Name: a plate competition assay as a quick preliminary assessment of disease suppression
Uploaded: 2018-10-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression at JoVE.com

Vermont landbrugs eksperiment Station konkurrencedygtige Hatch Program VT-HO1609 finansieret forskning. Lynn Fang brugte metoden som en del af sit M.S. speciale på University of Vermont6.

1. Forbered dig på forhånd
<ol><li>Master svampe kultur (testorganismen)<ol>
<li>Bestiller fra amerikansk kultur Typesamlingen, mikrobiologi Collection9, af dens teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) eller MYA 4031.</li>
		<li>Alternativt: Indsamle lokale isolater som gjort af forfatterne. Stiklinger af rød radise (Raphanus sativus) fungerer godt som en agn plante; indsamle jord fra en placering, der er kendt for at have en historie af dæmpning-off eller r...

<ol>
	<li>Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review.+Biology+and+systematics+of+the+form+genus+Rhizoctonia.">Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia.</a> Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).</li><li>Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+soilborne+fungal+diseases+with+organic+amendments.">Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments.</a> Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).</li><li>Noble, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+and+benefits+of+soil+amendment+with+composts+in+relation+to+plant+pathogens.">Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens.</a> Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).</li><li>Wichuk, K. M., McCartney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compost+stability+and+maturity+evaluation+-+a+literature+review.">Compost stability and maturity evaluation - a literature review.</a> Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).</li><li>Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+composted+olive+mill+wastes+to+predict+potential+plant+disease+suppressiveness.">Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness.</a> Biological Control. 3, 199-207 (2011).</li><li>Fang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani. , (2015).</li><li>Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+characteristics+of+organic+soil+amendments+that+suppress+soilborne+plant+diseases.">Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).</li><li>Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecoenzymes+as+indicators+of+compost+to+suppress+Rhizoctonia+solani.">Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani.</a> Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).</li><li>. ATCC&#174; Mycology Culture Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx">https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx</a> (2018)</li><li>Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -. D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gamma-sterilization+and+autoclaving+on+soil+organic+matter+structure+as+studied+by+solid+state+NMR,+UV+and+fluorescence+spectroscopy.">Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy.</a> European Journal of Soil Science. 59, (2008).</li></ol>

Vi ved fra tidligere forskning, at visse kompost er effektiv til at undertrykke R. solani og at de smittespredningshæmmende virkninger skyldes mikrober bor i kompost, ikke de abiotiske egenskaber af kompost6,8. Brugen af autoklavering som et middel til at «dræbe «mikrobiota er blevet kritiseret, fordi det påvirker CO2 kemien i media10. Vi sammenlignede brugen af autoklavering til vakuum filtrering gennem Whatman nr. 1 papir. ...

