Name: analysis of shear flow-induced migration of murine marginal zone b cells in vitro
Uploaded: 2018-11-26T15:00:00
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Este trabalho foi apoiado por concessões do "Deutsche Forschungsgemeinschaft" SFB 854/TP11 para K.-D.F.

Todos os experimentos envolvendo o uso de animais foram previamente aprovados pelo Landesverwaltungsamt Halle (Saxónia-Anhalt), Alemanha, em conformidade com todas as orientações da faculdade de medicina da Universidade OVGU de Magdeburg.
1. MZB célula purificação
<ol><li>
Isole os leucócitos.
	<ol>
<li>Sacrificar um 8 a 16 semanas de mouse e remover o baço16. Dissociar o baço em 5 mL de tampão de cela gelada [tampão fosfato salino (PBS) + ...

<ol>
	<li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).</li><li>Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direction+of+migration+of+T-lymphocytes+under+flow+depends+upon+which+adhesion+receptors+are+engaged.">The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged.</a> Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).</li><li>Steiner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+for+endothelial+ICAM-1,+ICAM-2,+and+VCAM-1+in+shear-resistant+T+cell+arrest,+polarization,+and+directed+crawling+on+blood-brain+barrier+endothelium.">Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium.</a> Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).</li><li>Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocytes+orient+against+the+direction+of+fluid+flow+during+LFA-1-mediated+migration.">T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration.</a> Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).</li><li>Woolf, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+chemokines+promote+sustained+T+lymphocyte+motility+without+triggering+stable+integrin+adhesiveness+in+the+absence+of+shear+forces.">Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces.</a> Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).</li><li>Cinamon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+1-phosphate+receptor+1+promotes+B+cell+localization+in+the+splenic+marginal+zone.">Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone.</a> Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).</li><li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport.">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).</li><li>Cyster, J. G., Schwab, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+and+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs.">Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).</li><li>Schwab, S. R., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+way+out:+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs.">Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).</li><li>Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginal+zone+B+cells:+virtues+of+innate-like+antibody-producing+lymphocytes.">Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).</li><li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+spleen.">Structure and function of the spleen.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li><li>Tedford, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opposing+forces+of+shear+flow+and+sphingosine-1-phosphate+control+marginal+zone+B+cell+shuttling.">The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling.</a> Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).</li><li>ImageJ. MTrack2 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/MTrack2">https://imagej.net/MTrack2</a> (2018)</li><li>. MTrack2 Available from: <a target="_blank" href="https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html">https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html</a> (2018)</li><li>. Chemotaxis and Migration Tool Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html">https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html</a> (2018)</li><li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+lymphoid+organs.">Removal of lymphoid organs.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>. Manual Tracking Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html</a> (2018)</li><li>. ibidi Pump System Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html">https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html</a> (2018)</li></ol>

Descrevemos aqui um método para analisar a migração de células que a força de cisalhamento do fluxo de detectar e responder, alterando sua migração. Uma análise de MZBs mostrou que MZBs migrar espontaneamente no ICAM-1 e na presença de fluxo, migrará o fluxo. No nosso trabalho anterior, mostramos que MZBs não migrar o fluxo na VCAM-1, mas em vez disso, permanecem fixos no lugar. A zona marginal esplênica murino contém principalmente a ICAM-1, enquanto a polpa vermelha contém ICAM-1 e VCAM-1. A partir desses...

