Name: mechanical micronization of lipoaspirates for regenerative therapy
Uploaded: 2019-03-15T13:00:00
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この作品は (81471881、81601702、81671931) 中国の国家自然科学基金、中国の広東省 (2014A030310155) の管理者南方病院財団 (2014B009、自然科学財団によって支えられました。2015Z002、2016Z010、2016B001)。

この研究は、南方病院、広州、中国の倫理審査委員会によって承認されました。脂肪組織は健康なドナーから与えたインフォームド コンセントを書かれて、研究に参加する収集されました。すべての動物実験は南方病院機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され、国民の健康および医学研究評議会 (中国) のガイドラインに従って実行されます。
1. ECM/SVF-ゲル作製</p...

<ol>
	<li>Bateman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Fat+to+Fight+Disease:+A+Systematic+Review+of+Non-Homologous+Adipose-Derived+Stromal/Stem+Cell+Therapies.">Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies.</a> Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).</li><li>Baer, P. C., Geiger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+mesenchymal+stromal/stem+cells:+tissue+localization,+characterization,+and+heterogeneity.">Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity.</a> Stem Cells International. , 812693 (2012).</li><li>Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Adipose-derived stem cells for regenerative medicine.</a> Circulation Research. 100 (9), 1249-1260 (2017).</li><li>Halme, D. G., Kessler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA+regulation+of+stem-cell-based+therapies.">FDA regulation of stem-cell-based therapies.</a> New England Journal of Medicine. 355 (16), 1730-1735 (2006).</li><li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+intraoperative+procedures+for+isolation+of+clinical+grade+stromal+vascular+fraction+for+regenerative+purposes:+a+systematic+review.">Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).</li><li>van Dongen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractionation+of+adipose+tissue+procedure+to+obtain+stromal+vascular+fractions+for+regenerative+purposes.">The fractionation of adipose tissue procedure to obtain stromal vascular fractions for regenerative purposes.</a> Wound Repair and Regeneration. 24 (6), 994-1003 (2016).</li><li>Mashiko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Micronization+of+Lipoaspirates:+Squeeze+and+Emulsification+Techniques.">Mechanical Micronization of Lipoaspirates: Squeeze and Emulsification Techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (1), 79-90 (2017).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micronized+cellular+adipose+matrix+as+a+therapeutic+injectable+for+diabetic+ulcer.">Micronized cellular adipose matrix as a therapeutic injectable for diabetic ulcer.</a> Regenerative Medicine. 10 (6), 699-708 (2015).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+flap+survival+improvement+by+composition-selective+fat+grafting+with+novel+adipose+tissue+derived+product+-+stromal+vascular+fraction+gel.">Ischemic flap survival improvement by composition-selective fat grafting with novel adipose tissue derived product - stromal vascular fraction gel.</a> Biochemistry and Biophysics Research Communication. 495 (3), 2249-2256 (2018).</li><li>Tonnard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanofat+grafting:+basic+research+and+clinical+applications.">Nanofat grafting: basic research and clinical applications.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 1017-1026 (2013).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Extracellular+Matrix/Stromal+Vascular+Fraction+Gel:+A+Novel+Adipose+Tissue-Derived+Injectable+for+Stem+Cell+Therapy.">Adipose Extracellular Matrix/Stromal Vascular Fraction Gel: A Novel Adipose Tissue-Derived Injectable for Stem Cell Therapy.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (4), 867-879 (2017).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Stromal+Vascular+Fraction+Gel+Grafting:+A+New+Method+for+Tissue+Volumization+and+Rejuvenation.">Adipose Stromal Vascular Fraction Gel Grafting: A New Method for Tissue Volumization and Rejuvenation.</a> Dermatologic Surgery. 44 (10), 1278-1286 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Long-Term+Volume+Retention+of+Stromal+Vascular+Fraction+Gel+Grafting+with+Enhanced+Angiogenesis+and+Adipogenesis.">Improved Long-Term Volume Retention of Stromal Vascular Fraction Gel Grafting with Enhanced Angiogenesis and Adipogenesis.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (5), 676-686 (2018).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+stem+cell-derived+exosomes+in+tissue+engineering+and+neurological+diseases.">Applications of stem cell-derived exosomes in tissue engineering and neurological diseases.</a> Reviews in the Neurosciences. 29 (5), 531-546 (2018).</li><li>Allen, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grading+lipoaspirate:+is+there+an+optimal+density+for+fat+grafting.">Grading lipoaspirate: is there an optimal density for fat grafting.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (1), 38-45 (2013).</li><li>Qiu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+Centrifuged+Lipoaspirate+Fractions+Suitable+for+Postgrafting+Survival.">Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).</li></ol>

幹細胞を用いた再生治療法は、さまざまな病気に大きな潜在的な利点を示しています。簡単に取得し、組織の修復と15新しい組織の再生能力を持っているので、Asc、卓越した治療候補です。ただし、セルおよび6を処理するコラゲナーゼを分離する複雑な手続きを必要とするので、臨床応用を拡大する制限があります。したがって、コラゲナーゼを使用せず?...

