Name: mechanical micronization of lipoaspirates for regenerative therapy
Uploaded: 2019-03-15T13:00:00
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Nationalfonds Natur aus China (81471881, 81601702, 81671931), die naturwissenschaftlichen Grundlage der Provinz Guangdong (2014A030310155) und das Administrator-Stiftung der Nanfang Hospital (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).

Diese Forschung wurde von der ethischen Review Board im Nanfang Krankenhaus, Guangzhou, China genehmigt. Fettgewebe wurde gesammelt, von gesunden Spendern, gab schriftliche Einwilligung zur Teilnahme an der Studie. Alle Tierversuche wurden durch die Nanfang Krankenhaus institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt und durchgeführt nach den Richtlinien des National Health and Medical Research Council (China).
1. ECM/SVF-Gel-Vorbereitung
<ol><li>Ernten Sie Fett.<ol>
<li>Führen Sie ...

<ol>
	<li>Bateman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Fat+to+Fight+Disease:+A+Systematic+Review+of+Non-Homologous+Adipose-Derived+Stromal/Stem+Cell+Therapies.">Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies.</a> Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).</li><li>Baer, P. C., Geiger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+mesenchymal+stromal/stem+cells:+tissue+localization,+characterization,+and+heterogeneity.">Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity.</a> Stem Cells International. , 812693 (2012).</li><li>Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Adipose-derived stem cells for regenerative medicine.</a> Circulation Research. 100 (9), 1249-1260 (2017).</li><li>Halme, D. G., Kessler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA+regulation+of+stem-cell-based+therapies.">FDA regulation of stem-cell-based therapies.</a> New England Journal of Medicine. 355 (16), 1730-1735 (2006).</li><li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grading+lipoaspirate:+is+there+an+optimal+density+for+fat+grafting.">Grading lipoaspirate: is there an optimal density for fat grafting.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (1), 38-45 (2013).</li><li>Qiu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+Centrifuged+Lipoaspirate+Fractions+Suitable+for+Postgrafting+Survival.">Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).</li></ol>

Stammzellbasierte regenerative Therapie hat einen großen potenziellen Nutzen bei verschiedenen Krankheiten gezeigt. ASC sind hervorragende therapeutische Kandidaten, denn sie einfach sind zu erhalten und haben die Kapazität für die Reparatur von Gewebe und die Regeneration der neuartige Gewebe15. Allerdings gibt es Einschränkungen für den Ausbau ihrer klinischen Anwendung, da es komplizierte Verfahren zum Isolieren von Zellen und Kollagenase erfordert für die Verarbeitung von<sup class="xref...

Stammzelltherapien bieten einen Paradigmenwechsel für Gewebereparatur und Regeneration, so dass sie eine alternative therapeutische Regime für verschiedene Krankheiten1anbieten können. Stammzellen (z.B., induzierte pluripotente Stammzellen und embryonale Stammzellen) haben ein großes therapeutisches Potenzial sind aber beschränkt durch Zellregulation und ethische Erwägungen. Adipose abgeleitet mesenchymaler Stromazellen/Stammzellen (ASC) sind leicht zu beschaffen von Lipoaspirate und nicht den gleichen Beschränkungen; so ist es eine ideale Zelltyp für praktische regenerative Medizin2geworden. Darüber hinaus sie sind nonimmunogenic und haben reichlich vorhandenen Ressourcen aus körpereigenem Fett3.
ASC sind derzeit vor allem durch Kollagenase-vermittelten Verdauung des Fettgewebes gewonnen. Die stromale vaskuläre Bruchteil (SVF) von Fettgewebe enthält ASCs, endothelial Progenitor Cell, Perizyten und Immunzellen. Zwar erhalten eine hohe Dichte an SVF/ASC enzymatisch gezeigt wurde, um positive Auswirkungen haben, regelt die Gesetzgebung in verschiedenen Ländern streng die klinische Anwendung der Zell-basierte Produkte, die mit Hilfe von Kollagenase4. Verdauen das Fettgewebe mit Kollagenase für 30 min bis 1 h, SVF Zellen zu erhalten, erhöht das Risiko für beide exogene Material bei der Vorbereitung und biologische Kontamination. Die anhaftende Kultur und die Reinigung des ASC, die Tage bis Wochen dauert, erfordern spezielle Laborgeräte. Darüber hinaus werden in den meisten Studien SVF Zellen und ASC in der Schwebe verwendet. Ohne den Schutz der extrazellulären Matrix (ECM) oder einen anderen Träger freie Zellen sind anfällig, verursachen eine schlechte Zelle Aufbewahrung nach der Injektion und gefährden das therapeutische Ergebnis5. All diese Gründe beschränken die weitere Anwendung der Stammzell-Therapie.
Um ASC aus Fettgewebe ohne Kollagenase-vermittelten Verdauung zu erhalten, wurden verschiedene mechanische Bearbeitung-Verfahren, einschließlich der Zentrifugation, mechanische, hacken, Zerkleinern, pürieren und Zerkleinern, entwickelten6,7 , 8 , 9. diese Methoden werden gedacht, um Gewebe und ASC kondensieren von mechanisch stören Reifen Adipozyten und ihre Öl-haltige Vesikel. Darüber hinaus zeigten diese Zubereitungen, die hohe Konzentrationen von ASC, therapeutische Potenzial als regenerativer Medizin in Tier8,9,10Modelle.
Im Jahr 2013 eingeführt Tonnard Et Al. der Nanofat Technik, die beinhaltet, Herstellung von emulgierten Lipoaspirate durch Intersyringe Verarbeitung11Pfropfen. Erstellt von Intersyringe, die Verlagerung Querkräfte kann selektiv Reifen Adipozyten brechen. Auf der Grundlage ihrer Erkenntnisse entwickelten wir eine rein mechanische Bearbeitung-Methode, die entfernt die meisten Lipid und Flüssigkeit in den Lipoaspirate verlassen nur SVF Zellen und fraktionierte ECM, die ECM/SVF-Gel12ist. Hier beschreiben wir die Details des mechanischen Prozesses der menschlichen abgeleitet Fettgewebe, das ECM/SVF-Gel zu produzieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:733px;" width="734">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4</td>
			<td style="width:232px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">I21411</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">guinea pig anti-mouse perilipin</td>
			<td>Progen</td>
			<td>GP29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">wide tip pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229211B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>TCS SP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nude nice&#160;</td>
			<td>Southern Mdical University</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">light microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL tube</td>
			<td>Cornig</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sterile bag</td>
			<td>Laishi</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microtome</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">centrifuge</td>
			<td>Heraus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical micronization of lipoaspirates for regenerative therapy

