Name: mechanical micronization of lipoaspirates for regenerative therapy
Uploaded: 2019-03-15T13:00:00
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Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione di scienza natura nazionale della Cina (81471881, 81601702, 81671931), il fondamento di scienza naturale della provincia di Guangdong (2014A030310155) e l'amministratore Foundation di Nanfang Hospital (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).

Questa ricerca è stata approvata dal comitato etico recensione in Nanfang Hospital, Guangzhou, Cina. Il tessuto adiposo è stato raccolto da donatori sani che ha dato il consenso informato scritti di prendere parte allo studio. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato di uso e Nanfang Hospital istituzionale Animal Care ed eseguiti secondo le direttive del National Health and Medical Research Council (Cina).
1. preparazione ECM/SVF-gel
<ol><li>Raccogli grasso.<ol...

<ol>
	<li>Bateman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Fat+to+Fight+Disease:+A+Systematic+Review+of+Non-Homologous+Adipose-Derived+Stromal/Stem+Cell+Therapies.">Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies.</a> Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).</li><li>Baer, P. C., Geiger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+mesenchymal+stromal/stem+cells:+tissue+localization,+characterization,+and+heterogeneity.">Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity.</a> Stem Cells International. , 812693 (2012).</li><li>Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Adipose-derived stem cells for regenerative medicine.</a> Circulation Research. 100 (9), 1249-1260 (2017).</li><li>Halme, D. G., Kessler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA+regulation+of+stem-cell-based+therapies.">FDA regulation of stem-cell-based therapies.</a> New England Journal of Medicine. 355 (16), 1730-1735 (2006).</li><li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grading+lipoaspirate:+is+there+an+optimal+density+for+fat+grafting.">Grading lipoaspirate: is there an optimal density for fat grafting.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (1), 38-45 (2013).</li><li>Qiu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+Centrifuged+Lipoaspirate+Fractions+Suitable+for+Postgrafting+Survival.">Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).</li></ol>

Terapia rigenerativa basata su cellule staminali ha mostrato un grande potenziale beneficio in diverse malattie. ASC sono i candidati terapeutici eccezionali perché sono facili da ottenere e avere la capacità di riparazione dei tessuti e la rigenerazione di tessuti romanzo15. Tuttavia, esistono limitazioni ad espandere la sua applicazione clinica, poiché richiede complicate procedure per isolare le cellule e la collagenosi per l'elaborazione di6. Quindi, è essenziale pe...

Terapie con cellule staminali forniscono un cambio di paradigma per la rigenerazione e riparazione tissutale, affinché possano offrire un regime terapeutico alternativo per varie malattie1. Cellule staminali (ad es., cellule staminali pluripotenti indotte e cellule staminali embrionali) hanno un grande potenziale terapeutico, ma sono limitate a causa di regolazione cellulare e considerazioni etiche. Adiposo-derivate mesenchimali stromali/cellule staminali (ASCs) sono facili da ottenere da lipoaspirates e non sono soggetti alle stesse restrizioni; così, è diventata un tipo di cellula ideale per la pratica della medicina rigenerativa2. Inoltre, sono nonimmunogenic e hanno abbondanti risorse da grasso autologo3.
Attualmente, ASC sono ottenute principalmente con la digestione della collagenosi-mediata del tessuto adiposo. La frazione di vascolare stromal (SVF) del tessuto adiposo contiene ASCs, cellule endoteliali progenitrici, periciti e cellule del sistema immunitario. Anche se ottenere un'alta densità di SVF/ASC enzimaticamente è stato indicato per avere effetti benefici, la legislazione in diversi paesi disciplina rigorosamente l'applicazione clinica dei prodotti cellulari utilizzando collagenosi4. Digerendo il tessuto adiposo con collagenasi per 30 min a 1 h per ottenere cellule SVF aumenta il rischio di entrambi materiale esogeno nella preparazione e nella contaminazione biologica. La cultura aderente e la purificazione di ASC, che richiede giorni a settimane, richiede attrezzature specifiche di laboratorio. Inoltre, nella maggior parte degli studi, le cellule SVF e ASC sono utilizzati in sospensione. Senza la protezione della matrice extracellulare (ECM) o un altro vettore, celle libere sono vulnerabili, causare una ritenzione di povera cella dopo l'iniezione e compromettere il risultato terapeutico5. Tutti questi motivi limitare l'ulteriore applicazione della terapia con cellule staminali.
Per ottenere ASCs dal tessuto adiposo senza digestione della collagenosi-mediata, parecchie procedure di lavorazione meccanica, tra cui centrifugazione, meccanica, tagliere, triturazione, sminuzzare e tritare, sono stati sviluppati6,7 , 8 , 9. questi metodi sono pensati per condensare tessuto e ASC interrompendo meccanicamente adipocytes maturi e loro vescicole contenenti olio. Inoltre, queste preparazioni, contenenti elevate concentrazioni di ASC, ha mostrato un notevole potenziale terapeutico come medicina rigenerativa in animale modelli8,9,10.
Nel 2013, Tonnard et al ha introdotto il nanofat innesto tecnica che prevede di produrre emulsionati lipoaspirates intersyringe elaborazione11. La forza di taglio creata da intersyringe spostando in modo selettivo può rompere adipocytes maturi. Basato sui loro risultati, abbiamo sviluppato un metodo di lavorazione puramente meccanici che rimuove la maggior parte del lipido e liquido in lipoaspirates, lasciando solo le cellule SVF ed ECM frazionato, che è ECM/SVF-gel12. Qui, descriviamo i dettagli del processo meccanico di derivazione umana di tessuto adiposo per produrre il ECM/SVF-gel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:733px;" width="734">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4</td>
			<td style="width:232px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">I21411</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">guinea pig anti-mouse perilipin</td>
			<td>Progen</td>
			<td>GP29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">wide tip pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229211B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>TCS SP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nude nice&#160;</td>
			<td>Southern Mdical University</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">light microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL tube</td>
			<td>Cornig</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sterile bag</td>
			<td>Laishi</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microtome</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">centrifuge</td>
			<td>Heraus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical micronization of lipoaspirates for regenerative therapy