幹細胞療法は、様々 な疾患1の代替治療を提供することがありますので、組織の修復・再生のためのパラダイム シフトを提供します。幹細胞 (例えば、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞) は偉大な治療可能性を秘めているが、携帯規制と倫理的配慮により制限されます。脂肪由来間葉系間質/幹細胞 (Asc) は成人と同じ制限を受けないを入手しやすいしたがって、実用的な再生医療2理想的なセルタイプをなっています。加えて、彼らは nonimmunogenic して自家脂肪3から豊富な資源があります。
現在、Asc は、脂肪組織のコラゲナーゼを介した消化によって主に得られます。脂肪組織の間質の血管分数 (SVF) には、Asc、内皮前駆細胞、血管、免疫細胞が含まれています。有益な効果があることが示された酵素によって SVF/Asc の高密度を取得、いくつかの国の法律は厳密にコラゲナーゼ4を使用してセル ベースの製品の臨床応用を調整します。SVF のセルを取得する 1 時間 30 分のコラゲナーゼと脂肪の消化準備し、生物学的汚染両方の外因性物質のリスクが高まります。付着性文化と日を週には、Asc、精製特定の検査機器が必要です。さらに、ほとんどの研究では、懸濁液中の SVF セルと Asc が使用します。細胞外マトリックス (ECM) または別のキャリアの保護がなければフリー セルを受けます、注入後、不良セルの保持を引き起こす、治療結果5を危険にさらします。これらすべての理由は、幹細胞療法のそれ以上の適用を制限します。
コラゲナーゼを介した消化せず脂肪組織から Asc を取得、遠心分離、まな板、破砕、pureeing、ミンチ、機械を含むいくつかの機械的処理は開発6,7をされています。,8,9します。 これらのメソッドは、成熟脂肪細胞とその油を含む小胞を機械的に破壊して組織と Asc を凝縮すると考えられています。また、動物における再生医療モデル8,9,10として、Asc の高濃度を含むこれらの準備はかなり治療の可能性を示した。
2013 年には、Tonnardらは接木処理11intersyringe による乳化成人の生産を含む nanofat を導入しました。Intersyringe シフトによって作成された剪断力は選択的に成熟脂肪細胞を破ることができます。彼らの調査結果に基づいて、我々 SVF 細胞と ECM/SVF-ゲル12分別された ECM だけを残して、成人の脂質と流体のほとんどを削除する純粋に機械的処理方法を開発しました。ここで、ECM/SVF-ゲルを生成するひと由来脂肪組織の機械的なプロセスの詳細について述べる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:733px;" width="734">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4</td>
			<td style="width:232px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">I21411</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">guinea pig anti-mouse perilipin</td>
			<td>Progen</td>
			<td>GP29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">wide tip pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229211B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>TCS SP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nude nice&#160;</td>
			<td>Southern Mdical University</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">light microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL tube</td>
			<td>Cornig</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sterile bag</td>
			<td>Laishi</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microtome</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">centrifuge</td>
			<td>Heraus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical micronization of lipoaspirates for regenerative therapy

様々 な疾患の再生ツールとなっている間質血管分数 (SVF)しかし、法律は厳密にコラゲナーゼを使用して細胞製品の臨床応用を調整します。ここでは、純粋に機械的なプロセスによって、脂肪組織から SVF 細胞と細胞外マトリックスのネイティブの注射混合物を生成するためのプロトコルを提案する.成人は遠心分離機に入れ、3 分間 1,200 x gでスピンします。中間層の収集し、二層 (下部に高密度脂肪) と上に低密度脂肪に分かれています。上位層を直接 8 x 6 x 用 20 mL/秒のレートで intersyringe シフトすることによって乳化します。乳化脂肪は 3 分間 2,000 × gで遠心分離し、油の層の下に粘着性物質が収集され、細胞外マトリックス (ECM) として定義されている/SVF ゲル。最上層に油が収集されます。約 5 mL のオイルは、高密度脂肪 15 mL に追加され、intersyringe シフト、6 x 8 x に 20 mL/秒のレートで乳化します。乳化脂肪は 3 分間 2,000 × gで遠心分離し、粘着性物質も ECM/SVF-ゲルです。ECM/SVF-ゲルのヌードマウスへの移植後、移植、収穫、組織検査によって評価。結果は、このプロダクトに通常の脂肪組織に再生成する可能性があることを示しています。この手順は、再生のための自然な支援の ECM に埋め込まれた SVF 細胞を凝縮して、シンプルで効果的な機械的解離プロシージャです。

ECM/SVF-ゲルにコールマン脂肪を処理した後破棄された石油の量は最終巻の 80% とオイルの層の下で保持される脂肪の 20% だけは ECM/SVF-ゲル (図 1A) とみなされます。ECM/SVF-ゲルは 27 G 針; を通過することができます滑らかな液体のような質感しかし、コールマン脂肪は大規模な繊維と一体脂肪構造で構成されています、18 G カニューレ (<s...

