Name: analysis of shear flow-induced migration of murine marginal zone b cells in vitro
Uploaded: 2018-11-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions de la « Deutsche Forschungsgemeinschaft » SFB 854/TP11 à K.-D.F.

Toutes les expériences impliquant l’utilisation d’animaux ont été préalablement approuvés par le Landesverwaltungsamt de Halle (Saxe-Anhalt), Allemagne, conformément à toutes les directives de la faculté de médecine de l’Université OVGU de Magdebourg.
1. Purification de cellules MZB
<ol><li>
Isoler les leucocytes.
	<ol>
<li>Sacrifier un 8 à 16 semaines souris et enlever la rate16. Dissocier la rate dans 5 mL de tampon de cellule glac?...

<ol>
	<li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).</li><li>Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direction+of+migration+of+T-lymphocytes+under+flow+depends+upon+which+adhesion+receptors+are+engaged.">The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged.</a> Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).</li><li>Steiner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+for+endothelial+ICAM-1,+ICAM-2,+and+VCAM-1+in+shear-resistant+T+cell+arrest,+polarization,+and+directed+crawling+on+blood-brain+barrier+endothelium.">Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium.</a> Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).</li><li>Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocytes+orient+against+the+direction+of+fluid+flow+during+LFA-1-mediated+migration.">T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration.</a> Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).</li><li>Woolf, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+chemokines+promote+sustained+T+lymphocyte+motility+without+triggering+stable+integrin+adhesiveness+in+the+absence+of+shear+forces.">Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces.</a> Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).</li><li>Cinamon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+1-phosphate+receptor+1+promotes+B+cell+localization+in+the+splenic+marginal+zone.">Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone.</a> Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).</li><li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport.">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).</li><li>Cyster, J. G., Schwab, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+and+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs.">Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).</li><li>Schwab, S. R., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+way+out:+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs.">Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).</li><li>Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginal+zone+B+cells:+virtues+of+innate-like+antibody-producing+lymphocytes.">Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).</li><li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+spleen.">Structure and function of the spleen.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li><li>Tedford, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opposing+forces+of+shear+flow+and+sphingosine-1-phosphate+control+marginal+zone+B+cell+shuttling.">The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling.</a> Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).</li><li>ImageJ. MTrack2 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/MTrack2">https://imagej.net/MTrack2</a> (2018)</li><li>. MTrack2 Available from: <a target="_blank" href="https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html">https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html</a> (2018)</li><li>. Chemotaxis and Migration Tool Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html">https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html</a> (2018)</li><li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+lymphoid+organs.">Removal of lymphoid organs.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>. Manual Tracking Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html</a> (2018)</li><li>. ibidi Pump System Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html">https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html</a> (2018)</li></ol>

Nous décrivons ici une méthode pour l’analyse de la migration des cellules qui détectent la force du flux de cisaillement et répondre en altérant leur migration. Une analyse de MZBs a montré que les MZBs migrer spontanément sur ICAM-1 et en présence de débit, va migrer vers le haut de la circulation. Dans nos travaux précédents, nous avons montré que MZBs ne migrent pas vers le haut le flux sur VCAM-1, mais au contraire restent fixes en place. La zone marginale splénique murine contient principalement ICAM...

