Name: analysis of shear flow-induced migration of murine marginal zone b cells in vitro
Uploaded: 2018-11-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro at JoVE.com

यह काम "ड्यूश Forschungsgemeinschaft" SFB 854/TP11 से K.-D.F से अनुदान द्वारा समर्थित था ।

पशुओं के उपयोग से जुड़े सभी प्रयोगों को पहले Landesverwaltungsamt हाले (Saxony-Anhalt), जर्मनी, मैगडेबर्ग के OVGU विश्वविद्यालय के चिकित्सा संकाय के सभी दिशानिर्देशों के अनुसार अनुमोदित किया गया है ।
1. MZB कोशिका शुद्ध?...

<ol>
	<li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).</li><li>Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direction+of+migration+of+T-lymphocytes+under+flow+depends+upon+which+adhesion+receptors+are+engaged.">The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged.</a> Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).</li><li>Steiner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+for+endothelial+ICAM-1,+ICAM-2,+and+VCAM-1+in+shear-resistant+T+cell+arrest,+polarization,+and+directed+crawling+on+blood-brain+barrier+endothelium.">Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium.</a> Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).</li><li>Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocytes+orient+against+the+direction+of+fluid+flow+during+LFA-1-mediated+migration.">T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration.</a> Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).</li><li>Woolf, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+chemokines+promote+sustained+T+lymphocyte+motility+without+triggering+stable+integrin+adhesiveness+in+the+absence+of+shear+forces.">Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces.</a> Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).</li><li>Cinamon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+1-phosphate+receptor+1+promotes+B+cell+localization+in+the+splenic+marginal+zone.">Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone.</a> Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).</li><li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport.">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).</li><li>Cyster, J. G., Schwab, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+and+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs.">Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).</li><li>Schwab, S. R., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+way+out:+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs.">Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).</li><li>Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginal+zone+B+cells:+virtues+of+innate-like+antibody-producing+lymphocytes.">Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).</li><li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+spleen.">Structure and function of the spleen.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li><li>Tedford, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opposing+forces+of+shear+flow+and+sphingosine-1-phosphate+control+marginal+zone+B+cell+shuttling.">The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling.</a> Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).</li><li>ImageJ. MTrack2 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/MTrack2">https://imagej.net/MTrack2</a> (2018)</li><li>. MTrack2 Available from: <a target="_blank" href="https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html">https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html</a> (2018)</li><li>. Chemotaxis and Migration Tool Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html">https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html</a> (2018)</li><li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+lymphoid+organs.">Removal of lymphoid organs.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>. Manual Tracking Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html</a> (2018)</li><li>. ibidi Pump System Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html">https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html</a> (2018)</li></ol>

हम यहां कोशिकाओं के प्रवास का विश्लेषण है कि कतरनी प्रवाह के बल का पता लगाने और उनके प्रवास फेरबदल द्वारा प्रतिक्रिया के लिए एक विधि का वर्णन । MZBs के एक विश्लेषण से पता चला है कि MZBs िकैम पर सहज प्रवास-1 और प?...