Rhizoctonia repræsenterer en bred kompleks af svampe, af hvilke Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk (anamorph = Rhizoctonia solani Kühn) er patogen forårsager root rot og dæmpning off-1. Rhizoctonia solani er en aggressiv patogen og en saprophyte, der kan overleve som sklerotier under ugunstige miljøforhold1. Som et resultat, det har en global distribution og kan forårsage sygdom på lang række plante værter herunder Solanaceae, Ærteblomstfamilien, Asteraceae og Brassicaceae resulterer i alvorlige økonomiske tab.
Kompost har kapacitet til at havnen biocontrol agenter for visse anlæg patogener2. Dog ikke alle kompost er ens heller ikke påvirker de alle patogener ligeledes3. Træ-baserede kulstof har højere lignin til cellulose nøgletal end hø eller halm-carbon baseret kompost. R. solani foretrækker let tilgængelige kulstof findes i halm. Derimod er biologisk bekæmpelse svampe, såsom Trichoderma spp., mere effektiv, når carbon er mindre let tilgængelige. Gavnlige svampe og bakterier i kompost kan undertrykke plantesygdomme gennem konkurrence, antagonisme eller regulere planten vækst3. Den foreslåede assay registrerer primært antagonisme lavet af produktionen af antibiotika, ecoenzymes eller chelatorer, der er skadelige for patogenet.
Plante bioassays er en guldstandarden til at afgøre, om kompost fordel eller afskrække plante vækst4. Men planten bioassays er tidskrævende (uger til måneder) til at fuldføre, som kan være længere end ønsket, og kræver mere arbejdskraft til at udtrække planter med rødder at kvantificere graden af rodsystemer. Forholdsvis robust, men hurtigere (dage) assays ville være ideelt for kvalitetskontrol programmer. Målet med dette papir er at påvise en forholdsvis hurtig og præcis test for at forudsige smittespredningshæmmende potentiale af kompost. Metoden var mønstret efter Alfano et al. 5 med to undtagelser, kompost ekstrakter blev fortyndet og vand agar blev brugt i stedet for kartofler dextrose agar (PDA). R. solani vokser hurtigt på simple vand agar media PDA promoveret vækst af bakterier og andre svampe, der forurenede kultur6.
Denne plade assay fungerer som en indikator for undertrykkelse, der gælder for en række anlæg patogener, som overlever i jorden som blødrådsbakterierne herunder R. solani7, Alternaria tidlige blysenes, Fusarium visnesyge, Phytophthora root rot og Pythium root rot. Plade konkurrence assay er nyttigt at screene en række kompost produkter for indeholdende Fællesskaber af mikrober, der tjener som biologisk kontrol agenser af jord patogener. Analysen var en af de mest konsekvente indikatorer for sygdom undertrykkelse i kommercielle kompost produkter6,8. Produkter blev valgt for deres variation i opskrift, modenhed og produktionsprocessen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoclavable narrow-neck glass conical flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-040D</td>
			<td>125-mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dehydrated granulated agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0145-17-0</td>
			<td>500 g quantity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat resistant gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MEMGG1314WL</td>
			<td>several brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (strips of 2-3 cm wide)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PM992 13-374-16</td>
			<td>5 or 10 cm widths work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable polystyrene petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R80116</td>
			<td>comes in sleeves of 20/ea or cases of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dehydrated potato dextrose agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0013-15-8</td>
			<td>comes in quantities of 100, 500 and 2000 grams</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benchtop reciprocal shaker</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1227Y31</td>
			<td>other models will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>S37363</td>
			<td>5L general purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear ruler, flat, at least 10 cm</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>use metric rule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATCC culture</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 10154</td>
			<td>teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) or MYA 4031;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15935</td>
			<td>autoclavable and removable, 1&#34; wide preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water resistant marker</td>
			<td>office or scientific supply</td>
			<td>Sharpie fine tip</td>
			<td>write sample number on tape</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plate competition assay as a quick preliminary assessment of disease suppression

Målet var at udvikle og optimere en enkel, billig og effektiv bioassay for at opdage sygdommen smittespredningshæmmende evne af en specifik kompost mod soilborne svampen Rhizoctonia solani. R. solani er et patogen for en bred vifte af plante værter på verdensplan. Svampen overlever i jorden som en saprophyte og vokser hurtigt på simple vand agar medier. Plade assay er en hurtig metode til at sammenligne kompost for deres evne til at bremse væksten af R. solani. Analysen også korrelerer med undertrykkelse af andre soilborne svampe patogener, der overlever som blødrådsbakterierne i jord såsom Alternaria tidlige blysenes, Fusarium visnesyge, Phytophthora root rot og Pythium root rot.

Færdige kompost bør være stabile og modne, to termer, der bruges ofte synonymt, så det kan være sikkert emballeret og transporteret og ikke forårsage bivirkninger under dets endelige anvendelsesformål4. Stabilitet er en modstand mod nedbrydning og er normalt bestemmes ved hjælp af indeks af mikrobielle aktivitet. Generelle foranstaltninger af mikrobielle åndedræt kan måle kompost stabilitet, men ikke nødvendigvis sygdom undertrykkelse af en agg...

Watch this Scientific Journal Video about A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression at JoVE.com

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

Præsenteret er en protokol til en plade konkurrence analyse til at identificere, om en bestemt kompost er tilbøjelige til at indeholde bakterier og svampe, der undertrykker væksten af Rhizoctonia solani.

