Name: analysis of shear flow-induced migration of murine marginal zone b cells in vitro
Uploaded: 2018-11-26T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la "Deutsche Forschungsgemeinschaft" SFB 854/TP11 a K.-D.F.

Todos los experimentos que implican el uso de animales han sido aprobados previamente por el Landesverwaltungsamt Halle (Sajonia-Anhalt), Alemania, según todas las pautas de la Facultad de medicina de la Universidad de Magdeburg de OVGU.
1. purificación de células MZB
<ol><li>
Leucocitos aislados.
	<ol>
<li>Sacrificar un 8 a 16 semanas de edad ratón y quitar el bazo16. Disociar el bazo en 5 mL de tampón de celda helada [solución salina tamponada...

<ol>
	<li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).</li><li>Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direction+of+migration+of+T-lymphocytes+under+flow+depends+upon+which+adhesion+receptors+are+engaged.">The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged.</a> Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).</li><li>Steiner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+for+endothelial+ICAM-1,+ICAM-2,+and+VCAM-1+in+shear-resistant+T+cell+arrest,+polarization,+and+directed+crawling+on+blood-brain+barrier+endothelium.">Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium.</a> Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).</li><li>Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocytes+orient+against+the+direction+of+fluid+flow+during+LFA-1-mediated+migration.">T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration.</a> Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).</li><li>Woolf, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+chemokines+promote+sustained+T+lymphocyte+motility+without+triggering+stable+integrin+adhesiveness+in+the+absence+of+shear+forces.">Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces.</a> Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).</li><li>Cinamon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+1-phosphate+receptor+1+promotes+B+cell+localization+in+the+splenic+marginal+zone.">Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone.</a> Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).</li><li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport.">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).</li><li>Cyster, J. G., Schwab, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+and+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs.">Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).</li><li>Schwab, S. R., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+way+out:+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs.">Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).</li><li>Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginal+zone+B+cells:+virtues+of+innate-like+antibody-producing+lymphocytes.">Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).</li><li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+spleen.">Structure and function of the spleen.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li><li>Tedford, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opposing+forces+of+shear+flow+and+sphingosine-1-phosphate+control+marginal+zone+B+cell+shuttling.">The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling.</a> Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).</li><li>ImageJ. MTrack2 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/MTrack2">https://imagej.net/MTrack2</a> (2018)</li><li>. MTrack2 Available from: <a target="_blank" href="https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html">https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html</a> (2018)</li><li>. Chemotaxis and Migration Tool Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html">https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html</a> (2018)</li><li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+lymphoid+organs.">Removal of lymphoid organs.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>. Manual Tracking Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html</a> (2018)</li><li>. ibidi Pump System Available from: <a target="_blank" href="https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html">https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html</a> (2018)</li></ol>

Aquí describimos un método para el análisis de la migración de las células que detectan la fuerza de esquileo del flujo y responde modificando su migración. Un análisis de MZBs demostró que MZBs migran espontáneamente en ICAM-1 y en presencia de flujo, migrará el flujo. En nuestro trabajo anterior, mostramos que MZBs no migrar el flujo en VCAM-1, pero en cambio permanecen fijos en su lugar. La zona marginal esplénica murina contiene principalmente ICAM-1, mientras que la pulpa roja contiene ICAM-1 y VCAM-1. De...