प्रतिरक्षा कोशिकाओं को मानव शरीर में सबसे अधिक गतिशील कोशिकाओं रहे है और अक्सर रक्त और लसीका प्रवाह से कतरनी बल के साथ संघर्ष करना चाहिए । हालांकि, ल्यूकोसाइट्स1,2,3,4,5के कतरनी बल-प्रेरित प्रवास पर तुलनात्मक रूप से कुछ अध्ययन कर रहे हैं । हम यहां एक विश्वसनीय और मात्रात्मक प्रोटोकॉल के लिए एक प्रतिरक्षा कोशिका की प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए इन विट्रो में प्रवाह प्रस्तुत करते हैं । परख प्रदर्शन घटकों के निर्माण की आवश्यकता नहीं है, और सभी उपकरणों और उपभोग्य सामग्रियों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । कक्ष शुद्धिकरण और माइग्रेशन विश्लेषण सहित प्रोटोकॉल, एक ही दिन में किया जा सकता है । अंत में, यद्यपि हम सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं (MZBs) के प्रवास का वर्णन, प्रोटोकॉल के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अंय प्रकार के प्रवाह के खिलाफ प्रवास का विश्लेषण अनुकूलित किया जा सकता है । इसलिए, यह संभव है कि इस परख का उपयोग करने के लिए व्यवस्थित शर्तों के एक व्यापक पैनल के साथ ल्यूकोसाइट्स की एक विस्तृत रेंज का विश्लेषण ।
MZBs बी कोशिकाओं की आबादी है कि, माउस में, केवल तिल्ली और रोम के इंटीरियर और सीमांत क्षेत्रों6,7,8,9के बीच शटल में पाए जाते हैं । सीमांत क्षेत्र प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक परत लगभग 5 – 10 मोटी कोशिकाओं है । कोशिका परत कूप ढंक और MZBs और मैक्रोफेज के मुख्य रूप से होते हैं, लेकिन यह भी अपरिवर्तनीय प्राकृतिक खूनी टी (iNKT) कोशिकाओं, वृक्ष कोशिकाओं (dc), और न्यूट्रोफिल, अंय लोगों के अलावा10। सीमांत क्षेत्र में कोशिकाओं एकतरफ़ा रक्त प्लीहा धमनियों कि कूप आसपास के एक सीमांत साइनस में समाप्त होने से उत्पंन प्रवाह को उजागर कर रहे हैं । रक्त सीमांत क्षेत्र के माध्यम से सीमांत साइनस में छेद से बहती है और फिर लाल लुगदी में शिरापरक साइनस में एकत्र और संचलन11में बहाल । रक्त के मुक्त प्रवाह MZBs पर बहाकर और उन्हें रक्त में किए गए एंटीजन को उजागर करता है । MZBs के कूप में प्रतिजन ले स्वचालित रूप से सीमांत क्षेत्र और कूप है, जो रक्त के संपर्क में नहीं है के अंदर के बीच । इस प्रकार, कूप की ओर MZBs शटल के रूप में, वे रक्त प्रवाह12 (आंकड़ा 1a) की कतरनी बल विस्थापित करना होगा ।
इस प्रोटोकॉल में, हम वर्णन कैसे मात्रात्मक कैसे MZBs के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं को या तो कोई प्रवाह या इन विट्रो में उच्च प्रवाह का जवाब निर्धारित करने के लिए, ताकि वे vivo मेंमाइग्रेट करने के लिए क्रमादेशित रहे है प्रकट करने के लिए । पहले चरण में, MZBs एक माउस तिल्ली वाणिज्यिक उपलब्ध किट से एंटीबॉडी के लिए मिलकर चुंबकीय मोतियों का उपयोग से शुद्ध कर रहे हैं. हौसले से पृथक MZBs एक प्रवाह चैंबर स्लाइड के कुआं में पेश कर रहे हैं, integrin लाइगैंडों पर बसने की अनुमति दी, और माइग्रेशन बफर के प्रवाह को उजागर एक पंप प्रणाली (चित्रा 2a) का उपयोग कर । कोशिकाओं को एक समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोप प्रणाली का उपयोग कर imaged रहे हैं । छवियों तो एक मुक्त ImageJ प्लगइन, MTrack213,14, के साथ विश्लेषण के लिए स्वचालित रूप से कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए संसाधित कर रहे हैं । पटरियों तो वेग, सीधे, और माइग्रेशन सूचकांक सहित विभिन्न मापदंडों का निर्धारण करने के लिए मुक्त Ibidi Chemotaxis उपकरण15 के साथ quantified जा सकता है. ये मान माइग्रेशन अवरोधकों, सेल के उत्तेजितकों, chemokines, और अंय माइग्रेशन-कतरनी प्रवाह प्रेरित प्रवास पर रसायनों को प्रभावित करने के क्रम में vivo में प्रतिरक्षा सेल आंदोलन को नियंत्रित करने बलों को समझने के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZB and FOB cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-366</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103206</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD21 / CD 35, clone 7G6, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558658</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23, clone B3B4, PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS 1x</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA albumin fraction V, fatty acid-free</td>
			<td>Roth</td>
			<td>&#34;0052.3&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>796-IC-050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi &#181;-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10963</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Pump system</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of shear flow-induced migration of murine marginal zone b cells in vitro

सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं (MZBs) बी कोशिकाओं की आबादी है कि माउस प्लीहा सीमांत क्षेत्रों में रहते है कि रोम ढंक रहे हैं । रोम तक पहुंचने के लिए, MZBs रक्त प्रवाह की कतरनी बल माइग्रेट करना चाहिए । हम यहाँ इस प्रवाह-प्रेरित MZB माइग्रेशन इन विट्रो में विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । सबसे पहले, MZBs माउस तिल्ली से अलग कर रहे हैं । दूसरा, MZBs प्रवाह चैंबर स्लाइड में integrin लाइगैंडों पर बसे हैं, कतरनी प्रवाह को उजागर, और एक खुर्दबीन के नीचे imaged जबकि पलायन । तीसरा, पलायन MZBs की छवियों ImageJ के लिए MTrack2 स्वचालित सेल ट्रैकिंग प्लगइन का उपयोग संसाधित कर रहे हैं, और परिणामस्वरूप सेल पटरियों Ibidi chemotaxis उपकरण का उपयोग quantified हैं । माइग्रेशन डेटा यह प्रकट करता है कि कक्ष कितनी तेजी से चलते हैं, वे कितनी बार दिशा बदलते हैं, चाहे कतरनी प्रवाह वेक्टर उनकी माइग्रेशन दिशा को प्रभावित करे, और जिसमें integrin लाइगैंडों शामिल हों । हम MZBs का उपयोग करते हैं, विधि आसानी से कतरनी प्रवाह के बल पर प्रतिक्रिया करता है कि किसी भी ल्युकोसैट के प्रवास का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

हम ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया िकैम पर MZBs के प्रवास की तुलना-1-प्रवाह के बिना लेपित स्लाइड (0 dyn/सेमी2) और कतरनी प्रवाह को उजागर (4dyn/ कक्ष स्वचालित रूप से MTrack2 के साथ ट्रैक किए गए...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro at JoVE.com

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं (MZBs) फिर से कतरनी प्रवाह के बल का जवाब-उनके प्रवास के प्रवाह को पथ उंमुख । इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कैसे रिकॉर्ड और एक fluidics इकाई, पंप, माइक्रोस्कोप इमेजिंग प्रणाली, और मुफ्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रवास का विश्लेषण ।

Murine सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं के कतरनी प्रवाह प्रेरित प्रवासन का विश्लेषण इन विट्रो में