Células do sistema imune são as células mais motile no organismo humano e muitas vezes têm que lidar com a força de cisalhamento do fluxo de sangue e da linfa. No entanto, existem relativamente poucos estudos sobre a migração induzida por força de cisalhamento de leucócitos1,2,3,4,5. Apresentamos aqui um protocolo confiável e quantitativo para analisar a resposta de uma célula imune ao fluxo in vitro. Realizar o ensaio não exige a fabricação de componentes, e todos os equipamentos e bens de consumo estão disponíveis comercialmente. O protocolo, incluindo análise de purificação e migração de células, pode ser executado em um único dia. Finalmente, embora descrevemos a migração de células B de zona marginal (MZBs), o protocolo pode ser adaptado para analisar a migração contra fluxo de outros tipos de células do sistema imunológico. Portanto, é possível usar este teste para analisar sistematicamente uma ampla gama de leucócitos com um painel abrangente das condições.
MZBs são uma população de células B que, no rato, são encontrados apenas no baço e no serviço de transporte entre o interior dos folículos e as zonas marginais6,7,8,9. A zona marginal é uma camada de células imunitárias aproximadamente 5 a 10 células grossas. A camada de células envolve o folículo e consiste principalmente de MZBs e macrófagos, mas também invariável naturais assassinos (iNKT) as células T, células dendríticas (DCs) e os neutrófilos, entre outros10. As células da zona marginal são expostas ao fluxo unidirecional de sangue provenientes de artérias esplênica que terminam em um seio marginal ao redor do folículo. O sangue flui de buracos no seio marginal através da zona marginal é coletado em seios venosos na polpa vermelha e restaurado para a circulação de11. O fluxo livre do sangue lava sobre os MZBs e expõe-los aos antígenos transportados no sangue. Os MZBs carregam o antígeno para o folículo por vaivém automaticamente entre a zona marginal e dentro do folículo, o que não é exposto ao sangue. Assim, como MZBs shuttle para o folículo, eles devem migrar da força de cisalhamento do fluxo de sangue12 (figura 1A).
Neste protocolo, descrevemos como determinar quantitativamente como imune as células tais como MZBs responder sem fluxo ou fluxo elevado in vitro, a fim de revelar como eles são programados para migrar em vivo. Na primeira etapa, MZBs são purificados de um baço de rato usando grânulos magnéticos acoplados aos anticorpos de kits disponíveis comercialmente. Os MZBs recentemente isoladas são introduzidos dentro do poço de um slide de câmara de fluxo, permitiu resolver para ligantes integrina e expostos ao fluxo de buffer de migração usando um sistema de bomba (Figura 2A). As células são fotografadas usando um sistema de Time-Lapse vídeo microscopia. As imagens são então processadas para análise com um plugin grátis ImageJ,13,MTrack214, para controlar automaticamente as células. Faixas em seguida podem ser quantificadas com o livre Ibidi quimiotaxia ferramenta15 para determinar vários parâmetros, incluindo velocidade, retidão e índice de migração. Estes valores podem ser usados para determinar os efeitos de inibidores de migração, estimuladores de célula, quimiocinas e outros produtos químicos que afetam a migração para a migração de cisalhamento-fluxo induzido a fim de compreender as forças que controla o movimento de células imunes in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZB and FOB cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-366</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103206</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD21 / CD 35, clone 7G6, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558658</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23, clone B3B4, PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS 1x</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA albumin fraction V, fatty acid-free</td>
			<td>Roth</td>
			<td>&#34;0052.3&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>796-IC-050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi &#181;-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10963</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Pump system</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of shear flow-induced migration of murine marginal zone b cells in vitro

Células B de zona marginal (MZBs) são uma população de células B que residem nas zonas marginal esplênica rato que envolvem os folículos. Para alcançar os folículos, MZBs deve migrar da força de cisalhamento do fluxo de sangue. Apresentamos aqui um método para analisar essa migração de MZB fluxo induzido in vitro. Primeiro, MZBs são isolados do baço de rato. Em segundo lugar, MZBs são liquidadas no integrina ligands em slides de câmara de fluxo, expostos ao fluxo de cisalhamento e fotografadas sob um microscópio durante a migração. Em terceiro lugar, imagens de MZBs a migração são processadas usando a célula automática MTrack2 plugin de rastreamento para ImageJ, e as faixas de célula resultante são quantificadas utilizando a ferramenta de quimiotaxia Ibidi. Os dados de migração revelam quão rápido as células mover, quantas vezes eles mudam de direção, se o vetor de fluxo de distorção afeta sua direção de migração e quais integrina ligantes estão envolvidos. Embora nós usamos MZBs, o método pode ser facilmente adaptado para a análise de migração de qualquer leucócito que responde à força de cisalhamento do fluxo.

