Name: analysis of shear flow-induced migration of murine marginal zone b cells in vitro
Uploaded: 2018-11-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של 854/TP11 SFB "פתוח" ק-DF.

כל הניסויים הכרוכות של בעלי חיים בעבר אושרו על-ידי Landesverwaltungsamt האלי (סקסוניה-אנהלט), גרמניה, לפי כל ההנחיות של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת OVGU של מגדבורג.
1. MZB תא טיהור
<ol><li>
לבודד לויקוציטים.
	<ol>
<li>הקרבה של 8-16 בת שבוע העכבר ולהסיר את הטחול16. מביצועם הטחול...

<ol>
	<li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).</li><li>Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direction+of+migration+of+T-lymphocytes+under+flow+depends+upon+which+adhesion+receptors+are+engaged.">The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged.</a> Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).</li><li>Steiner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+for+endothelial+ICAM-1,+ICAM-2,+and+VCAM-1+in+shear-resistant+T+cell+arrest,+polarization,+and+directed+crawling+on+blood-brain+barrier+endothelium.">Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium.</a> Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).</li><li>Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocytes+orient+against+the+direction+of+fluid+flow+during+LFA-1-mediated+migration.">T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration.</a> Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).</li><li>Woolf, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+chemokines+promote+sustained+T+lymphocyte+motility+without+triggering+stable+integrin+adhesiveness+in+the+absence+of+shear+forces.">Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces.</a> Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).</li><li>Cinamon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+1-phosphate+receptor+1+promotes+B+cell+localization+in+the+splenic+marginal+zone.">Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone.</a> Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).</li><li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport.">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).</li><li>Cyster, J. G., Schwab, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+and+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs.">Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).</li><li>Schwab, S. R., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+way+out:+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs.">Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).</li><li>Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginal+zone+B+cells:+virtues+of+innate-like+antibody-producing+lymphocytes.">Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).</li><li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+spleen.">Structure and function of the spleen.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li><li>Tedford, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opposing+forces+of+shear+flow+and+sphingosine-1-phosphate+control+marginal+zone+B+cell+shuttling.">The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling.</a> Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).</li><li>ImageJ. MTrack2 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/MTrack2">https://imagej.net/MTrack2</a> (2018)</li><li>. MTrack2 Available from: <a target="_blank" href="https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html">https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html</a> (2018)</li><li>. Chemotaxis and Migration Tool Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html">https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html</a> (2018)</li><li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+lymphoid+organs.">Removal of lymphoid organs.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>. Manual Tracking Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html</a> (2018)</li><li>. ibidi Pump System Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html">https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html</a> (2018)</li></ol>

נתאר כאן שיטה לניתוח ההעברה של תאי הכוח של הטיה זרימה ויוכל להגיב על-ידי שינוי ההגירה שלהם. ניתוח של MZBs הראה כי MZBs להעביר באופן ספונטני על ICAM-1, בנוכחות זרימה, להעביר את הזרם. בעבודה הקודמת, הראינו כי MZBs אינן מעבירות את הזרם על VCAM-1 אבל במקום זה יישאר קבוע במקום. מאתר הטחול אזור שוליים מכיל בעיק...