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

यह विधि प्रतिरक्षा कोशिका प्रवास क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रश्नों को समझने में मदद कर सकती है, जैसे कि साइटोस्केलेटन कतरनी बलों को कैसे भेजता है और कैसे इंटीग्रिन लिगांड और केमोकिंस ल्यूकोसाइट्स के प्रवाह-प्रेरित प्रवास को प्रभावित करते हैं। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह एक नए प्रकार का माइग्रेशन परख है जो शुरुआती लोगों के लिए प्रदर्शन करना आसान है। यह केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरण और अभिकर्णों के साथ-साथ मुफ्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है।हालांकि यह विधि सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, लेकिन इसे सक्रिय टी कोशिकाओं जैसे अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर भी लागू किया जा सकता है। प्रयोग से पहले दिन, ICAM-1 के एक aliquot गल, और यह PBS में पांच माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला । फिर, एक प्रवाह स्लाइड के वांछित कक्षों में आईसीएएम-1 के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें।स्लाइड को एक आर्द्र कक्ष में रखें, और रात भर इनक्यूबेट करने के लिए इसे चार डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। अगले दिन, एक कुएं में पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर जोड़कर चैंबर को धोएं और फिर कक्ष के दूसरे कुएं से 100 माइक्रोलीटर वापस लें। फिर, एक कक्ष में बफर को अवरुद्ध करने के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, और 90 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक आर्द्र कक्ष में स्लाइड को इनक्यूबेट करें।इसके बाद, पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर को एक कुएं में डालकर, दूसरे कुएं से वापस लेकर चैंबर को धोएं, और फिर चैंबर में माइग्रेशन बफर के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। स्लाइड अब उपयोग करने के लिए तैयार है। प्रयोग तक कमरे के तापमान पर एक आर्द्र कक्ष में इसे स्टोर करें।सबसे पहले, एक तरल पदार्थ पंप में प्लग, और तरल पदार्थ इकाई देते हैं। इसके बाद पंप सॉफ्टवेयर चालू कर दें। इसके बाद, पांच से 10 मिलीलीटर माइग्रेशन बफर के साथ एक बार ट्यूबिंग धोएं।इसमें करीब एक मिनट का समय लगेगा। फिर, दोनों जलाशयों में समान रूप से 11.7 मिलीलीटर माइग्रेशन बफर जोड़ें, और हवा के बुलबुले को हटा दें। अब, कनेक्टर टुकड़े से लगभग 10 सेंटीमीटर टयूबिंग दबाएं, और तरल इकाई को माइक्रोस्कोप पर गर्म इनक्यूबेशन कक्ष में रखें।सॉफ्टवेयर में, माइक्रो-स्लाइड VI 0.4 और सफेद करने के लिए ट्यूबिंग विकल्प के लिए स्लाइड विकल्प सेट करें। इसके अलावा, वांछित कतरनी तनाव को लगभग चार डाइन प्रति वर्ग सेंटीमीटर और इमेजिंग समय को 30 मिनट तक सेट करें। फिर, पंप सॉफ्टवेयर में मूल्यों में प्रवेश करके वांछित प्रवाह दर और कतरनी तनाव निर्धारित करें।इसके बाद, माइक्रोस्कोप इनक्यूबेशन चैंबर, फ्लूइडिक्स यूनिट और माइग्रेशन बफर एलिकोट्स को 37 डिग्री सेल्सियस तक प्री-वार्म करें। एक बार गर्म होने के बाद, तरल पंप का परीक्षण करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि माइग्रेशन बफर जलाशयों में आगे-पीछे बहता है और सिस्टम में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं। सबसे पहले, ल्यूकोसाइट्स को अलग करें, और साथ में टेक्स्ट प्रोटोकॉल में वर्णित सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं को शुद्ध करें।फिर, एक इथेनॉल-घटा ऊतक के साथ स्लाइड के नीचे साफ करें। कक्ष के एक कुएं में सेल निलंबन के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें, और दूसरे कुएं से संग्रहीत माइग्रेशन बफर के 30 माइक्रोलीटर वापस लें। स्लाइड को कवर करें, और कोशिकाओं को संलग्न करने की अनुमति देने के लिए इसे 30 मिनट तक इनक्यूबेट करें।इसके बाद, धीरे-धीरे स्लाइड के प्रत्येक कुएं में प्री-वार्म माइग्रेशन बफर जोड़ें जब तक कि एक सकारात्मक मेनिस्कस अच्छी तरह से बाहर नहीं निकल जाता है। पिपेट टिप के साथ किसी भी हवा के बुलबुले निकालें। कोशिका आसंजन को प्रभावित करने वाले कारकों के साथ स्थिरता बनाए रखना महत्वपूर्ण है, इसलिए बफ़र्स और कोशिकाओं को 37 डिग्री पर रखें, और बफर को कक्ष में पाइपिंग करते समय अत्यधिक बल का उपयोग करने से बचें।