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Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy

成人再生療法のための機械的微細化

ここでは、一連の機械的なプロセス、乳化および複数の遠心を含む脂肪組織から間質血管の一部を取得するためのプロトコルを提案する.

Stromal vascular fraction (SVF) has become a regenerative tool for various diseases; however, legislation strictly regulates the clinical application of ...

脂肪吸引から間質血管分画(SVF)を得るためにはコラゲラーゼによる消化が必要であり、生物学的汚染のリスクが高まる。コラゲターゼなしでSVFを得るためのより良い方法を開発する必要があります。これらの技術は、単純な機械的プロセスを通じて、そのネイティブの細胞外マトリックスでSVFを得ることを可能にします。手順をデモンストレーションするのは、私たちの研究室の卒業生であるXihang Chenです。脂肪サンプルを得た後、リポアズパイアを1本の50ミリリットルチューブに移し、収穫した脂肪を10分間平衡化させます。次に、広い先端ピペットを使用して、チューブの最上層から新しい50ミリリットルチューブに脂肪を引き出し、遠心分離によって脂肪を回転させます。チューブの上層はコールマン脂肪分画です。コールマン脂肪の上の2/3を新しい15ミリリットルチューブに移します。この部分は低密度脂肪と考えられる。コールマン脂肪の下3分の1を2番目の15ミリリットルチューブに移します。この部分は高密度脂肪と考えられる。低密度脂肪から細胞外マトリックス間質血管画分ゲルを生成するには、女性から女性のルアーロックコネクタに接続された2つの20ミリリットルのシリンジを低密度脂肪の10ミリリットル間間シフトに使用する。これは、アディポサイトを破壊するための重要なステップです。インターシリンジのシフトが行われる速度と時間は、最終製品の品質に寄与します。最後のシフト間セッションの後、遠心分離によって脂肪を収集し、15ミリリットルのチューブに上部の油層を移します。次に、粘着性の中中細胞外マトリックス間質血管画分ゲル層を新しい15ミリリットル円錐形チューブに移します。高密度脂肪から細胞外マトリックス間質血管画分ゲルを生成するには、低密度油分率の2ミリリットルを高密度脂肪サンプルの5ミリリットルに加える。エマルション内で凝集が観察されるまで実証したように混合脂肪をシフトする。遠心分離によってフロクレートを収集し、上部の油層を捨てます。次に、粘着性のある中間層を収集し、低密度細胞外マトリックス間質血管画分ゲルサンプルとこの画分を混合します。コールマン脂肪を細胞外マトリックス間質血管画分ゲルに処理した後、廃棄された油の体積は最終体積の80%を占め、油層の下に保存された脂肪組織の20%だけが細胞外マトリックス間質血管画分ゲルとみなされる。細胞外マトリックス間質血管画分ゲルは、27ゲージの細かい針を通過することを可能にする滑らかな液体のような質感を有する。しかし、コールマン脂肪は、18ゲージカニューレを通過できる大きな繊維を持つ一体型脂肪構造で構成されています。移植後3日目には、複数の細胞内脂質滴を有する多数の小型の前脂肪細胞、広範な血管結合組織、および浸潤した炎症細胞が多数現れる。15日目から、炎症細胞の数は徐々に減少し始め、アディポサイトは成熟し始める。90日目までに、移植片の血管化結合組織の大部分は成熟した有数細胞に置き換えられた。細胞外マトリックス間質血管画分ゲル移植片はまた、移植の3日後にいくつかのペリリピン陽性脂肪細胞を含み、小さなサイズの前脂肪細胞を有し、複数の細胞内脂質滴が15日目に出現し始める。1日90の細胞外マトリックス間質血管画分ゲル移植片切片の各分野は、多数のペリリピン陽性脂肪細胞および新たに形成された血管を示す。フローサイトメトリーは、製品中の細胞集団を決定するために行うことができる。走査電子顕微鏡とは、製品の微細構造を可視化するために行うことができる。この技術は、外科医および研究者が脂肪組織から天然の細胞外マトリックス繊維を有する高濃度のSVF細胞を有する産物を得るための簡単な方法を提供する。

Research

JoVE Journal

Medicine

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ビボ犬筋肉の機能アッセイに

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
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がん治療のモニタリングのためのチェレンコフ発光イメージング（CLI）

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Cancer therapies  which are less toxic and invasive than their existing counterparts are highly  desirable. The use of RF electric-fields that penetrate ...

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骨肉腫細胞における光線力学療法の細胞毒性有効性<em&gt;体外</em

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Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

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This study is aimed at examining whether a suprachoroidal graft of autologous cells can improve best corrected visual acuity (BCVA) and responses to ...

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Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...