תאים חיסוניים תאי תאי ביותר בגוף האדם, לעיתים קרובות חייב להתמודד עם כוח ההטיה של זרימת הדם והלימפה. עם זאת, ישנם מחקרים מעטים יחסית על הגירה הנוצרות על-ידי כוח ההטיה של לויקוציטים1,2,3,4,5. אנו מציגים כאן פרוטוקול אמין ולא כמותיים כדי לנתח את התגובה של תא החיסון לזרימה במבחנה. ביצוע וזמינותו אינו דורש ייצור של רכיבים, כל הציוד והחומרים המתכלים הם זמינים מסחרית. הפרוטוקול, כולל ניתוח טיהור והעברה של התא, יכול להתבצע ביום אחד. בסופו של דבר, למרות שאנחנו מתארים את ההעברה של אזור שוליים B תאים (MZBs), הפרוטוקול ניתן להתאים לנתח את ההעברה נגד זרימה של סוגים אחרים של תאים חיסוניים. לכן, זה ריאלי לשימוש הזה assay לנתח באופן שיטתי מגוון רחב של לויקוציטים עם פאנל מקיף של תנאים.
MZBs הם אוכלוסייה של תאי B המצויים, העכבר, רק הטחול ואת הסעות בין הפנים של זקיקים8,97,6,אזורי שוליים. אזור שולית היא שכבה של תאים חיסוניים כ 5-10 תאים עבים. השכבה תא עוטפת הזקיק, מורכב בעיקר MZBs, המקרופאגים אבל גם הטבעית הקבועה הרוצח בתאי T (iNKT), תאים דנדריטים (Dc), נויטרופילים, בין היתר10. התאים באזור שוליים חשופים זרימת הדם חד כיווני שמקורם עורקים הטחול לסיים בסינוס שוליים סביב הזקיק. הדם זורם חורים הסינוס שולי דרך אזור שולית היא שליקט סינוסים ורידים בכשלקוח אדום ואז לשחזר את מחזור11. זרימה חופשית של דם שוטף MZBs, וחושפת אותם בפני אנטיגנים נישא בדם. MZBs נושא אנטיגן לתוך הזקיק על ידי הליכה הלוך ושוב באופן אוטומטי בין אזור שולי בתוך הזקיק, אשר אינה נחשפת דם. לפיכך, כמו הסעות MZBs כלפי הזקיק, הם עליך להעביר הכוח הטיה של זרימת דם12 (איור 1 א').
פרוטוקול זה, אנו נתאר כיצד באופן כמותי לקבוע איך החיסון תאים כגון MZBs להגיב אין זרימה או זרימה גבוהה במבחנה, כדי לגלות איך הם מתוכנתים להעביר בתוך vivo. בשלב הראשון, MZBs כבר טהור מן הטחול העכבר באמצעות beads מגנטי מצמידים נוגדנים של ערכות זמינים מסחרית. MZBs טרי מבודד הציג לתוך הבאר של שקופית קאמרית זרימה, מותר להתיישב על ליגנדים אינטגרין, חשוף לזרימה של מאגר העברה באמצעות מערכת משאבת (איור 2 א). התאים הם צילמו באמצעות מערכת מיקרוסקופ וידאו זמן לשגות. התמונות מעובדות ואז לניתוח עם תוסף ImageJ חינם, MTrack213,14, לעקוב באופן אוטומטי את התאים. רצועות ואז שניתן לכמתו חינם Ibidi כימוטקסיס כלי15 כדי לקבוע פרמטרים שונים כולל מהירות, יושר אינדקס ההעברה. ערכים אלה יכול לשמש כדי לקבוע את ההשפעות של מעכבי ההעברה, תכשירים תא, נוגדנים וכימיקלים אחרים שמשפיעים על ההעברה על ההעברה הטיה זרימה המושרה על מנת להבין את כוחות שליטה תא החיסון תנועה ויוו.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZB and FOB cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-366</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103206</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD21 / CD 35, clone 7G6, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558658</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23, clone B3B4, PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS 1x</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA albumin fraction V, fatty acid-free</td>
			<td>Roth</td>
			<td>&#34;0052.3&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>796-IC-050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi &#181;-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10963</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Pump system</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of shear flow-induced migration of murine marginal zone b cells in vitro

אזור שוליים B תאים (MZBs) הם אוכלוסיה של תאי B השוכנים באזורי העכבר הטחול שולית אופפים זקיקים. כדי להגיע הזקיקים, MZBs עליך להעביר את הכוח הטיה של זרימת הדם. אנו מציגים כאן שיטה לניתוח תזרים-induced MZB העברה זו במבחנה. ראשית, MZBs מבודדים מן הטחול העכבר. שנית, MZBs התיישבו על ליגנדים אינטגרין בשקופיות קאמרית זרימה, חשוף להטיית זרימה, עם תמונה תחת מיקרוסקופ בעת העברת. שלישית, תמונות של MZBs העברת מעובדים שימוש בתא MTrack2 אוטומטי מעקב תוסף עבור ImageJ, הרצועות תא וכתוצאה מכך הם לכמת באמצעות הכלי כימוטקסיס Ibidi. העברת הנתונים לחשוף כמה מהר להעביר התאים, באיזו תדירות הם משנים כיוון, אם הווקטור זרימה ' הטיה ' משפיעה על כיוון ההגירה שלהם, ליגנדים אינטגרין אשר מעורבים. אמנם אנו משתמשים MZBs, שיטת בקלות ניתן להתאים לניתוח העברה של כל ליקוציט המגיבה לכוח של זרימה הטיה.

אנחנו נעשה שימוש בפרוטוקול שפורטו לעיל כדי להשוות בין העברה של MZBs בשקופיות ICAM-1-מצופה ללא זרימה (0 רמות דינ/cm2) ונחשף להטיית זרימה (4 רמות דינ/cm2). התאים היו מעקב באופן אוטומטי עם MTrack2, המסלול וכתוצאה מכך קבצים פרסו לקולנוע ההעברה לתא של אין זרימת (0 רמות דינ/cm2)...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro at JoVE.com

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

אזור שוליים B תאים (MZBs) להגיב בכוח גזירה זרימה על ידי מחדש המכוונת את נתיב הנדידה שלהם כן. פרוטוקול זה מראה כיצד לתעד ולנתח את ההעברה באמצעות יחידת פלואידיקה, משאבה, מערכת הדמיה במיקרוסקופ, תוכנה חופשית.