माइक्रोस्कोप चरण के लिए स्लाइड क्लैंप, और कनेक्टर टुकड़ा से तरल टयूबिंग के अचिह्नित पक्ष को हटा दें। फिर, माइग्रेशन बफर के साथ ट्यूबिंग के अंत को तब तक भरें जब तक कि हवा के बुलबुले के बिना सकारात्मक मेनिस्कस अंत से बाहर नहीं निकलता है। टयूबिंग के अंत को पलटें, और इसे प्रवाह कक्ष के शीर्ष कुएं में डालें।टयूबिंग को क्लैंप करते समय, टयूबिंग के चिह्नित अंत के लिए प्रक्रिया दोहराएं। अब, इमेजिंग सिस्टम को लाइव मोड पर स्विच करें, और स्लाइड के बीच में देखने के क्षेत्र का चयन करें। यहां, कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करें, और फिर कोशिकाओं की काली रूपरेखा को बढ़ाने और एक सफेद इंटीरियर का उत्पादन करने के लिए थोड़ा ध्यान केंद्रित करें।ब्लैक बैकग्राउंड और वाइट सेंटर को ऑटोमेटेड ट्रैकिंग प्रोग्राम में इस्तेमाल करना आसान होगा । इमेजिंग अनुक्रम कार्यक्रम सेट करने के लिए एक 10x शुष्क उद्देश्य का उपयोग कर 30 मिनट के लिए हर पांच सेकंड में एक छवि रिकॉर्ड । फिर, रिकॉर्डिंग शुरू करें।टयूबिंग से क्लैंप निकालें, और पंप चालू करें। इससे गैर-अनुयायी कोशिकाएं धुल जाएंगी और अनुयायी कोशिकाएं पलायन शुरू कर देंगी । इमेजिंग कार्यक्रम के अंत में, लेबल और फिल्म को बचाने के लिए।यदि एक अवरोधक या सेल माइग्रेशन के संशोधक का उपयोग कर रहे हैं, तो इसे स्लाइड पर या तरल पदार्थ इकाई में माइग्रेशन बफर में डालने से पहले सेल निलंबन में कोशिकाओं में जोड़ा जा सकता है। स्वचालित माइग्रेशन ट्रैक विश्लेषण शुरू करने के लिए, इमेजजे कार्यक्रम खोलें। MTrack2_kt जावा फ़ाइल को इमेजजे प्लगइन्स फोल्डर पर कॉपी करें।प्लगइन्स मेनू के तहत, कंपाइल और रन का चयन करें। फिर, इमेजजे को फिर से शुरू करें, और प्लगइन प्लगइन मेनू में दिखाई देना चाहिए। इमेजजे में सेल माइग्रेशन मूवी से इमेज स्टैक खोलें, और वीडियो को कलर फ्रेम से हाई-कंट्रास्ट इमेज में बदलने के लिए यहां दिखाए गए इमेज को प्रोसेस करें, जिसमें कोशिकाओं को सफेद बैकग्राउंड पर ब्लैक ऑब्जेक्ट्स के रूप में दिखाया गया है ।इसके बाद, छवियों को दो बार तेज करें, छवियों को तुच्छ करें, और फिर छवियों को आठ बिट में परिवर्तित करें। इमेज मेन्यू में एडजस्ट ब्राइटनेस/कंट्रास्ट सबमेनू पर जाएं और कंट्रास्ट स्लाइडर को मैक्सिमम कंट्रास्ट पर रखें । यह कोशिकाओं को एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर सफेद वस्तुओं के रूप में दिखाई देगा।फिर, यह सुनिश्चित करने के लिए समायोजित थ्रहोल्ड सबमेन्यू पर वापस जाएं कि कोशिकाएं सफेद पृष्ठभूमि पर काली वस्तुओं के रूप में दिखाई दें। अब, स्वचालित सेल ट्रैकिंग प्लगइन MTrack2 kt चलाएं। ऑप्शंस स्क्रीन पर पार्टिकल साइज को मिनिमम टू वन पिक्सल और पार्टिकल साइज अधिकतम 30 पिक्सल सेट करें ।वेग मूल्य को 10 पिक्सल तक सेट करें, हालांकि सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाएं आम तौर पर लगातार फ्रेम पर दो पिक्सेल से अधिक नहीं होंगी जो पांच सेकंड के अलावा हैं। सेल ट्रैक अब आईदी केमोटैक्सिस टूल का उपयोग करके विश्लेषण के लिए तैयार हैं। ये दोनों क्षेत्र सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं के प्रवास पथ दिखाते हैं जो ICAM-1-लेपित स्लाइड पर वरीयता प्राप्त थे ।इस लेख में वर्णित तरीकों का उपयोग करके कोशिकाओं को MTrack2 के साथ स्वचालित रूप से ट्रैक किया गया था। बाईं ओर, कोशिकाओं को स्थिर परिस्थितियों में चित्रित किया गया था, और दाईं कोशिकाओं पर चार डाइन प्रति वर्ग सेंटीमीटर के कतरनी प्रवाह के संपर्क में थे। प्रत्येक फिल्म के ट्रैक प्लॉट उत्पन्न करने के लिए व्यक्तिगत सेल ट्रैक को आईडीआई केमोटैक्सिस टूल में आयात किया जा सकता है।यहां, व्यक्तिगत सेल पटरियों लाल रंग के लिए संकेत मिलता है कि वे अपने मूल बिंदु या काले रंग के नीचे समाप्त अगर वे ऊपर समाप्त हो रहे हैं । दोनों प्रवाह और कोई प्रवाह की स्थिति के लिए चार व्यक्तिगत फिल्मों से सेल पटरियों का विश्लेषण यहां दिखाया गया है । इसमें औसत दिशात्मक माइग्रेशन इंडेक्स, सेल वेग, पथ सीधापन और दोनों स्थितियों के लिए अंतिम सीधी-रेखा की दूरी शामिल है।इस वीडियो को देखने के बाद, आपको इस बात की अच्छी समझ होनी चाहिए कि सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं के दिशात्मक प्रवास को कतरनी प्रवाह की ओर कैसे छवि बनाया जाए और कोशिकाओं को स्वचालित रूप से कैसे ट्रैक किया जाए। इस प्रक्रिया के दौरान, अतिरिक्त सवालों के जवाब देने के लिए टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी जैसे अन्य तरीकों का प्रदर्शन किया जा सकता है, जैसे कि साइटोस्केलेटन और इंटीग्रीन कतरनी तनाव का जवाब कैसे देते हैं?

