Name: mechanical micronization of lipoaspirates for regenerative therapy
Uploaded: 2019-03-15T13:00:00
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이 작품은 중국 (81471881, 81601702, 81671931)의 국립 자연 과학 재단, 중국의 광 동 지방 (2014A030310155), 및 (2014B009, Nanfang 병원의 관리자 재단의 자연 과학 재단에 의해 지원 되었다 2015Z002, 2016Z010, 2016B001)입니다.

이 연구 윤리 검토 보드 Nanfang 병원, 광저우, 중국에에서 의해 승인 되었다. 지방 조직 건강 한 기증자 했다 서 면 통지 해준 동의 연구에 참여 하에서 수집 되었다. 모든 동물 실험 Nanfang 병원 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 하 고 국민 건강 및 의료 연구 위원회 (중국)의 지침에 따라 수행 했다.
1. ECM/SVF-젤 준비
<ol><li>베스트 지방입니다.<ol>
<li>정 맥과 3 mm 멀티 포...

<ol>
	<li>Bateman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Fat+to+Fight+Disease:+A+Systematic+Review+of+Non-Homologous+Adipose-Derived+Stromal/Stem+Cell+Therapies.">Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies.</a> Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).</li><li>Baer, P. C., Geiger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+mesenchymal+stromal/stem+cells:+tissue+localization,+characterization,+and+heterogeneity.">Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity.</a> Stem Cells International. , 812693 (2012).</li><li>Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. 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줄기 세포 기반 재생 치료는 다른 질병에서 큰 잠재적인 혜택을 보이고 있다. ASCs는 뛰어난 치료 후보 조직 복구 및 소설 조직15의 재생 능력을가지고 하 쉽기 때문에. 그러나, 그것의 임상 응용 프로그램을 확장 하는 셀과 콜라6처리에 대 한 격리를 복잡 한 절차 때문에 한계가 있다. 따라서, 콜라의 사용 없이 줄기 세포를 얻기 위해 간단한 기술을 개발 하기 위?...

그들은 다양 한 질병1에 대 한 대체 치료 처방을 제공할 수 있도록 줄기 세포 치료 조직 수리 및 재생에 대 한 패러다임의 변화를 제공 합니다. 줄기 세포 (예를 들면, 유도 만능 줄기 세포와 배아 줄기 세포) 큰 치료 잠재력을가지고 하지만 셀 레 귤 레이 션 및 윤리적인 고려 사항으로 인해 제한 됩니다. 지방 유래 중간 엽 기질/줄기 세포 (ASCs)는 쉽게 lipoaspirates에서와 같은 제한; 적용 되지 않습니다 얻을 따라서, 그것은 실용적인 재생 의학2에 대 한 이상적인 셀 유형이 되고있다. 또한, 그들은 nonimmunogenic 이며 헌 지방3에서 풍부한 자원을.
현재, ASCs 주로 지방이 많은 직물의 콜라 중재 소화에 의해 얻을 수 있습니다. 지방이 많은 직물의 실질 혈관 분수 (SVF) ASCs, 내 피 뿌리 세포, pericytes, 및 면역 세포에 포함 되어 있습니다. 효소 고밀도 SVF/ASCs를 얻는 유익한 효과를 표시 했다, 비록 여러 국가에서 입법은 엄격 하 게 콜라4를 사용 하 여 셀 기반 제품의 임상 적용을 규제 합니다. SVF 세포를 얻기 위해 1 시간 30 분 콜라와 함께 지방 조직 소화 준비와 생물 학적 오염 두 외 인 물질의 위험을 증가. 부착 문화와 일 주 소요, ASCs, 정화 특정 실험실 장비가 필요 합니다. 또한, 대부분의 연구에서 SVF 전지와 ASCs 서 스 펜 션에 사용 됩니다. 세포 외 기질 (ECM) 또는 다른 항공사의 보호 없이 프리셀은 취약 하 고 주입 후 가난한 셀 유지가 발생할 손상 치료 결과5. 이러한 이유로 모두 줄기 세포 치료의 추가 응용 프로그램을 제한합니다.
콜라-중재 소화 하지 않고 지방 조직에서 ASCs를, 원심 분리, 자르고, 분쇄, pureeing, 고 닦지, 기계 등 여러 기계적 처리 절차, 개발된6,7 되었습니다. , 8 , 9. 이러한 방법은 기계적으로 성숙한 adipocytes 및 그들의 석유를 포함 하는 소포를 방해 하 여 조직과 ASCs를 응축 하 생각 된다. 또한, ASCs의 높은 농도 포함 하는 이러한 준비 동물에서 재생 의학 모델8,,910로 상당한 치료 잠재력을 보여주었다.
2013 년에 Tonnard 외. 유화 lipoaspirates intersyringe11처리 하 여 생산 관련 기술을 접목 하는 nanofat를 소개 했다. 이동 하는 intersyringe에 의해 만들어진 전단 힘 선택적으로 성숙한 adipocytes를 끊을 수 있다. 우리 SVF 세포와 ECM/SVF-젤12분류 한 ECM 떠나 lipoaspirates에서 대부분의 지질 및 액체를 제거 하는 순전히 기계적 처리 방법 개발 그들의 결과에 따라. 여기, 우리 인간 파생 된 지방 조직 ECM/SVF-젤 생산의 기계적 프로세스의 세부 사항을 설명 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:733px;" width="734">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4</td>
			<td style="width:232px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">I21411</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">guinea pig anti-mouse perilipin</td>
			<td>Progen</td>
			<td>GP29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">wide tip pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229211B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>TCS SP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nude nice&#160;</td>
			<td>Southern Mdical University</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">light microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL tube</td>
			<td>Cornig</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sterile bag</td>
			<td>Laishi</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microtome</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">centrifuge</td>
			<td>Heraus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical micronization of lipoaspirates for regenerative therapy