Las células inmunes son las células más móviles del cuerpo humano y a menudo deben lidiar con la fuerza de esquileo del flujo sanguíneo y linfático. Sin embargo, hay relativamente pocos estudios sobre la migración de inducida por la fuerza de esquileo de leucocitos1,2,3,4,5. Aquí presentamos un protocolo confiable y cuantitativo para analizar la respuesta de una célula inmune al flujo in vitro. Realizar el análisis no requiere la fabricación de componentes, y todos los equipos y consumibles están comercialmente disponibles. El protocolo, incluyendo análisis de la depuración y migración de la célula, se puede realizar en un solo día. Finalmente, aunque se describe la migración de células B de zona marginal (MZBs), se puede adaptar el protocolo para analizar la migración contra flujo de otros tipos de células inmunes. Por lo tanto, es factible utilizar este ensayo para analizar sistemáticamente una amplia gama de los leucocitos con un panel amplio de condiciones.
MZBs son una población de células B que en el ratón, sólo se encuentran en el bazo y el transporte entre el interior de los folículos y los marginales6,7,8,9. La zona marginal es una capa de células de células inmunitarias aproximadamente 5 – 10 gruesas. La capa de la célula envuelve el folículo y consta principalmente de MZBs y macrófagos, pero también invariantes naturales killer (iNKT) las células T, células dendríticas (DCs) y neutrófilos, entre otros10. Las células de la zona marginal se exponen al flujo unidireccional de sangre procedentes de las arterias esplénicas que terminan en un seno marginal que rodea el folículo. La sangre fluye de los orificios en el seno marginal a través de la zona marginal es recopilada en los senos venosos de la pulpa roja y restaurada la circulación11. El libre flujo de la sangre lava sobre el MZBs y expone a los antígenos en la sangre. El MZBs llevan el antígeno en el folículo por trasladar automáticamente entre la zona marginal y el interior del folículo, que no está expuesto a la sangre. Así, como lanzadera de MZBs hacia el folículo, debe migrar la fuerza de esquileo del flujo arterial12 (figura 1A).
En este protocolo, se describe cómo determinar cuantitativamente cómo las células inmune tales como MZBs respuesta in vitro de alto flujo o no flujo, para revelar cómo están programados para migrar en vivo. En el primer paso, MZBs son purificadas de un bazo de ratón mediante bolas magnéticas acopladas a anticuerpos de kits disponibles en el mercado. MZBs recientemente aisladas son introducidos en el pozo de una diapositiva de la cámara de flujo, les permitió asentarse en ligandos de integrinas y expuestas al flujo del tampón de migración usando un sistema de bomba (figura 2A). Las células son imágenes mediante un sistema de microscopia video Time-lapse. Las imágenes son luego procesadas para el análisis con un plugin gratuito de ImageJ, MTrack213,14, para seguir automáticamente las células. Las pistas pueden cuantificarse entonces la libre Ibidi quimiotaxis herramienta15 para determinar varios parámetros como velocidad, rectitud y el índice de migración. Estos valores pueden utilizarse para determinar los efectos de los inhibidores de la migración, estimuladores de células, quimiocinas y otros productos químicos que afectan la migración en la migración de esquileo del flujo inducido para entender las fuerzas que controlan el movimiento de células inmunitarias en vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainer, 70 &#181;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-656</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters, 30 &#181;m</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZB and FOB cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-100-366</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103206</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD21 / CD 35, clone 7G6, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558658</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23, clone B3B4, PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101608</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS 1x</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA albumin fraction V, fatty acid-free</td>
			<td>Roth</td>
			<td>&#34;0052.3&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>796-IC-050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi &#181;-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10963</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi Pump system</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of shear flow-induced migration of murine marginal zone b cells in vitro

Las células de la zona marginal B (MZBs) son una población de células B que residen en las zonas marginal esplénicas de ratón que envuelven los folículos. Para llegar a los folículos, MZBs debe migrar la fuerza de esquileo del flujo de sangre. Aquí presentamos un método para el análisis de esta migración MZB fluir-inducido in vitro. En primer lugar, MZBs están aislados del bazo de ratón. En segundo lugar, MZBs son colocados en ligandos de integrinas en diapositivas cámara de flujo, expuestas al flujo del esquileo y fotografiadas con un microscopio al migrar. En tercer lugar, imágenes de las migración MZBs son procesados utilizando la célula automática MTrack2 seguimiento de plugin de ImageJ y las pistas de la célula resultante se cuantifican utilizando la herramienta de quimiotaxis Ibidi. Los datos de migración revelan cómo rápidamente las células mueven, con qué frecuencia cambian de dirección, si el vector de flujo afecta la dirección de migración y que ligandos de integrinas están involucrados. Aunque utilizamos MZBs, el método puede ser fácilmente adaptado para el análisis de migración de ningún leucocito que responde a la fuerza de esquileo del flujo.