En plade konkurrence analyse som en hurtig foreløbig vurdering af sygdom undertrykkelse

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i forbindelse med biologisk bekæmpelse af jordbårne plantepatogener. Guldstandarden til test af materialer som kompost er at have en plantebioassay for at teste, om det er giftigt for planterne. Men det tager tre uger.Denne metode kan gøres i omkring to til tre dage. Den største fordel ved denne teknik er, at det er enkel, overkommelig og effektiv. Denne analyse er en hurtig screening af specifik kompost til at undertrykke væksten af Rhizoctonia solani.Men, denne analyse kan også bruges mod andre jordbårne plantepatogener, såsom Fusariums, Pythiums, og Phytophthoras. Visuel demonstration af denne metode er kritisk, fordi det tager sig at isolere og opretholde en ren kultur af en svamp og samtidig undgå forurening. Demonstration af isolation procedure vil være Taylor Readyhough, en kandidat studerende fra mit laboratorium.Emma Wright, en bachelorstuderende fra mit laboratorium, vil demonstrere konkurrencen assay. Til at begynde, så røde radise frø i jorden kendt for at have en historie af sygdom forårsaget af R.solani. Efter tre til fire uger, fjerne planter fra jorden, og skyl dem med vand fra hanen.Ved hjælp af et barberblad, skære en centimeter segmenter af hypocotyl og rod, der har en brun farve. Brug derefter flammesteriliserede kraftbefædre til at dyppe segmenterne i 10% blegemiddelopløsning i et minut. Derefter skylles segmenterne i sterilt vand.Brug derefter flammesteriliserede kraftbecer til at overføre segmenterne til en køkkenrulle. Pat segmenterne tørre, og overføre dem til en petriskål med vand agar. Placer petriskålen inde i en beholder med låg, og inkuber segmenterne ved stuetemperatur.For at etablere en datter kultur, overføre et af de segmenter til midten af en frisk plade af kartoffel dextrose agar. Herefter skal der automatiskklaves 25 milliliter reagensglas indeholdende 10 milliliter vand. Der tilsættes to 0,5 gram prøver af hver prøve til et par autoklavede reagensglas med 10 milliliter sterilt vand, og reagensglassene rystes natten over.Efter 24 timer tilsættes 1,5 gram almindelig agar og 90 milliliter destilleret vand til et par koniske kolber. Efter autoclaving kolberne, placere dem i en 45-graders Celsius vandbad i 30 minutter. Dernæst hældes den autoklavede referenceprøve og den levende prøve i den smeltede agar.Hæld blandingerne fra hver kolbe i fem petriskåle. For at beskytte de indfødte mikrober, er det vigtigt ikke at tilføje kompost, mens agar er for varmt. Lad derfor agaren køle af til 45 grader Celsius, før komposten tilføjes.Ved hjælp af aseptisk teknik, overføre stykker af R.solani til hvert par prøveplader. Derefter inkuberes pladerne ved stuetemperatur i en til to dage. Endelig skal du bruge en klar, flad lineal og et stereomikroskop til at måle radius af myceliet i hver plade til nærmeste millimeter.I denne protokol, ekstrakter fra levende kompost undertrykt R.solani vækst betydeligt mere end autoklavede prøver, viser, at effekten var mikrobiel og ikke næringsstof-baseret. Suppressiveness måles som en reduktion i væksten i forhold til den autoclaved kontrol. Væksten blev ikke påvirket af varigheden af modning eller hærdning af komposten.Vækst blev væsentligt påvirket af kompost metode og opskrift ingredienser, specielt med vermicompost, windrow processer, og opskrifter med hårdttræ bark. Efter sin udvikling, kan denne teknik være en kandidat til kommerciel certificering af kompost for sygdomshæmmende egenskaber.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering af ribo Bundet Gryende polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; Til at identificere Translationelle Pause steder langs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Brug SecM Arrest Sequence som et redskab til at isolere ribo bundne polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Overvågning intraspecies konkurrence i en bakteriel cellepopulation ved cocultivation af fluorescerende mærkede stammer

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Xenopus laevis som en model til at identificere Oversættelse Nedskrivning

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analyse - En High Throughput, Real Time PCR-analysen for Sc2.0 Genotypebestemmelse

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

Time-Lapse Video mikroskopi for Vurdering af EYFP-Parkin Aggregering som markør for Cellulær Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...