ניתוח של הטיה הנוצרות על-ידי זרימת נדידה של תאי B מאתר אזור שולי במבחנה

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

שיטה זו יכולה לעזור להבין שאלות מפתח בתחום נדידת התאים החיסוניים, כגון כיצד הציטוסקלטון שולח כוחות הגזירה וכיצד ליגנדים וכימותרפינים לאtegrin משפיעים על הגירה הנגרמת על ידי זרימה של לויקיטים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה סוג חדש של התראת הגירה שקל למתחילים לבצע. היא משתמשת רק בציוד מסחרי זמין reagents, כמו גם תוכנה חופשית.למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך תאים אזור שולי B, זה יכול להיות מיושם גם על תאים חיסוניים אחרים, כגון תאי T פעילים. ביום שלפני הניסוי, להפשיר aliquot של ICAM-1, ולדלל אותו PBS לריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן, הוסף 30 מיקרוליטרים של ICAM-1 לחדרים הרצויים של מגלשת זרימה.מניחים את השקופית לתוך תא לח, ולהגדיר אותו בארבע מעלות צלזיוס כדי דגירה לילה. למחרת, לשטוף את התא על ידי הוספת 100 microliters של PBS ל הבאר אחת ולאחר מכן משיכת 100 microliters מה באר השנייה של התא. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של חיץ חסימה לתא, ולהדגיר את השקופית בתא לח בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות.לאחר מכן, לשטוף את התא על ידי הוספת 100 microliters של PBS ל הבאר אחת, משיכתו מן הבאר השנייה, ולאחר מכן להוסיף 100 microliters של חיץ הגירה לתא. השקופית מוכנה כעת לשימוש. אחסן אותו בתא לח בטמפרטורת החדר עד הניסוי.ראשית, חבר משאבת נוזלים, ולחבר את יחידת fluidics. לאחר מכן, הפעל את תוכנת המשאבה. לאחר מכן, לשטוף את הצינורות פעם אחת עם חמישה עד 10 מיליליטר של חיץ הגירה.זה ייקח בערך דקה אחת. לאחר מכן, הוסף 11.7 מיליליטר של מאגר הגירה באופן שווה לשני המאגרים, והסר את בועות האוויר. עכשיו, להדק את הצינורות על 10 ס"מ מהחתיכה המחבר, ולמקם את היחידה הנוזלית בתא הדגירה המחומם על המיקרוסקופ.בתוכנה, הגדר את בחירת השקופית למיקרו-החלקה VI 0.4 ואת אפשרות הצינור ללבן. כמו כן, הגדר את הלחץ הגזירה הרצוי סביב ארבעה dynes לכל סנטימטר מרובע ואת זמן ההדמיה ל 30 דקות. לאחר מכן, הגדר את קצב הזרימה הרצוי ואת הלחץ הגזיר על-ידי הזנת הערכים לתוכנת המשאבה.לאחר מכן, מחממים מראש את תא הדגירה של המיקרוסקופ, יחידת הנוזלים ומאגר הנדידה ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר החום, בדוק את המשאבה הנוזלית, כדי להבטיח כי מאגר הנדידה זורם הלוך ושוב במאגרים, כי אין בועות אוויר במערכת. ראשית, לבודד לויוציטים, ולטהר את תאי אזור B השוליים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.לאחר מכן, נקה את תחתית המגלשה עם רקמה מעומעמת באתנול. הוסף 30 microliters של ההשעיה התא לתוך באר אחת של התא, ולמשוך 30 microliters של מאגר הנדידה המאוחסן מה באר השנייה. מכסים את השקופית, ו דגירה אותו במשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים לצרף.לאחר מכן, הוסף באיטיות מאגר הגירה מחומם מראש לכל באר של השקופית עד שמניסקוס חיובי עולה מה הבאר. הסר את כל בועות האוויר עם קצה פיפטה. חשוב לשמור על עקביות עם גורמים המשפיעים על הידבקות התא, ולכן לשמור על המאגרים והתאים ב 37 מעלות, ולהימנע משימוש בכוח מופרז בעת צינור החיץ לתוך התא.מהדקים את השקופית לשלב המיקרוסקופ ומסירים את הצד הלא מסומן של הצינור הנוזלי מפיסת המחבר. לאחר מכן, למלא את הקצה של צינורות עם חיץ הגירה עד מניסקוס חיובי ללא בועות אוויר עולה מהסוף. הופכים את קצה הצינור, ומכניסים אותו לתוך הטופ של תא הזרימה.תוך שמירה על צינורות מהודק, לחזור על ההליך עבור הקצה המסומן של הצינור. כעת, העבר את מערכת ההדמיה למצב Live ובחר שדה תצוגה באמצע השקופית. כאן, להגדיר את המיקוד על התאים, ולאחר מכן לבטל את המיקוד מעט כדי לשפר את קווי המתאר השחורים של התאים לייצר פנים לבן.