Frazione vascolare stromal (SVF) è diventato uno strumento rigenerativo per varie malattie; Tuttavia, la legislazione disciplina rigorosamente l'applicazione clinica dei prodotti delle cellule usando collagenosi. Qui, presentiamo un protocollo per generare una miscela iniettabile di SVF cellule e matrice extracellulare nativa dal tessuto adiposo di un processo puramente meccanico. Lipoaspirates sono messi in una centrifuga e filata a 1.200 x g per 3 min. Lo strato intermedio è raccolto e separato in due strati (ad alta densità grasso nella parte inferiore) e grasso a bassa densità in alto a sinistra. Lo strato superiore è emulsionato direttamente spostando intersyringe, ad un tasso di 20 mL/s per 6 x a 8 x. Il grasso emulsionato viene centrifugato a 2.000 x g per 3 min, e la sostanza appiccicosa sotto lo strato di olio è raccolto e definita come la matrice extracellulare (ECM) / SVF-gel. L'olio sullo strato superiore è raccolto. Circa 5 mL di olio è aggiunto a 15 mL di grasso ad alta densità ed emulsionati spostando intersyringe, ad un tasso di 20 mL/s per 6 x a 8 x. Il grasso emulsionato viene centrifugato a 2.000 x g per 3 min, e la sostanza appiccicosa è anche ECM/SVF-gel. Dopo il trapianto di ECM/SVF-gel in topi nudi, l'innesto è raccolto e valutato da esame istologico. Il risultato mostra che questo prodotto ha il potenziale per rigenerare nel normale tessuto adiposo. Questa procedura è una procedura di dissociazione meccanica semplice ed efficace per condensare le cellule SVF incorporate nel loro naturale ECM solidale per scopi rigenerativi.

Dopo aver elaborato il grasso di Coleman a ECM/SVF-gel, il volume di olio scartato occupa 80% del volume finale, e solo il 20% del tessuto adiposo conservato sotto lo strato di olio è considerato come ECM/SVF-gel (Figura 1A). ECM/SVF-gel ha una consistenza morbida simil-liquido che permette di passare attraverso un ago sottile 27 G; Tuttavia, Coleman grasso è composto da una struttura adiposa integrale con grandi fibre e può passare solo a...

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Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy

Micronizzazione meccanici di Lipoaspirates per la terapia rigenerativa

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere frazione vascolari stromali da tessuto adiposo attraverso una serie di processi meccanici, che includono emulsificazione e centrifugazioni multiple.

Stromal vascular fraction (SVF) has become a regenerative tool for various diseases; however, legislation strictly regulates the clinical application of ...