Stromale vaskulären Bruch (SVF) ist eine regenerative Werkzeug für verschiedene Krankheiten geworden; Allerdings regelt die Gesetzgebung streng die klinische Anwendung der Zelle Produkte mit Kollagenase. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine injizierbare Mischung aus SVF Zellen und native extrazelluläre Matrix aus Fettgewebe durch ein rein mechanisches Verfahren zu generieren. Lipoaspirate werden in einer Zentrifuge und bei 1.200 X g für 3 min gesponnen. Die mittlere Schicht ist gesammelt und getrennt in zwei Schichten (High-Density Fett unten) und Low-Density Fett auf der Oberseite. Die obere Schicht wird direkt durch das intersyringe verschieben, mit einer Rate von 20 mL/s für 6 X bis 8 X emulgiert. Das emulgierte Fett wird bei 2.000 X g für 3 min zentrifugiert, und die klebrige Substanz unter die Ölschicht gesammelt und definiert als die extrazelluläre Matrix (ECM) / SVF-Gel. Das Öl auf die oberste Schicht wird gesammelt. Ca. 5 mL Öl 15 mL von High-Density Fett hinzugefügt und emulgiert durch intersyringe verschieben, mit einer Rate von 20 mL/s für 6 X bis 8 X. Das emulgierte Fett wird bei 2.000 X g für 3 min zentrifugiert, und die klebrige Substanz ist auch ECM/SVF-Gel. Nach der Transplantation des ECM/SVF-Gels in nude Mäuse ist das Transplantat geerntet und von histologischen Untersuchung bewertet. Das Ergebnis zeigt, dass dieses Produkt das Potenzial hat, in normalen Fettgewebe zu regenerieren. Dieses Verfahren ist eine einfache, effektive mechanische Dissoziation Verfahren die SVF-Zellen eingebettet in ihre natürliche unterstützende ECM für regenerative Zwecke zu kondensieren.

Nach der Verarbeitung der Coleman Fett zu ECM/SVF-Gel, das Volumen der ausrangierten Öl nimmt 80 % des letzten Bandes, und nur 20 % des Fettgewebes unter die Ölschicht erhalten gilt als ECM/SVF-Gel (Abb. 1A). ECM/SVF-Gel hat eine glatte Flüssigkeit-wie Struktur, die es ermöglicht, durch eine feine Nadel 27 G gehen; jedoch Coleman Fett besteht aus einer integralen adipösen Aufbau mit großen Fasern und kann nur durch eine 18 G-Kanüle (<s...

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Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy

Mechanische Mikronisierung von Lipoaspirate für Regenerative Therapie

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Stromazellen vaskulären Bruchteil aus Fettgewebe durch eine Reihe von mechanischen Verfahren erhalten die Emulgierung und mehrere Centrifugations enthalten.

Stromal vascular fraction (SVF) has become a regenerative tool for various diseases; however, legislation strictly regulates the clinical application of ...