Se utilizó el protocolo descrito para comparar la migración de MZBs en portaobjetos recubiertos con ICAM-1 sin flujo (0 dyn/cm2) y expuestos a esfuerzo cortante flujo (4 dyn/cm2). Las células fueron seguidas automáticamente con MTrack2 y la pista que archivos eran overlaid en las películas de migración celular de no flujo (0 dyn/cm2) y (4 dyn/cm2) para mostrar la distribución y forma de las pistas (Figura 4A)...

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Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Las células de la zona marginal B (MZBs) responden a la fuerza de esquileo del flujo por reorientar su ruta de migración el flujo. Este protocolo muestra cómo grabar y analizar la migración utilizando una unidad de fluidos, bomba, sistema de proyección de imagen del microscopio y software libre.

Análisis de cortante inducida por el flujo de migración de las células B de zona Marginal de Murine In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Este método puede ayudar a entender las preguntas clave en el campo de migración de células inmunitarias, como cómo el citoesqueleto envía fuerzas cortantes y cómo los ligandos de integrina y las quimioquinas afectan la migración inducida por el flujo de leucocitos. La principal ventaja de esta técnica es que es un nuevo tipo de ensayo de migración que es fácil de realizar para los principiantes. Utiliza sólo equipos y reactivos disponibles comercialmente, así como software libre.Aunque este método puede proporcionar información sobre las células de la zona marginal B, también se puede aplicar a otras células inmunitarias, como las células T activadas. El día antes del experimento, descongelar una alícuota de ICAM-1, y diluirla en PBS a una concentración final de cinco microgramos por mililitro. A continuación, añada 30 microlitros de ICAM-1 a las cámaras deseadas de un portaobjetos de flujo.Coloque el deslizamiento en una cámara húmeda y colóquelo en cuatro grados Celsius para incubar durante la noche. Al día siguiente, lave la cámara añadiendo 100 microlitros de PBS a un pozo y luego retirando 100 microlitros del otro pozo de la cámara. A continuación, agregue 100 microlitros de tampón de bloqueo a una cámara e incubar el portaobjetos en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 90 minutos.A continuación, lave la cámara añadiendo 100 microlitros de PBS a un pozo, retirándola del otro pozo, y luego agregue 100 microlitros de búfer de migración a la cámara. La diapositiva ya está lista para su uso. Guárdelo en una cámara húmeda a temperatura ambiente hasta el experimento.En primer lugar, conecte una bomba de fluidos y conecte la unidad de fluidos. A continuación, encienda el software de la bomba. A continuación, lave el tubo una vez con cinco a 10 mililitros de búfer de migración.Esto tomará alrededor de un minuto. A continuación, agregue 11,7 mililitros de búfer de migración por igual a ambos depósitos y elimine las burbujas de aire. Ahora, sujete el tubo a unos 10 centímetros de la pieza del conector y coloque la unidad fluida en la cámara de incubación calentada en el microscopio.En el software, establezca la opción de diapositiva en micro-deslizamiento VI 0.4 y la opción de tubo en blanco. Además, establezca la tensión de cizallamiento deseada en alrededor de cuatro dynes por centímetro cuadrado y el tiempo de imagen a 30 minutos. A continuación, establezca el caudal deseado y la tensión de cizallamiento introduciendo los valores en el software de la bomba.A continuación, precaliente la cámara de incubación del microscopio, la unidad de fluidos y las alícuotas del búfer de migración a 37 grados centígrados. Una vez caliente, pruebe la bomba fluida, asegurándose de que el búfer de migración fluya de ida y vuelta en los depósitos y de que no haya burbujas de aire en el sistema. En primer lugar, aislar los leucocitos y purificar las células marginales de la zona B como se describe en el protocolo de texto que lo acompaña.A continuación, limpie la parte inferior de la diapositiva con un tejido humedecido con etanol. Agregue 30 microlitros de la suspensión celular en un pozo de la cámara y retire 30 microlitros del búfer de migración almacenado del otro pozo. Cubra el portaobjetos e in incubarlo durante 30 minutos para permitir que las células se adhieran.A continuación, agregue lentamente el búfer de migración precalentó a cada pozo de la diapositiva hasta que un menisco positivo salga del pozo. Retire las burbujas de aire con la punta de la pipeta. Es importante mantener la consistencia con los factores