Les cellules immunitaires sont les cellules les plus mobiles dans le corps humain et doivent souvent composer avec la force de cisaillement de la circulation sanguine et lymphatique. Cependant, il y a relativement peu d’études sur les migrations induite par la force de cisaillement de leucocytes1,2,3,4,5. Nous présentons ici un protocole fiable et quantitatif pour analyser la réponse d’une cellule immunitaire au flux in vitro. Réalisation de l’essai ne requiert pas de fabrication de composants, et tous les équipements et les consommables sont disponibles dans le commerce. Le protocole, y compris l’analyse de purification et de la migration cellulaire, peut être effectué en une seule journée. Enfin, bien que nous décrivons la migration des cellules de B de la zone marginale (MZBs), le protocole peut être adapté pour analyser des migrations contre flux d’autres types de cellules immunitaires. Il est donc possible d’utiliser ce test pour analyser systématiquement un large éventail des leucocytes avec un panel exhaustif des conditions.
MZBs sont une population de cellules de B qui, chez la souris, se trouvent uniquement dans la rate et la navette entre l’intérieur des follicules et les zones marginales6,7,8,9. La zone marginale est une couche de cellules immunitaires environ 5 à 10 cellules épais. La couche de cellules enveloppe du follicule et compose principalement de MZBs et macrophages mais également les cellules T (iNKT) tueuses naturels invariants, les cellules dendritiques (CD) et neutrophiles, entre autres,10. Les cellules de la zone marginale sont exposés au flux unidirectionnel de sang provenant des artères spléniques qui se terminent par un sinus marginal entourant le follicule. Le sang coule des trous dans le sinus marginal par le biais de la zone marginale et est puis recueilli dans les sinus veineux dans la pulpe rouge et restauré à la circulation de11. La libre circulation du sang se lave au cours des MZBs et les expose aux antigènes transportés dans le sang. Les MZBs portent l’antigène dans le follicule par navette automatiquement entre la zone marginale et à l’intérieur du follicule, ce qui n’est pas exposé à du sang. Ainsi, comme MZBs navette vers le follicule, ils doivent migrer vers le haut de la force de cisaillement de l' écoulement de sang12 (Figure 1 a).
Dans ce protocole, nous décrivons comment déterminer quantitativement comment immunitaire cellules tels que MZBs répondre à aucun débit ou haut débit in vitro, afin de révéler comment ils sont programmés pour migrer in vivo. Dans un premier temps, MZBs sont purifiés de la rate de souris à l’aide de billes magnétiques couplées à l’anticorps de kits disponibles dans le commerce. Les MZBs fraîchement isolées sont introduits dans le puits d’une coulée de chambre, autorisés à s’installer sur des ligands de l’intégrine et exposées à l’écoulement du tampon de migration à l’aide d’un système de pompe (Figure 2 a). Les cellules sont imagés à l’aide d’un système de microscopie vidéo Time-lapse. Les images sont ensuite traitées pour l’analyse avec un plugin d’ImageJ gratuit,13,MTrack214, pour suivre automatiquement les cellules. Titres peuvent ensuite être quantifiés avec Ibidi chimiotactisme gratuit outil15 à déterminer différents paramètres, notamment la vitesse, de rectitude et indice de migration. Ces valeurs peuvent être utilisées pour déterminer les effets des inhibiteurs de la migration, stimulateurs de la cellule, chimiokines et autres produits chimiques d’affecte la migration sur la migration de cisaillement-flux induit afin de comprendre les forces qui contrôlent le mouvement de cellules immunitaires in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZB and FOB cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-366</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103206</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD21 / CD 35, clone 7G6, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558658</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23, clone B3B4, PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS 1x</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA albumin fraction V, fatty acid-free</td>
			<td>Roth</td>
			<td>&#34;0052.3&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>796-IC-050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi &#181;-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10963</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Pump system</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of shear flow-induced migration of murine marginal zone b cells in vitro

Cellules de B de la zone marginale (MZBs) sont une population de cellules de B qui résident dans les zones marginales spléniques de souris qui enveloppent les follicules. Pour atteindre les follicules, MZBs doit migrer vers le haut de la force de cisaillement de la circulation sanguine. Nous présentons ici une méthode pour analyser cette migration MZB induite par le flux in vitro. Tout d’abord, les MZBs sont isolées de la rate de souris. En second lieu, MZBs sont installés sur des ligands de l’intégrine dans les diapositives de chambre de flux, exposés au flux de cisaillement et imagés sous un microscope lors de la migration. En troisième lieu, des images des MZBs de migration sont traitées à l’aide de la cellule automatique de MTrack2 suivi de plugin pour ImageJ, et les pistes de cellules qui en résultent sont quantifiés à l’aide de l’outil de chimiotactisme Ibidi. Les données de migration révèlent comment rapidement déplacent les cellules, combien de fois ils changent de direction, si le vecteur flux de cisaillement affecte leur direction de migration et les ligands de l’intégrine sont impliqués. Même si nous utilisons MZBs, la méthode peut facilement être adaptée pour l’analyse de migration des leucocytes qui répond à la force du flux de cisaillement.

Nous avons utilisé le protocole décrit ci-dessus pour comparer la migration des MZBs sur des lames ICAM-1-enduit sans écoulement (0 dyn/cm2) et exposés pour déformer les flux (4 dynes/cm2). Les cellules ont été suivies automatiquement avec MTrack2 et la piste qui en résulte des fichiers ont été superposées sur les films de migration cellulaire sans écoulement (0 dyn/cm2) et (4 dynes/cm2) pour montrer la répartition et la forme de la...