Stromal 혈관 분수 (SVF); 다양 한 질병에 대 한 재생 도구가 되고있다 그러나, 입법 콜라를 사용 하 여 셀 제품의 임상 적용을 엄격 하 게 통제 한다. 여기, 우리는 순전히 기계적 과정에 의해 지방 조직에서 SVF 셀 및 기본 세포 외 매트릭스의 주사 혼합물을 생성 하는 프로토콜을 제시. Lipoaspirates는 원심 분리기에 투입 되며 1200 x g 3 분에 합니다. 중간 계층은 수집 하 고 (고밀도 하단) 지방과 저밀도 지방 상단에 2 개의 층으로 분리. 상위 계층은 직접 intersyringe를 이동 하 여, 8 x 6 x 20 mL/s의 속도로 유화 됩니다. 유화 지방 2000 x g 3 분,에서 centrifuged 그리고 기름 층 아래 끈적끈적한 물질을 수집 하 고는 세포 외 기질 (ECM)으로 정의 / SVF 젤. 꼭대기 층에 오일 수집 됩니다. 오일의 약 5 mL는 고밀도 지방 15 mL에 추가 하 고 intersyringe를 이동 하 여, 8 x 6 x 20 mL/s의 속도로 유화. 유화 지방 2000 x g 3 분에 centrifuged 그리고 끈적끈적한 물질은 또한 ECM/SVF-젤. 누드 마우스에 ECM/SVF-젤의 이식 후에 이식 수확 이며 더 시험에 의해 평가. 결과이 제품에는 정상적인 지방 조직으로 재생성을 보여줍니다. 이 절차는 간단 하 고 효과적인 기계적 분리 절차 SVF 세포 재생 목적을 위해 그들의 자연적인 지원 ECM에 포함 된 응축입니다.

ECM/SVF-젤 콜맨 지방을 처리 한 후 폐기 기름의 볼륨 최종 볼륨의 80%를 차지 하 고 지방 조직 기름 층 아래 보존의 20%만 ECM/SVF-젤 (그림 1A)로 간주 됩니다. ECM/SVF-젤은 27 G 정밀한 바늘;을 통해 갈 수 있도록 하는 부드러운 액체 같은 질감 그러나, 콜맨 지방 그리고 큰 섬유와 필수 지방 구조의 구성 18 G 정 (그림 1B<...

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Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy

재생 치료를 위한 Lipoaspirates의 기계 Micronization

여기, 우리는 일련의 유화 및 여러 centrifugations를 포함 하는 기계적인 프로세스를 통해 지방 조직에서 stromal 혈관 분수를 얻기 위해 프로토콜 제시.

Stromal vascular fraction (SVF) has become a regenerative tool for various diseases; however, legislation strictly regulates the clinical application of ...

