Resin</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midicolumns</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">51200038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BenchMark fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-119</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053028</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Passive Lysis 5X Buffer</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax L microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay

Östrojen reseptör Alfa (ERα) östrojenik ligand-bağımlı transkripsiyonu düzenleyicisidir. ERα protein dizi türleri arasında son derece korunmuş. İnsan işlevinin ve fare ERαs aynı olduğunu düşündüm. Fare ve insan ERα ligand bağlayıcı etki (yakın) dimerization etkinliği memeli iki-hibrid (M2H) tahlil kullanarak fark 4-hidroksi-tamoxifen (4OHT) etkisi göstermektedir. M2H tahlil kullanan iki protein ifade plazmid (GAL4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı [DBD] füzyon yakın ve VP16 transactivation etki alanı [VP16AD] füzyon yakın) transfection yakın homodimerization aktivite memeli hücrelerinde verimliliğini kanıtlamanın ve bir GAL4 duyarlı öğesi (GAL4RE) luciferase muhabir plazmid erimiş. GAL4DBD fusion yakın ve VP16AD füzyon yakın bir dimer hücrelerde yaptığınızda, bu protein kompleksi için GAL4RE bağlar ve sonra bir luciferase gen ekspresyonu VP16AD bağımlı transkripsiyonu faaliyetleri ile hiçbir devreye giriyor. 4OHT-aracılı luciferase harekete geçirmek fare ERα yakın füzyon protein ifade plazmid insan hücrelerinde ERα yakın füzyon protein ifade transfected plazmid ile transfected HepG2 hücreleri yüksektir. Bu sonuç 4OHT bağımlı fare ERα yakın homodimerization faaliyet etkinliği insan ERα yakın yüksek olduğunu göstermektedir. Genel olarak, M2H tahlil kullanımı agonistik ligandlar yakın etkinlik bazal düzeyini arttırmak ve bu yakın dimerization aktivite tespiti engellemektedir Çünkü nükleer reseptör yakın dimerization etkinlik, değerlendirme için ideal değildir. Bulduğumuz o 4OHT ERα yakın bazal etkinlik geliştirmez. Bu belirlemek ve M2H tahlil başarıyla kullanmak için 4OHT bağlı yakın dimerization aktivite tespit edememek için önemli bir faktördür. M2H deneyleri ERα yakın tabanlı kısmi agonist etkinliği seçici östrojen reseptör modülatörleri (Örneğin, 4OHT) ile çalışmaya çeşitli memeli hücre tiplerinde uygulanabilir.

Şekil 3 olası yanıtları düzeni kombinasyonu (i) ve kombinasyon (II) plazmid transfected hücreleri görüntüler. Deneysel sonuçları Şekil 4' te gösterilmiştir. Kombinasyon (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + Paktı) faaliyet stimülasyon 10 tarafından gösteren nM E2 (Şekil 4A), ERα yakın ligand-bağımlı transactivation işlev etki alanı, AF-2 içerdiğinden. ERα yakın...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

Biz memeli iki-hibrid tahlil kullanarak 4-hidroksi-tamoxifen-bağımlı östrojen reseptör Alfa ligand bağlayıcı etki alanı dimerization etkinliğini analiz etmek için bir yöntem mevcut.

Ligand bağlayıcı etki Dimerization etkinliği östrojen reseptör Alfa memeli iki-hibrid tahlil kullanarak algılama