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

बी कोशिकाओं की CD40 सक्रियण के murine मॉडल

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

मानव टी लिम्फोसाइट अलगाव, और प्रवासन की संस्कृति विश्लेषण इन विट्रो में</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

प्रेरण और murine बी कक्ष शुद्ध में कक्षा स्विच पुनर्संयोजन के मूल्यांकन

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

प्रतिरक्षा कोशिकाओं के भीतर murine aortas Cytometry विश्लेषण फ्लो

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

एचआईवी-1 कोर की इन विट्रो Uncoating में

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Murine मसूड़ा कोशिकाओं के अलगाव, प्रोसेसिंग और विश्लेषण

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

PNA मछली द्वारा माउस बी लिम्फोसाइटों में क्रोमोजोम aberrations के तेजी से विश्लेषण

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

ग्रुप &#39;बी&#39; के एक murine मॉडल<em&gt; स्ट्रेप्टोकोकस</em&gt; योनि औपनिवेशीकरण

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

का पता लगाने और दुर्लभ के संवर्धन विशिष्ट प्रतिजन phenotype और समारोह के विश्लेषण के लिए बी कोशिकाओं

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

इन विट्रो में एक उपंयास घाव हीलिंग परख सेल प्रवासन का मूल्यांकन करने के लिए

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...