리포아실리페로부터 기질 혈관 분획 또는 SVF를 얻으려면 콜라게나아제로 소화가 필요하며, 이는 생물학적 오염의 위험을 증가시킵니다. 콜라게나아제 없이 SVF를 얻을 수 있는 더 좋은 방법을 개발해야 합니다. 이러한 기술을 통해 간단한 기계적 공정을 통해 기본 세포 외 매트릭스에서 SVF를 얻을 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 우리 실험실에서 졸업한 학생 인 Xihang Chen이 될 것입니다. 지방 샘플을 얻은 후, 리포아시브를 50 밀리리터 튜브로 옮기고 수확한 지방이 10분 동안 평형화되도록 합니다. 다음으로, 넓은 팁 파이펫을 사용하여 튜브의 상단 층에서 지방을 새로운 50 밀리리터 튜브로 끌어당기고 원심분리에 의해 지방을 회전시합니다.튜브의 상부 층은 콜맨 지방 분획입니다. 콜맨 지방의 상부 2/3을 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 이 부분은 저밀도 지방으로 간주됩니다.콜맨 지방의 하부 3분의 1을 두 번째 15 밀리리터 튜브로 옮춥시다. 이 부분은 고밀도 지방으로 간주됩니다. 저밀도 지방에서 세포외 매트릭스 기질 혈관 분획 젤을 생성하려면 여성이 여성 luer lock 커넥터에 연결된 20 밀리리터 주사기를 사용하여 저밀도 지방의 10 밀리리터를 인터시프트하십시오.이것은 지방세포를 파괴하는 핵심 단계입니다. 인터시고지 변속이 수행되는 속도와 시간은 최종 제품의 품질에 기여합니다. 마지막 인터시프트 세션 후 원심분리로 지방을 수집하고 상단 오일 층을 15 밀리리터 튜브로 옮긴다.그런 다음 끈적끈적한 중간 세포외 매트릭스 기질 혈관 분수 젤 층을 새로운 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮킨다. 고밀도 지방에서 세포외 매트릭스 기질 혈관 분획 젤을 생산하려면 저밀도 오일 분수의 2 밀리리터를 고밀도 지방 샘플의 5 밀리리터에 추가하십시오. 에멀젼 내에서 플립질이 관찰될 때까지 입증된 혼합 지방을 인터시프트한다.원심분리로 플렉소드를 수집하고 상단 오일 층을 폐기하십시오. 그런 다음 끈적 끈적한 중간 층을 수집하고 저밀도 세포 외 세포 외 매트릭스 기질 혈관 분수 젤 샘플과이 분획을 혼합합니다. 콜맨 지방을 세포외 매트릭스 기질 혈관 분수 젤로 처리한 후, 버려진 오일의 부피는 최종 부피의 80%를 차지하며, 오일 층 아래에 보존된 지방 조직의 20%만이 세포외 매트릭스 기질 혈관 분획 젤로 간주된다.세포 외 매트릭스 기질 혈관 분수 젤은 27 게이지 미세 바늘을 통과 할 수있는 부드러운 액체 와 같은 질감을 가지고 있습니다. 그러나, Coleman 지방은 단지 통과 할 수있는 큰 섬유와 통합 지방 구조로 구성되어 있습니다 18 게이지 캐뉼라. 이식 후 셋째 날에는 여러 세포 내 지질 방울, 광범위한 잘 혈관 화 결합 조직 및 침투 된 염증 세포가있는 작은 크기의 사전 지방세포가 많이 나타납니다.15일째부터 염증성 세포의 수가 점차 감소하기 시작하고, 지방세포는 성숙해지기 시작합니다. 90일째까지, 이식편에 있는 혈관 결합 조직의 대부분은 성숙한 지방세포로 대체되었습니다. 세포외 매트릭스 기질 혈관 분획 젤 이식은 또한 이식 후 3 일 동안 몇 개의 페리리핀 양성 지방을 포함하고, 작은 크기의 사전 adipocytes와 함께, 다중 세포 내 지질 방울이 15 일에 나타나기 시작한다.하루의 각 필드 90 세포 외 매트릭스 기질 혈관 분획 젤 이식 섹션 수많은 perilipin 양성 선포 세포와 새로 형성 된 혈관을 전시. 유동 세포측정은 제품 내의 세포 집단을 결정하기 위해 수행될 수 있다. 및 전자 현미경 검사법은 제품의 미세 구조를 시각화하기 위해 수행 될 수있다.이 기술은 외과 의사와 연구원이 지방 조직에서 네이티브 세포 외 매트릭스 섬유와 SVF 세포의 높은 농도와 제품을 얻을 수있는 간단한 방법을 제공합니다.

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