הרקע השחור והמרכז הלבן יהיו קלים יותר לשימוש בתוכנית המעקב האוטומטית. הגדר את תוכנית רצף ההדמיה כדי להקליט תמונה אחת כל חמש שניות במשך 30 דקות באמצעות מטרה יבשה 10x. לאחר מכן, התחל להקליט.מוציאים את המהדק מהצנרת, ומפעילים את המשאבה. פעולה זו תגרום לתאים שאינם חסידים להישטף ולתאים חסידים להתחיל להגר. בסוף תוכנית ההדמיה, תייג ושמור את הסרט.אם אתה משתמש במעכב או במגביל של העברת תאים, ניתן להוסיף אותו לתאים בהשעיית התא לפני הצבתם בשקופית או למאגר ההעברה ביחידת fluidics. כדי להתחיל בניתוח אוטומטי של מסלול העברה, פתח את התוכנית ImageJ. העתק את MTrack2_kt Java לתיקיה תוספים של ImageJ.תחת תפריט תוספים, בחר בצע הידור והפעלה. לאחר מכן, הפעל מחדש את ImageJ והתוסף אמור להופיע בתפריט תוספים. פתח את ערימת התמונות מסרט העברת התאים ב- ImageJ, ועיבד את התמונות כפי שמוצג כאן כדי להמיר את הווידאו ממסגרות צבע לתמונות חדות גבוהה המציגות את התאים כאובייקטים שחורים על רקע לבן.לאחר מכן, חידדו את התמונות פעמיים, תיעבו את התמונות ולאחר מכן המירו את התמונות לשמונה סיביות. בתפריט תמונה, עבור לתפריט המשנה כוונון בהירות/ניגודיות והצב את המחוון חדות בניגוד מרבי. פעולה זו תגרום לתאים להופיע כאובייקטים לבנים על רקע שחור.לאחר מכן, חזור לת תפריט המשנה התאמת סף כדי להבטיח שהתאים יופיעו כאובייקטים שחורים על רקע לבן. עכשיו, להפעיל את תוסף מעקב התא האוטומטי MTrack2 kt. במסך האפשרויות, הגדר את גודל החלקיק לפיקסל אחד ואת גודל החלקיק ל- 30 פיקסלים לכל היותר.הגדר את ערך המהירות ל- 10 פיקסלים, אם כי תאי B של אזור שולי בדרך כלל לא יחרגו משני פיקסלים במסגרות עוקבות במרחק של חמש שניות זה מזה. רצועות התא מוכנות כעת לניתוח באמצעות כלי ibidi Chemotaxis. שני שדות אלה מציגים את נתיבי ההעברה של תאי אזור B שוליים שזרעו בשקופיות מצופות ICAM-1.התאים היו במעקב אוטומטי עם MTrack2 באמצעות השיטות המתוארות במאמר זה. בצד שמאל, תאים דימוי בתנאים סטטיים, ועל התאים הימניים נחשפו לזרימת גימה של ארבעה dynes לסנטימטר מרובע. רצועות התא הבודד ניתן לייבא לתוך כלי ibidi Chemotaxis כדי ליצור עלילות מסלול של כל סרט.כאן, רצועות התא הבודדות צבועות באדום כדי לציין שהן הסתיימו במורד הזרם של נקודת המוצא או השחורה שלהן אם הן הגיעו במעלה הזרם. ניתוח רצועות תא מארבעה סרטים בודדים הן לזרימה והן ללא תנאי זרימה מוצגים כאן. הדבר כולל את מדד ההעברה הכיוונית הממוצע, מהירות התא, ישרות הנתיב ומרחק הקו הישר הסופי עבור שני התנאים.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך להבין גם כיצד לזהות את הנדידה הכיוונית של תאי B של אזור שוליים לכיוון זרימת הגזרה וכיצד לעקוב אחר התאים באופן אוטומטי. במהלך הליך זה, שיטות אחרות כגון מיקרוסקופ TIRF ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד cytoskeleton ו integrins להגיב ללחץ גזירה?

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

אינדוקציה והערכה של רקומבינציה החלף מחלקה ב מטוהרים תאים B Murine

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

בידוד, עיבוד וניתוח של תאי חניכיים Murine

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

ניתוח מהיר של סטיות כרומוזום בעכבר לימפוציטים מסוג B על ידי הרשות הפלסטינית-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

מודל Murine של הקבוצה B<em&gt; סטרפטוקוקוס</em&gt; נרתיקי Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

הרומן במבחנה פצע ריפוי הנועד להעריך את נדידת תאים

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...