Name: mechanical micronization of lipoaspirates for regenerative therapy
Uploaded: 2019-03-15T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciência natural da China (81471881, 81601702, 81671931), a Fundação de ciências naturais da província de Guangdong de China (2014A030310155) e a Fundação administrador de Hospital Nanfang (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de revisão ética em Nanfang Hospital, Guangzhou, China. Tecido adiposo foi coletado de saudáveis doadores que deu consentimento informado por escrito para participar no estudo. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de uso e Nanfang Hospital institucional Cuidado Animal e executados de acordo com as diretrizes da saúde nacional e Conselho de pesquisa médica (China).
1. ECM/SVF-gel de preparação
<ol><li>Gordura de colheita...

<ol>
	<li>Bateman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Fat+to+Fight+Disease:+A+Systematic+Review+of+Non-Homologous+Adipose-Derived+Stromal/Stem+Cell+Therapies.">Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies.</a> Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).</li><li>Baer, P. C., Geiger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+mesenchymal+stromal/stem+cells:+tissue+localization,+characterization,+and+heterogeneity.">Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity.</a> Stem Cells International. , 812693 (2012).</li><li>Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. 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Terapia regenerativa baseada em células-tronco tem mostrado um grande benefício potencial em diferentes doenças. ASCs são excelentes candidatos terapêuticos porque eles são fáceis de obter e ter a capacidade de reparação tecidual e a regeneração de novos tecidos15. No entanto, existem limitações para expandir sua aplicação clínica, pois requer procedimentos complicados para isolar as células e colagenase para processamento6. Assim, é essencial desenvolver ...

Terapias de células-tronco fornecem uma mudança de paradigma para a regeneração e reparação tecidual para que eles possam oferecer um regime terapêutico alternativo para várias doenças1. Células-tronco (por exemplo, as células-tronco pluripotentes induzidas e células-tronco embrionárias) têm um grande potencial terapêutico, mas são limitadas devido ao regulamento de célula e considerações éticas. Adiposo-derivados mesenquimais estromais/células-tronco (ASCs) são fáceis de obter do lipoaspirates e não sujeitos às mesmas restrições; assim, tornou-se um tipo de célula ideal para medicina regenerativa prática2. Além disso, eles são nonimmunogenic e têm recursos abundantes de gordura autóloga3.
Atualmente, ASCs são obtidos principalmente por mediada por colagenase digestão do tecido adiposo. A fração vascular do estroma (SVF) do tecido adiposo contém células progenitoras endoteliais ASCs, pericitos e células do sistema imunológico. Embora a obtenção de uma elevada densidade de SVF/ASCs enzimaticamente foi mostrado para ter efeitos benéficos, a legislação em vários países estritamente regula a aplicação clínica dos produtos à base de célula usando colagenase4. Digerir o tecido adiposo com colagenase por 30 min a 1 h para obter as células SVF aumenta o risco de ambos material exógeno na preparação e contaminação biológica. A cultura aderente e a purificação de ASCs, que leva dias para semanas, exigem equipamentos laboratoriais específicos. Além disso, na maioria dos estudos, células SVF e ASCs são usados em suspensão. Sem a proteção da matriz extracelular (ECM) ou outra transportadora, células livres são vulneráveis, causar uma retenção de pobre célula após a injeção e comprometer o resultado terapêutico de5. Todas estas razões limitam a aplicação adicional de terapia com células tronco.
Para obter o ASCs do tecido adiposo sem digestão mediada por colagenase, vários procedimentos de processamento mecânico, incluindo a centrifugação, mecânica, picar, ralar, reduzir a puré e picagem, têm sido desenvolvidos6,7 , 8 , 9. esses métodos são pensados para condensar o tecido e ASCs por perturbar mecanicamente adipócitos maduros e suas vesículas contendo óleo. Além disso, estas preparações, contendo altas concentrações de ASCs, mostraram considerável potencial terapêutico como medicina regenerativa em animal modelos8,9,10.
Em 2013, et al . Tonnard introduziu o nanofat enxertia técnica, que envolve produzindo emulsionado lipoaspirates por intersyringe11de processamento. A força de corte criada por intersyringe deslocando seletivamente pode quebrar adipócitos maduros. Baseado em seus findings, desenvolvemos um método de processamento puramente mecânico que remove a maioria dos lipídios e fluido no lipoaspirates, deixando apenas as células SVF e ECM fracionada, o que é ECM/SVF-gel12. Aqui, descrevemos os detalhes do processo mecânico de humanos-derivadas de tecido adiposo para produzir o ECM/SVF-gel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:733px;" width="734">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4</td>
			<td style="width:232px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">I21411</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">guinea pig anti-mouse perilipin</td>
			<td>Progen</td>
			<td>GP29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">wide tip pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229211B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>TCS SP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nude nice&#160;</td>
			<td>Southern Mdical University</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">light microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL tube</td>
			<td>Cornig</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sterile bag</td>
			<td>Laishi</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microtome</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">centrifuge</td>
			<td>Heraus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical micronization of lipoaspirates for regenerative therapy