Ottenere frazioni vascolari stromali, o SVF, dai lipoaspirati richiede digestione con collagenasi, che aumenta il rischio di contaminazione biologica. Dovrebbe essere sviluppato un modo migliore per ottenere SVF senza collagenasi. Queste tecniche ci consentono di ottenere la SVF nella sua matrice extracellulare nativa attraverso un semplice processo meccanico.A dimostrare la procedura sarà Xihang Chen, uno studente laureato del nostro laboratorio. Dopo aver ottenuto i campioni di grasso, trasferire i lipoaspirati in un tubo da 50 millilitri e lasciare che il grasso raccolto equilibra per 10 minuti. Successivamente, utilizzare un'ampia pipetta a punta per estrarre il grasso dallo strato superiore del tubo in un nuovo tubo da 50 millilitri e far girare il grasso per centrifugazione.Lo strato superiore nel tubo è la frazione grassa di Coleman. Trasferire la parte superiore 2/3 del grasso Coleman in un nuovo tubo da 15 millilitri. Questa porzione è considerata il grasso a bassa densità.Trasferire il terzo inferiore del grasso di Coleman in un secondo tubo da 15 millilitri. Questa porzione è considerata il grasso ad alta densità. Per produrre un gel di frazione vascolare vascolare a matrice extracellulare dal grasso a bassa densità, utilizzare due siringhe da 20 millilitri collegate da un connettore di blocco luer femmina a femmina per interrompi 10 millilitri del grasso a bassa densità.Questo è il passo chiave per distruggere gli adipociti. La velocità e il tempo di esecuzione del cambio intersyringe contribuiscono alla qualità del prodotto finale. Dopo l'ultima sessione intershift, raccogliere il grasso per centrifugazione e trasferire lo strato superiore di olio su un tubo da 15 millilitri.Quindi trasferire lo strato di gel della frazione vascolare centrale appiccicosa centrale in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Per produrre un gel di frazione vascolare extracellulare dal grasso ad alta densità, aggiungere due millilitri della frazione dell'olio a bassa densità a cinque millilitri del campione di grasso ad alta densità. Intershift il grasso misto come dimostrato fino a quando non si osserva un flocculato all'interno dell'emulsione.Raccogliere il flocculato per centrifugazione e scartare lo strato superiore di olio. Quindi raccogliere lo strato medio appiccicoso e mescolare questa frazione con il campione di gel per frazioni vascolari vascolari stromali a bassa densità. Dopo aver elaborato il grasso di Coleman in gel di frazione vascolare stromale a matrice extracellulare, il volume dell'olio scartato occupa l'80% del volume finale e solo il 20% del tessuto adiposo conservato sotto lo strato di olio è considerato come gel di frazione vascolare a matrice extracellulare.Il gel di frazione vascolare a matrice extracellulare ha una consistenza liscia simile a un liquido che gli consente di passare attraverso un ago fine calibro 27. Tuttavia, il grasso di Coleman è costituito da una struttura adiposa integrale con grandi fibre che possono passare solo attraverso una cannula calibro 18. Il terzo giorno dopo il trapianto, compaiono un gran numero di pre-adipociti di piccole dimensioni con più goccioline lipidiche intracellulari, ampio tessuto connettivo ben vascolarizzato e cellule infiammatorie infiltrate.A partire dal giorno 15, il numero di cellule infiammatorie inizia a ridursi gradualmente e gli adipociti iniziano a maturare. Al giorno 90, la maggior parte del tessuto connettivo vascolarizzato negli innesti è stato sostituito da adipociti maturi. Gli innesti di gel della frazione vascolare extracellulare contengono anche alcuni adipociti positivi alla perilipina tre giorni dopo il trapianto, con pre-adipociti di piccole dimensioni, con più goccioline lipidiche intracellulari che iniziano ad apparire il giorno 15.Ogni campo del giorno 90 sezioni di innesto di gel vascolare extracellulare della matrice extracellulare mostrano numerosi adipociti positivi perilipin e vasi sanguigni appena formati. La citometria del flusso può essere eseguita per determinare la popolazione cellulare nel prodotto. E la microscopia elettronica a scansione può essere eseguita per visualizzare la microstruttura del prodotto.Questa tecnica fornisce un metodo semplice per chirurghi e ricercatori per ottenere un prodotto ad alta concentrazione di cellule SVF con fibre native a matrice extracellulare dal tessuto adiposo.

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