Usamos o protocolo descrito acima, para comparar a migração de MZBs em slides de ICAM-1-revestido sem fluxo (0 dyn/cm2) e exposto para distorcer o fluxo (4 dyn/cm2). As células foram rastreadas automaticamente com MTrack2 e a faixa resultante arquivos foram sobrepostos sobre os filmes de migração celular de nenhum fluxo (0 dyn/cm2) e (4 dyn/cm2) para mostrar a distribuição e a forma das faixas (Figura 4A). Fa...

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Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Células B de zona marginal (MZBs) respondem à força de cisalhamento do fluxo por reorientar seu caminho de migração o fluxo. Este protocolo mostra como gravar e analisar a migração usando uma unidade de fluidics, bomba, sistema de imagem de microscópio e software livre.

Análise de cisalhamento induzida pelo fluxo de migração de murino Marginal Zone B células In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Este método pode ajudar a entender questões-chave no campo de migração de células imunes, como como o citoesqueleto envia forças de cisalhamento e como ligantes integrin e quimiocinas afetam a migração induzida pelo fluxo de leucócitos. A principal vantagem dessa técnica é que é um novo tipo de ensaio migratório que é fácil para iniciantes realizarem. Ele usa apenas equipamentos e reagentes disponíveis comercialmente, bem como software livre.Embora este método possa fornecer informações sobre células marginais da zona B, ele também pode ser aplicado a outras células imunes, como células T ativadas. No dia anterior ao experimento, descongele uma alíquota do ICAM-1, e dilui-o na PBS para uma concentração final de cinco microgramas por mililitro. Em seguida, adicione 30 microliters de ICAM-1 às câmaras desejadas de um slide de fluxo.Coloque o slide em uma câmara úmida, e coloque-o a quatro graus Celsius para incubar durante a noite. No dia seguinte, lave a câmara adicionando 100 microliters de PBS a um poço e, em seguida, retirando 100 microliters do outro poço da câmara. Em seguida, adicione 100 microliters de tampão de bloqueio a uma câmara e incubar o slide em uma câmara úmida à temperatura ambiente por 90 minutos.Em seguida, lave a câmara adicionando 100 microliters de PBS a um poço, retirando-a do outro poço, e, em seguida, adicione 100 microliters de tampão de migração à câmara. O slide está pronto para usar. Guarde-o em uma câmara úmida à temperatura ambiente até o experimento.Primeiro, conecte uma bomba de fluido e conecte a unidade fluidica. Em seguida, ligue o software da bomba. Em seguida, lave a tubulação uma vez com cinco a dez mililitros de tampão de migração.Isso vai levar cerca de um minuto. Em seguida, adicione 11,7 mililitros de tampão de migração igualmente aos dois reservatórios e remova as bolhas de ar. Agora, aperte a tubulação cerca de 10 centímetros da peça do conector, e coloque a unidade fluida na câmara de incubação aquecida no microscópio.No software, defina a opção slide para micro-slide VI 0.4 e a opção de tubulação para branco. Além disso, defina o estresse de tesoura desejado para cerca de quatro dynes por centímetro quadrado e o tempo de imagem para 30 minutos. Em seguida, defina a taxa de fluxo desejada e o estresse da cisalhamento inserindo os valores no software da bomba.Em seguida, pré-aqueça a câmara de incubação de microscópio, a unidade fluidica e as alíquotas de buffer de migração a 37 graus Celsius. Uma vez quente, teste a bomba fluida, garantindo que o tampão migratório flua para frente e para trás nos reservatórios e que não haja bolhas de ar no sistema. Primeiro, isole os leucócitos e purifique as células marginais da zona B, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.Em seguida, limpe a parte inferior do slide com um tecido umedecido com etanol. Adicione 30 microliters da suspensão celular em um poço da câmara e retire 30 microliters do buffer de migração armazenado do outro poço. Cubra o slide e incuba-o por 30 minutos para permitir que as células se conectem.Em seguida, adicione lentamente o buffer de migração pré-aquecido a cada poço do slide até que um menisco positivo saia do poço. Remova as bolhas de ar com a ponta da pipeta. É importante manter a consistência com fatores que afetam a