Die Gewinnung stromaler Gefäßfraktionen(SVFs) aus Lipoaspiraten erfordert die Verdauung mit Kollagenase, was das Risiko einer biologischen Kontamination erhöht. Es sollte ein besserer Weg entwickelt werden, SVF ohne Kollagenase zu erhalten. Diese Techniken ermöglichen es uns, den SVF in seiner nativen extrazellulären Matrix durch einen einfachen mechanischen Prozess zu erhalten.Demonstriert wird das Verfahren von Xihang Chen, einem Grad-Studenten aus unserem Labor. Nach Erhalt der Fettproben die Lipoaspiraten in eine 50-Milliliter-Röhre geben und das geerntete Fett 10 Minuten ausdemieren lassen. Als nächstes verwenden Sie eine Breitspitzenpipette, um das Fett aus der obersten Schicht des Rohres in ein neues 50-Milliliter-Rohr zu ziehen und das Fett durch Zentrifugation zu verdrehen.Die obere Schicht in der Röhre ist die Coleman-Fettfraktion. Übertragen Sie das obere 2/3 des Coleman-Fetts in eine neue 15-Milliliter-Röhre. Dieser Teil gilt als das Fett mit geringer Dichte.Übertragen Sie das untere Drittel des Coleman-Fetts in eine zweite 15-Milliliter-Röhre. Dieser Teil gilt als das Fett mit hoher Dichte. Um ein extrazelluläres stromales Gefäßfraktionsgel aus dem Fett mit geringer Dichte zu erzeugen, verwenden Sie zwei 20-Milliliter-Spritzen, die von einem weiblichen mit einem weiblichen Luer-Lock-Stecker verbunden sind, um 10 Milliliter des Fetts mit geringer Dichte zu intershift.Dies ist der wichtigste Schritt, um Adipozyten zu zerstören. Die Geschwindigkeit und die Zeit, in der die Interspritzenverschiebung durchgeführt wird, tragen zur Qualität des Endprodukts bei. Nach der letzten Intershift-Sitzung das Fett durch Zentrifugieren sammeln und die obere Ölschicht in ein 15-Milliliter-Rohr übertragen.Dann übertragen Sie die klebrige mittlere extrazelluläre Matrix stromal vaskuläre Fraktion Gelschicht in eine neue 15 Milliliter konische Röhre. Um aus dem Fett mit hoher Dichte ein extrazelluläres stromales Gefäßfraktionsgel zu erzeugen, fügen Sie zwei Milliliter der Ölfraktion mit geringer Dichte zu fünf Millilitern der Fettprobe mit hoher Dichte hinzu. Intershift das gemischte Fett, wie gezeigt, bis ein Flockungsgerät innerhalb der Emulsion beobachtet wird.Sammeln Sie das Flocculate durch Zentrifugation und entsorgen Sie die oberste Ölschicht. Dann sammeln Sie die klebrige mittlere Schicht und mischen Sie diese Fraktion mit der niedrigen Dichte extrazelluläre Matrix stromal vaskuläre Fraktion Gel Probe. Nach der Verarbeitung des Coleman-Fetts zu extrazellulärem vaskulärem Gefäßfraktionsgel nimmt das Volumen des ausrangierten Öls 80 % des Endvolumens auf, und nur 20 % des unter der Ölschicht konservierten Fettgewebes gelten als extrazelluläres, stromales Gefäßfraktionsgel.Extrazelluläre Matrix stromal vaskuläre Fraktion Gel hat eine glatte flüssige Textur, die es ermöglicht, durch eine 27 Gauge feine Nadel passieren. Coleman-Fett besteht jedoch aus einer integralen Fettstruktur mit großen Fasern, die nur durch eine 18 Gauge Kanüle passieren können. Am dritten Tag nach der Transplantation treten eine große Anzahl kleiner Präadipozyten mit mehreren intrazellulären Lipidtröpfchen, umfangreichem gut vaskularisiertem Bindegewebe und infiltrierten Entzündungszellen auf.Ab Dem 15. Tag beginnt die Zahl der entzündlichen Zellen allmählich zu reduzieren, und die Adipozyten beginnen zu reifen. Bis Zum 90. Tag wurde der größte Teil des vaskularisierten Bindegewebes in den Transplantaten durch reife Adipozyten ersetzt. Extrazelluläre vaskuläre vaskuläre Zellfraktion Geltransplantate enthalten auch ein paar Perilipin-positive Adipozyten drei Tage nach der Transplantation, mit kleinen Präadipozyten, mit mehreren intrazellulären Lipidtröpfchen beginnen am Tag 15 erscheinen.Jedes Feld des Tages 90 extrazelluläre Matrix stromal vaskuläre Fraktion Gel Transplantat Abschnitte zeigen zahlreiche Perilipin positive Adipozyten und neu gebildete Blutgefäße. Durchflusszytometrie kann durchgeführt werden, um die zelluläre Population im Produkt zu bestimmen. Und Rasterelektronenmikroskopie kann durchgeführt werden, um die Mikrostruktur des Produkts zu visualisieren.Diese Technik bietet eine einfache Methode für Chirurgen und Forscher, um ein Produkt mit hoher Konzentration von SVF-Zellen mit nativen extrazellulären Matrixfasern aus Fettgewebe zu erhalten.

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