Fração de vascular do estroma (SVF) tornou-se uma ferramenta regenerativa para várias doenças; no entanto, a legislação estritamente regula a aplicação clínica dos produtos de célula usando a colagenase. Aqui, apresentamos um protocolo para gerar uma mistura injectável de células SVF e nativo da matriz extracelular do tecido adiposo, por um processo puramente mecânico. Lipoaspirates são colocar em uma centrífuga e girou a 1.200 x g durante 3 min. A camada média é coletada e separada em duas camadas (alta densidade de gordura na parte inferior) e baixa densidade de gordura na parte superior. A camada superior é diretamente emulsionada deslocando-se intersyringe, a uma taxa de 20 mL/s para 6 x 8 x. A gordura emulsionada é centrifugada a 2.000 x g durante 3 min, e a substância pegajosa sob a camada de óleo é coletada e definida como a matriz extracelular (ECM) / SVF-gel. O óleo sobre a camada superior é coletado. Cerca de 5 mL de óleo é adicionado à 15 mL de gordura de alta densidade e emulsionado deslocando-se intersyringe, a uma taxa de 20 mL/s para 6 x 8 x. A gordura emulsionada é centrifugada a 2.000 x g durante 3 min, e a substância pegajosa é também ECM/SVF-gel. Após o transplante do ECM/SVF-gel em camundongos, o enxerto é colhido e avaliado através do exame histológico. O resultado mostra que este produto tem o potencial para se regenerar em tecido adiposo normal. Este procedimento é um procedimento de dissociação mecânica simples, eficaz para condensar as células SVF incorporadas em sua natural apoio ECM para fins regenerativos.

Depois de processar a gordura Coleman para ECM/SVF-gel, o volume de óleo descartado ocupa 80% do volume final, e apenas 20% do tecido adiposo, preservado sob a camada de óleo é considerado como ECM/SVF-gel (Figura 1A). ECM/SVF-gel tem uma textura suave do líquido, como que lhe permite passar por uma agulha fina de 27 G; no entanto, Coleman gordura é composta de uma estrutura integral adiposa com grandes fibras e só pode ir através de u...

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Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy

Micronização mecânica de Lipoaspirates para terapia regenerativa

Aqui, apresentamos um protocolo para obter a fração vascular do estroma do tecido adiposo através de uma série de processos mecânicos, que incluem emulsificação e múltiplas centrifugações.

Stromal vascular fraction (SVF) has become a regenerative tool for various diseases; however, legislation strictly regulates the clinical application of ...