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

Yani bu yöntem östrojenik ligands yeteneği hakkında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir östrojen reseptör alfa ve seçici östrojen reseptör modülatörleri mekanizmaları düzenlemek için. Bu tekniğin en büyük avantajı basit bir yöntem olmasıdır. Bu hücrelerde ligand bağımlı östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki dimerizasyon aktivitesi gösterir.Prosedürü gösteren Tanner Jefferson, grubumuzdan bir doktora öğrencisi olacak. Bu yöntem, hücrelerde östrojen reseptör ligand bağlayıcı etki dimerizasyon aktivitesini tespit etmek için üç farklı plazmid kullanır. pG5-Luc dimerizasyon aktivitesinin etkinliğini tespit etmek için luciferase muhabiri plazmid olduğunu.pBIND fare östrojen reseptörü alfa EF bir galaktoz duyarlı transkripsiyon faktörü GAL4 DNA bir ana erimiş fare östrojen alfa ligand bağlayıcı etki alanı ifade plazmid bağlayıcı pG5-Luc muhabiri GAL4 duyarlı eleman bağlanır. pACT fare östrojen reseptörü alfa EF segment protein VP16 aktivasyon etki alanı doğrudan pG5-Luc muhabiri ne bağlamaz fare östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki alanı ekspresyonu plazmid erimiş segment protein iaktive bir herpes simpleks virüs transaktivolduğunu. Uygun ligand mevcut olduğunda, pBIND fare östrojen reseptörü alfa EF ve pACT fare östrojen reseptörü alfa EF plazmidler türetilen proteinler östrojen reseptörü alfa ligand bağlayıcı etki alanı ile bağlanır.Dimerizasyon verimliliği luciferase aktivitesi tarafından belirlenir. En önemli adım pBIND fare östrojen reseptörü alfa EF türetilmiş protein aktivitesini kontrol etmektir. PACT östrojen reseptörü alfa EF plazmid olmadan her ligand pBIND türetilmiş östrojen reseptör alfa ligand bağlama etki alanı aktivitesi ligand bağımlı östrojen reseptör ligand bağlayıcı etki dimerizasyon aktivitesi analiz etmeden önce değerlendirilmelidir.Kombinasyon başına iki 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpler içine uygun plazmid kombinasyonları ekleyerek başlayın. DNA karışımının iki kombinasyonunu hazırlayın. İlk tüp pG5-Luc içerir, pBIND-östrojen reseptör-alfa EF, ve boş pACT plazmidler.İkinci tüp pG5-Luc içerir, pBIND-östrojen reseptör-alfa EF, ve pACT-östrojen reseptör-alfa EF plazmidler. DNA'yı çökertmek için, her tüpteki DNA karışımına üç molar sodyum asetat ve %100 etanol 20X üç molar sodyum asetat hacminin 1/9'u dna karışımı hacmini ekleyin ve tüpleri girdaplayın. Ertesi sabah maksimum hızda santrifüj önce 20 derece santigrat gecede karışımları saklayın.Süpernatantları atın ve tüp başına %75 etanolün 120 mikrolitresinde görünmez peletleri yeniden askıya alın ve tüplerin içlerine yapışmış DNA'ları durulayın. Aynı koşullar altında ikinci bir santrifüj sonra, supernatants atın ve 30 dakika boyunca bir vakum konsantratörü DNA kuru. Transfeksiyon için, hazırlanan insan hepatosellüler karsinom hücrelerini her yıkama başına 0,5 mililitre oda sıcaklığında PBS ile iki kez yıkayın ve hücreleri 0,5 mililitre taze 37 derece fenol kırmızısız MEM ile besleyin ve %10 kömürlü ısı yalıtımlı fetal sığır serumu ve iki milimolar L-glutamin ile besleyin.Daha sonra, bireysel 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerde kuyu sayısı başına DMEM uygun hacimde kurutulmuş plazmid DNA karışımı ve transfeksiyon reaktifaskıya. Her DMEM askıda plazmid DNA karışımı tüpe eşit hacimli transfeksiyon reaktifi ortamı ekleyin. Oda sıcaklığında beş ila 10 dakikalık bir kuluçkadan sonra, hücre kültürü kuluçka makinesinde altı saatlik bir transfeksiyon için 24 kuyulu insan hepatosellüler karsinom hücre kültür plakasının uygun deneysel kuyularına 25 mikrolitre DNA karışımı ekleyin.Ve kuluçka sonunda, taze 37 derece fenol kırmızı-free MEM 0.5 mililitre ile transfeksiyon orta değiştirin 10% kömür-soyulmuş ısı inaktive FBS ile takviye, iki milimolar L-glutamin, 1% penisilin streptomisin, ve ligand başına iyi ve başka bir hücre kültürü kuvöz hücreleri dönmek 16-18 saat. Ertesi sabah, iyi başına PBS bir mililitre hücreleri yıkayın ve iyi başına pasif lysis tampon 100 mikrolitre ve bir girdap karıştırıcı ile güçlü sallayarak her kuyudan hücreleri takın. Sonra sıvı nitrojen içinde hücre lysates dondurun.Çift luciferase tsay gününde, plaka oda sıcaklığına ulaşana kadar bir çalkalayıcı üzerinde lysates sallamak ve 96-iyi beyaz plastik plaka bireysel kuyulara lysate 10 mikrolitre aktarın. Daha sonra bir mikroplaka okuyucu üzerinde her hücre lysate örnek luciferase aktivitesini okuyun. PBIND fare östrojen reseptörü alfa EF ve pACT plazmidlerinin tedavisi 10 nanomolar estradiol ile transfected hücreleri uyarır östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki ligand bağımlı transaktivasyon fonksiyonel etki alanı içerir, AF-2.Bir ve 10-nanomolar konsantrasyonları ancak, pBIND ve pACT fare östrojen reseptörü alfa EF plazmids kombinasyonu ile transfected hücrelerde luciferase aktivitesi neden, östrojen reseptör alfa ligand bağlama etki dimerizasyon aktivitesini değerlendirmek için bu prosedürün fizibilite düşündüren estradiol tedavi nin bir nanomolar kadar. 4-hidroksi-tamoksifen ile tedavi pBIND fare östrojen reseptörü alfa EF ve pACT plazmid transfected hücrelerde luciferase aktivitesi ortaya çıkarmak değildir, östrojen reseptör alfa AF-2 fonksiyonu bu ligand tarafından aktive olmadığını düşündürmektedir. 10 nanomolar konsantrasyonları ancak, pBIND ve pACT fare östrojen reseptörü alfa EF plazmids kombinasyonu ile transfected hücrelerde luciferase aktivitesi niyarışlar, bu prosedür östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki dimerizasyon aktivitesini değerlendirmek için mümkün olduğunu düşündüren 10 nanooksi-tamoksifen tedavisi nanomolar.4-hidroksi-tamoksifen ile pBIND ve pACT fare östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki alanı ekspresyonu plazmidlerin kombinasyonundan aktivite pBIND ve pACT insan östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki alanı ekspresyonu plazmidleri kombinasyonundan önemli ölçüde daha yüksektir. Bu fare östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki alanının 4-hidroksi-tamoksifen bağımlı homodimerizasyon aktivitesi daha insan östrojen reseptörü alfa ligand bağlayıcı etki daha güçlü olduğunu gösterir. Ayrıca, fare östrojen reseptör alfa ligand bir insan F etki alanı içeren bağlama etki alanının 4-hidroksi-tamoksifen bağımlı homodimerizasyon aktivitesi önemli ölçüde vahşi tip fare östrojen reseptör alfa ligand bağlama etki alanı daha düşüktür.Buna karşılık, bir fare F etki alanı içeren insan östrojen reseptörü alfa ligand bağlayıcı etki alanının 4-hidroksi-tamoksifen bağımlı homodimerizasyon aktivitesi önemli ölçüde yabani tip insan östrojen reseptör üvel alfa ligand bağlayıcı etki alanı daha yüksektir. Bu F etki alanı türlere özgü 4-hidroksi-tamoksifen bağımlı östrojen reseptör alfa ligand bağlayıcı etki homodimerizasyon aktivitesi üzerinde bir etkisi olduğunu göstermektedir. Bu prosedürü çalışırken, GAL4 DNA bağlayıcı etki alanının bazal aktivitesini test etmek için hatırlamak önemlidir östrojen reseptör üle alfa ligand ligand ligand bağlama etki alanı aktivitesi ligand ile erimiş.Bu aktivite araç tedavisi yle aynı olmalıdır.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