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Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Cellules (MZBs) de la zone marginale B répondent à la force du flux de cisaillement de réorienter leur voie de migration vers le haut de la circulation. Ce protocole indique comment enregistrer et analyser la migration à l’aide d’un appareil fluidique, pompe, microscope système d’imagerie et des logiciels libres.

Analyse de cisaillement induite par le flux de Migration des cellules B Zone marginale murin In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Cette méthode peut aider à comprendre les questions clés dans le domaine de la migration des cellules immunitaires, telles que la façon dont le cytosquelette envoie des forces de cisaillement et comment les ligands et les chimiokines de l’intégrine affectent la migration induite par le flux des leucocytes. Le principal avantage de cette technique est que c’est un nouveau type d’analyse de migration qui est facile pour les débutants à effectuer. Il n’utilise que de l’équipement disponible dans le commerce et des reagents, ainsi que des logiciels libres.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des cellules marginales de la zone B, elle peut également être appliquée à d’autres cellules immunitaires, telles que les cellules T activées. La veille de l’expérience, décongeler un aliquot d’ICAM-1, et le diluer dans PBS à une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre. Ensuite, ajoutez 30 microlitres d’ICAM-1 aux chambres désirées d’une glissière d’écoulement.Placez la glissière dans une chambre humide et réglez-la à quatre degrés Celsius pour l’incuber pendant la nuit. Le lendemain, lavez la chambre en ajoutant 100 microlitres de PBS à un puits, puis en retirant 100 microlitres de l’autre puits de la chambre. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon de blocage à une chambre, et incubez la lame dans une chambre humide à température ambiante pendant 90 minutes.Ensuite, lavez la chambre en ajoutant 100 microlitres de PBS à un puits, en la retirant de l’autre puits, puis ajoutez 100 microlitres de tampon de migration à la chambre. La diapositive est maintenant prête à l’emploi. Conservez-le dans une chambre humide à température ambiante jusqu’à l’expérience.Tout d’abord, branchez une pompe fluide et fixez l’unité fluidique. Ensuite, allumez le logiciel de la pompe. Ensuite, lavez le tube une fois avec cinq à 10 millilitres de tampon de migration.Cela prendra environ une minute. Ensuite, ajoutez 11,7 millilitres de tampon de migration également aux deux réservoirs et éliminez les bulles d’air. Maintenant, serrez le tube à environ 10 centimètres du morceau de connecteur, et placez l’unité fluidique dans la chambre d’incubation chauffée sur le microscope.Dans le logiciel, réglez le choix de diapositive à micro-slide VI 0.4 et l’option tube au blanc. En outre, réglez le stress de cisaillement désiré à environ quatre dynes par centimètre carré et le temps d’imagerie à 30 minutes. Ensuite, réglez le débit désiré et le stress de cisaillement en entrant les valeurs dans le logiciel de pompe.Ensuite, préchauffer la chambre d’incubation du microscope, unité fluidique, et la migration tampon aliquots à 37 degrés Celsius. Une fois chaude, testez la pompe fluide, en vous assurant que le tampon de migration circule dans les réservoirs et qu’il n’y a pas de bulles d’air dans le système. Tout d’abord, isoler les leucocytes et purifier les cellules marginales de la zone B décrites dans le protocole texte qui l’accompagne.Ensuite, nettoyez le fond de la lame avec un tissu amorti à l’éthanol. Ajouter 30 microlitres de la suspension cellulaire dans un puits de la chambre et retirer 30 microlitres du tampon de migration stocké de l’autre puits. Couvrez la lame et incubez-la pendant 30 minutes pour permettre aux cellules de s’attacher.Ensuite, ajoutez lentement un tampon de migration préchauffé à chaque puits de la glissière jusqu’à ce qu’un ménisque positif s’élève du puits. Retirez les bulles d’air avec la pointe pipette. Il est important de maintenir la cohérence avec les facteurs qui affectent l’adhérence cellulaire, afin de garder les tampons et les cellules à 37 degrés, et d’éviter d’utiliser une force excessive lors de l’entrée du tampon dans la chambre.Serrez la glissière jusqu’au stade du microscope et retirez le côté non marqué du tube fluide