adesão celular, por isso mantenha os buffers e as células a 37 graus, e evite usar força excessiva ao canalizar o tampão para dentro da câmara.Aperte o slide até o estágio do microscópio e remova o lado não marcado da tubulação fluida da peça do conector. Em seguida, encha o final da tubulação com tampão de migração até que um menisco positivo sem bolhas de ar saia do final. Vire a extremidade da tubulação e insira-a no poço superior da câmara de fluxo.Mantendo a tubulação presa, repita o procedimento para a extremidade marcada da tubulação. Agora, mude o sistema de imagem para o modo Live e selecione um campo de visão que está no meio do slide. Aqui, defina o foco nas células e, em seguida, desfoque ligeiramente para melhorar o contorno preto das células e produzir um interior branco.O fundo preto e o centro branco serão mais fáceis de usar no programa de rastreamento automatizado. Configure o programa de sequência de imagens para gravar uma imagem a cada cinco segundos durante 30 minutos usando um objetivo seco de 10x. Então, comece a gravar.Retire o grampo da tubulação e ligue a bomba. Isso fará com que as células não aderentes se lavem e as células aderentes comecem a migrar. No final do programa de imagem, rotule e salve o filme.Se usar um inibidor ou um modificador da migração celular, ele pode ser adicionado às células da suspensão celular antes de colocá-las no slide ou no tampão de migração na unidade fluidica. Para iniciar a análise automática da faixa de migração, abra o programa ImageJ. Copie o arquivo MTrack2_kt Java para a pasta ImageJ Plugins.No menu Plugins, selecione Compilar e Executar. Em seguida, reinicie ImageJ e o plugin deve aparecer no menu Plugins. Abra a pilha de imagens do filme de migração celular no ImageJ, e processe as imagens como mostrado aqui, a fim de converter o vídeo de quadros de cores em imagens de alto contraste mostrando as células como objetos pretos em um fundo branco.Em seguida, afie as imagens duas vezes, despeckle as imagens e, em seguida, converta as imagens em oito bits. No menu Imagem, vá para o submenu Ajustar brilho/contraste e coloque o controle deslizante Contraste em contraste máximo. Isso fará com que as células apareçam como objetos brancos em um fundo preto.Em seguida, volte ao submenu Ajuste limiar para garantir que as células apareçam como objetos pretos em um fundo branco. Agora, execute o plugin automático de rastreamento de células MTrack2 kt. Na tela de opções, defina o tamanho da partícula mínimo para um pixel e o tamanho da partícula máximo para 30 pixels.Defina o valor de velocidade para 10 pixels, embora as células da zona B marginal geralmente não excedam dois pixels em quadros sucessivos que têm cinco segundos de diferença. As faixas de celular estão agora prontas para análise usando a Ferramenta ibidi Chemotaxis. Esses dois campos mostram os caminhos de migração de células marginais da zona B que foram semeadas em slides revestidos de ICAM-1.As células foram rastreadas automaticamente com o MTrack2 usando os métodos descritos neste artigo. À esquerda, as células eram imagens sob condições estáticas, e nas células direitas eram expostas a um fluxo de cisalhamento de quatro dynes por centímetro quadrado. As faixas de células individuais podem ser importadas para a Ferramenta ibidi Chemotaxis para gerar plots de faixa de cada filme.Aqui, as faixas de células individuais são coloridas de vermelho para indicar que eles terminaram rio abaixo de seu ponto de origem ou preto se eles acabaram rio acima. A análise de faixas celulares de quatro filmes individuais para fluxo e nenhuma condição de fluxo é mostrada aqui. Isso inclui o índice médio de migração direcional, velocidade celular, retidão do caminho e a distância final em linha reta para ambas as condições.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como imaginar a migração direcional das células da zona B marginal em direção ao fluxo de cisalhamento e como rastrear automaticamente as células. Durante esse procedimento, outros métodos como a microscopia DE TIRF podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como o citoesqueleto e os integrins respondem ao estresse da cisalhamento?

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