que afectan la adhesión de la célula, así que mantenga los búferes y las celdas en 37 grados, y evite el uso de fuerza excesiva al pipetear el búfer en la cámara.Sujete la diapositiva a la etapa del microscopio y retire el lado sin marcar del tubo fluido de la pieza del conector. A continuación, llene el extremo de la tubería con búfer de migración hasta que un menisco positivo sin burbujas de aire se levante del final. Voltee el extremo del tubo e insértelo en el pozo superior de la cámara de flujo.Mientras mantiene el tubo sujeta, repita el procedimiento para el extremo marcado de la tubería. Ahora, cambie el sistema de imágenes al modo Live y seleccione un campo de visión que esté en el centro de la diapositiva. Aquí, establece el foco en las celdas, y luego desenfoca ligeramente para mejorar el contorno negro de las células y producir un interior blanco.El fondo negro y el centro blanco serán más fáciles de usar en el programa de seguimiento automatizado. Configure el programa de secuencia de imágenes para grabar una imagen cada cinco segundos durante 30 minutos utilizando un objetivo seco de 10 veces. A continuación, comience a grabar.Retire la abrazadera del tubo y encienda la bomba. Esto hará que las células no adherentes se laven y las células adherentes comiencen a migrar. Al final del programa de imágenes, etiqueta y guarda la película.Si utiliza un inhibidor o un modificador de migración celular, se puede agregar a las celdas de la suspensión celular antes de colocarlas en la diapositiva o al búfer de migración en la unidad de fluidos. Para comenzar el análisis automático de pistas de migración, abra el programa ImageJ. Copie el archivo Java MTrack2_kt en la carpeta ImageJ Plugins.En el menú Plugins, seleccione Compilar y ejecutar. A continuación, reinicie ImageJ y el complemento debería aparecer en el menú Plugins. Abra la pila de imágenes de la película de migración de celdas en ImageJ y procese las imágenes como se muestra aquí para convertir el vídeo de marcos de color a imágenes de alto contraste que muestran las celdas como objetos negros sobre un fondo blanco.A continuación, afilar las imágenes dos veces, despeckle las imágenes y, a continuación, convertir las imágenes a ocho bits. En el menú Imagen, vaya al submenú Ajustar brillo/contraste y coloque el control deslizante Contraste en el contraste máximo. Esto hará que las celdas aparezcan como objetos blancos sobre un fondo negro.A continuación, vuelva al submenú Ajustar umbral para asegurarse de que las celdas aparecen como objetos negros sobre un fondo blanco. Ahora, ejecute el plugin de seguimiento automático de celdas MTrack2 kt. En la pantalla de opciones, establezca el tamaño de partícula mínimo en un píxel y el tamaño máximo de partícula en 30 píxeles.Establezca el valor de velocidad en 10 píxeles, aunque las celdas de la zona marginal B generalmente no superarán los dos píxeles en fotogramas sucesivos que estén separados por cinco segundos. Las pistas celulares ya están listas para el análisis usando la herramienta ibidi Chemotaxis. Estos dos campos muestran las trayectorias de migración de las células marginales de la zona B que fueron sembradas en las diapositivas recubiertas ICAM-1.Las celdas se realizaron un seguimiento automático con MTrack2 utilizando los métodos descritos en este artículo. A la izquierda, las células fueron escuchadas bajo condiciones estáticas, y en las celdas derechas se expusieron a un flujo de cizallamiento de cuatro dynes por centímetro cuadrado. Las pistas de celda individuales se pueden importar a la herramienta ibidi Chemotaxis para generar trazados de pista de cada película.Aquí, las pistas de celda individuales se colorean de rojo para indicar que terminaron aguas abajo de su punto de origen o negro si terminaron aguas arriba. El análisis de pistas de celda de cuatro películas individuales para el flujo y ninguna condición de flujo se muestra aquí. Esto incluye el índice de migración direccional promedio, la velocidad de la celda, la rectitud de la ruta y la distancia final en línea recta para ambas condiciones.Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo imaginar la migración direccional de las células marginales de la zona B hacia el flujo de cizallamiento y cómo rastrear automáticamente las células. Durante este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía TIRF para responder preguntas adicionales, como ¿cómo responden el citoesqueleto y las integrinas al estrés de cizallamiento?

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