du connecteur. Ensuite, remplissez l’extrémité du tube avec tampon de migration jusqu’à ce qu’un ménisque positif sans bulles d’air s’élève de la fin. Retournez l’extrémité du tube et insérez-le dans le puits supérieur de la chambre d’écoulement.Tout en gardant le tube serré, répétez la procédure pour l’extrémité marquée du tube. Maintenant, passez le système d’imagerie en mode Live, et sélectionnez un champ de vision qui est au milieu de la diapositive. Ici, mettre l’accent sur les cellules, puis se déco concentrer légèrement pour améliorer le contour noir des cellules et de produire un intérieur blanc.Le fond noir et le centre blanc seront plus faciles à utiliser dans le programme de suivi automatisé. Configurez le programme de séquence d’imagerie pour enregistrer une image toutes les cinq secondes pendant 30 minutes à l’aide d’un objectif sec 10x. Ensuite, commencez à enregistrer.Retirez la pince du tube et allumez la pompe. Cela fera se laver les cellules non adhérentes et les cellules adhérentes commenceront à migrer. À la fin du programme d’imagerie, étiquetez et enregistrez le film.Si vous utilisez un inhibiteur ou un modificateur de la migration cellulaire, il peut être ajouté soit aux cellules de la suspension cellulaire avant de les mettre sur la diapositive ou au tampon de migration dans l’unité fluidique. Pour commencer l’analyse automatique de la voie de migration, ouvrez le programme ImageJ. Copiez MTrack2_kt fichier Java dans le dossier Plugins ImageJ.Dans le menu Plugins, sélectionnez Compiler et exécuter. Ensuite, redémarrez ImageJ, et le plugin doit apparaître dans le menu Plugins. Ouvrez la pile d’images du film de migration cellulaire dans ImageJ, et traiter les images telles qu’elles sont montrées ici afin de convertir la vidéo des images couleur en images à contraste élevé montrant les cellules comme des objets noirs sur un fond blanc.Ensuite, aiguiser les images deux fois, despeckle les images, puis convertir les images en huit bits. Dans le menu Image, accédez au submenu Ajuster la luminosité/contraste et placez le curseur contrasté au contraste maximal. Cela fera apparaître les cellules comme des objets blancs sur un fond noir.Ensuite, retournez au sous-ménu du seuil d’ajustement pour vous assurer que les cellules apparaissent comme des objets noirs sur un fond blanc. Maintenant, exécutez le plugin automatique de suivi cellulaire MTrack2 kt. Sur l’écran d’options, réglez la taille des particules au minimum à un pixel et la taille des particules maximale à 30 pixels.Réglez la valeur de vitesse à 10 pixels, bien que les cellules marginales de zone B ne dépassent généralement pas deux pixels sur les images successives qui sont à cinq secondes d’intervalle. Les pistes cellulaires sont maintenant prêtes à être analyses à l’aide de l’outil ibidi Chemotaxis. Ces deux champs montrent les trajectoires de migration des cellules marginales de la zone B qui ont été ensemencées sur des glissières enduites de l’ICAM-1.Les cellules ont été suivies automatiquement avec MTrack2 en utilisant les méthodes décrites dans cet article. Sur la gauche, les cellules ont été photographiées dans des conditions statiques, et sur les cellules droites ont été exposées à un flux de cisaillement de quatre dynes par centimètre carré. Les pistes cellulaires individuelles peuvent être importées dans l’outil ibidi Chemotaxis pour générer des parcelles de piste de chaque film.Ici, les traces cellulaires individuelles sont de couleur rouge pour indiquer qu’elles se sont terminées en aval de leur point d’origine ou noires si elles se terminaient en amont. L’analyse des pistes cellulaires de quatre films individuels pour les deux flux et aucune condition de flux sont montrés ici. Cela inclut l’indice moyen de migration directionnelle, la vitesse cellulaire, la droititude du chemin et la distance finale en ligne droite pour les deux conditions.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’image de la migration directionnelle des cellules marginales de la zone B vers le flux de cisaillement et comment suivre automatiquement les cellules. Au cours de cette procédure, d’autres méthodes telles que la microscopie TIRF peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions, telles que la façon dont le cytosquelette et les intégrines réagissent au stress du cisaillement?

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