A obtenção de frações vasculares estromes, ou SVFs, de lipoaspiratas requer digestão com colagemnase, o que aumenta o risco de contaminação biológica. Uma melhor maneira de obter SVF sem colagemnase deve ser desenvolvida. Essas técnicas nos permitem obter o SVF em sua matriz extracelular nativa através de um simples processo mecânico.Demonstrando o procedimento será Xihang Chen, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Após a obtenção das amostras de gordura, transfira os lipoaspiratas em um tubo de 50 mililitros e permita que a gordura colhida se equilibre por 10 minutos. Em seguida, use uma pipeta de ponta larga para puxar a gordura da camada superior do tubo em um novo tubo de 50 mililitros e girar a gordura por centrifugação.A camada superior do tubo é a fração de gordura Coleman. Transfira o 2/3 superior da gordura Coleman para um novo tubo de 15 mililitros. Esta porção é considerada a gordura de baixa densidade.Transfira o terço inferior da gordura Coleman para um segundo tubo de 15 mililitros. Esta porção é considerada a gordura de alta densidade. Para produzir um gel de fração vascular estromânico de matriz extracelular a partir da gordura de baixa densidade, use duas seringas de 20 mililitros conectadas por uma fêmea para o conector de trava de luer feminino para intershiftar 10 mililitros da gordura de baixa densidade.Este é o passo chave para destruir adipócitos. A velocidade e o tempo que o deslocamento da intersinge é realizado contribui para a qualidade do produto final. Após a última sessão intershift, colete a gordura por centrifugação e transfira a camada superior de óleo para um tubo de 15 mililitros.Em seguida, transfira a pegajosa matriz extracelular de camada de gel de fração vascular estromida em um novo tubo cônico de 15 mililitros. Para produzir um gel de fração vascular estromânica de matriz extracelular a partir da gordura de alta densidade, adicione dois mililitros da fração de óleo de baixa densidade a cinco mililitros da amostra de gordura de alta densidade. Intershifte a gordura mista como demonstrado até que um floculato seja observado dentro da emulsão.Colete o floculado por centrifugação e descarte a camada superior de óleo. Em seguida, colete a camada média pegajosa e misture esta fração com a amostra de gel de fração vascular estrobosômica de matriz extracelular de baixa densidade. Depois de processar a gordura Coleman para gel de fração vascular estromânica de matriz extracelular, o volume de óleo descartado ocupa 80% do volume final, e apenas 20% do tecido adiposo preservado sob a camada de óleo é considerado como gel de fração vascular estromático da matriz extracelular.O gel de fração vascular estromânea da matriz extracelular tem uma textura líquida lisa que permite que ele passe por uma agulha fina de calibre 27. No entanto, a gordura Coleman é composta por uma estrutura adiposa integral com fibras grandes que só podem passar por uma cânula de calibre 18. No terceiro dia após o transplante, aparecem um grande número de pequenos pré-adipócitos com múltiplas gotículas lipídicas intracelulares, tecido conjuntivo bem vascularizado e células inflamatórias infiltradas.A partir do dia 15, o número de células inflamatórias começa a reduzir gradualmente, e os adipócitos começam a amadurecer. Até o dia 90, a maior parte do tecido conjuntivo vascularizado nos enxertos foi substituída por adipócitos maduros. Os enxertos de gel de fração vascular estrobosômica da matriz extracelular também contêm alguns adipócitos positivos perilipin três dias após o transplante, com pequenos pré-adipócitos, com múltiplas gotículas lipídicas intracelulares começando a aparecer no dia 15.Em cada campo do dia 90 seções de enxerto de gel de fração vascular estrobomatos de matriz extracelular exibem numerosos adipócitos positivos perilipin e vasos sanguíneos recém-formados. A citometria de fluxo pode ser realizada para determinar a população celular no produto. E a microscopia eletrônica de varredura pode ser realizada para visualizar a microestrutura do produto.Esta técnica fornece um método simples para cirurgiões e pesquisadores obterem um produto com alta concentração de células SVF com fibras matriciais extracelulares nativas do tecido adiposo.

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