Nitrosamide oluşumu nitrozaminler sitokrom P450s tarafından in Vitro metabolizma saptamak için bir genel yöntem

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Geçiş hücre yaprak analiz etmek için nokta tahlil kullanarak

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

CRISPR/Cas9 kullanarak Gene sitokin bağımlı hematopoetik hücreler Mutant Calreticulin Oncogenic etkinliğini araştırmak için düzenleme

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Sözde Hemangioblastoma tahlil çimlenme küresel kullanarak neovaskülarizasyon Vitro performansını değerlendirmek için kapsamlı bir yordam

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Li-Fraumeni sendromu hasta kaynaklı indüklenmiş Pluripotent kök hücreler kullanılarak osteosarkom modelleme

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

Yüzey gelişmiş rezonans Raman nanoprobe Ratiometry mikroskobik yumurtalık kanseri folat reseptör via algılamak için saçılma hedefleme

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

İmal İmmünoterapi için İmkanerik Antijen Reseptör (CAR) T Hücreleri

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

Adeno-Associated Virus-Cas9 Sistemi Kullanılarak Genetiği Değiştirilmiş Bir Murine Baş ve Boyun Kanseri Hücre Hattı In Vitro Kurulması

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Transcriptomik Analiz Kullanarak Düzensiz Onkojenik Transkripsiyon Faktörlerinin Yapı-fonksiyon İlişkilerinin Eşlenmesini

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...