Name: a plate competition assay as a quick preliminary assessment of disease suppression
Uploaded: 2018-10-28T15:00:00
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Il Vermont Agricultural Experiment Station competitivo Hatch programma VT-HO1609 ha finanziato la ricerca. Lynn Fang ha utilizzato il metodo come parte della sua tesi di M.S. presso University of Vermont6.

1. preparare in anticipo
<ol><li>Coltura fungosa Master (microrganismo da testare)<ol>
<li>Ordinare da American Type Culture Collection, collezione di microbiologia9, dal relativo teleomorfo Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) o MYA 4031.</li>
		<li>In alternativa: Raccogliere locali isolati come fatto dagli autori. Piantine di rosso ravanello (Raphanus sativus) funzionano bene come una pianta di esca; raccogliere suolo da una posizione nota per avere una storia di smo...

<ol>
	<li>Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review.+Biology+and+systematics+of+the+form+genus+Rhizoctonia.">Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia.</a> Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).</li><li>Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+soilborne+fungal+diseases+with+organic+amendments.">Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments.</a> Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).</li><li>Noble, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+and+benefits+of+soil+amendment+with+composts+in+relation+to+plant+pathogens.">Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens.</a> Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).</li><li>Wichuk, K. M., McCartney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compost+stability+and+maturity+evaluation+-+a+literature+review.">Compost stability and maturity evaluation - a literature review.</a> Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).</li><li>Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+composted+olive+mill+wastes+to+predict+potential+plant+disease+suppressiveness.">Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness.</a> Biological Control. 3, 199-207 (2011).</li><li>Fang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani. , (2015).</li><li>Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+characteristics+of+organic+soil+amendments+that+suppress+soilborne+plant+diseases.">Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).</li><li>Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecoenzymes+as+indicators+of+compost+to+suppress+Rhizoctonia+solani.">Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani.</a> Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).</li><li>. ATCC&#174; Mycology Culture Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx">https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx</a> (2018)</li><li>Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -. D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gamma-sterilization+and+autoclaving+on+soil+organic+matter+structure+as+studied+by+solid+state+NMR,+UV+and+fluorescence+spectroscopy.">Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy.</a> European Journal of Soil Science. 59, (2008).</li></ol>

Sappiamo da precedenti ricerche, che alcuni composti sono efficaci a sopprimere r. solani e che gli effetti soppressivi sono dovuto i microbi che vivono nel compost, non le proprietà abiotici di compost6,8. L'uso di autoclave come un mezzo per 'uccidere' microbiota è stata criticata perché interessa la chimica del carbonio di media10. Abbiamo confrontato l'uso di autoclave per filtrazione sotto vuoto tramite carta Whatman n. 1....

Rhizoctonia rappresenta un vasto complesso di funghi, di cui Donk Thanatephorus cucumeris (Frank) (anamorph = Rhizoctonia solani Kühn) è l'agente patogeno che causa marciume radicale e smorzamento-off1. Rhizoctonia solani è un agente patogeno aggressivo e un saprofita che può sopravvivere come sclerozi sotto condizioni ambientali1. Di conseguenza, ha una distribuzione globale e possono causare malattie su vasta gamma di ospiti della pianta tra cui Solanaceae, Fabaceae, Asteraceae e Brassicaceae causando gravi perdite economiche.
Compost ha la capacità di agenti di biocontrollo per determinati patogeni di pianta2del porto. Tuttavia, non tutti i composti sono uguali né colpiscono tutti gli agenti patogeni allo stesso modo3. Carbonio a base di legno ha lignina superiore ai rapporti di cellulosa di fieno o paglia-carbonio basata compost. R. solani preferisce prontamente disponibile carbonio trovato in paglia. Al contrario, funghi di controllo biologico, come Trichoderma spp., sono più efficaci quando il carbonio è meno prontamente disponibile. Benefici funghi e batteri in compost possono sopprimere la malattia delle piante attraverso la competizione, antagonismo o che regolano la crescita della pianta3. Il dosaggio proposto rileva principalmente antagonismo creato da produzione di antibiotici, ecoenzymes o chelanti che sono dannosi per l'agente patogeno.
Pianta le analisi biologiche sono un gold standard per determinare se il compost favorire o scoraggiare la crescita della pianta4. Tuttavia, le analisi biologiche pianta sono richiede molto tempo (settimane o mesi) per completare che può essere più di quanto desiderato e richiede più lavoro per estrarre piante con radici per quantificare la gravità degli apparati radicali. In modo paragonabile robusto, ma più veloce analisi (giorni) sarebbe l'ideale per i programmi di controllo di qualità. L'obiettivo di questa carta è di dimostrare un test relativamente rapido e accurato per predire soppressivo potenziale di compost. Il metodo è stato modellato dopo Alfano et al. 5 con due eccezioni, compost estratti sono stati diluiti e agar di acqua è stato usato al posto di agar di patata destrosio (PDA). R. solani cresce rapidamente su agarizzati di acqua semplice considerando che PDA promosso la crescita di batteri e altri funghi che hanno contaminato la cultura6.
Questa analisi del piatto serve come un indicatore di soppressione che si applica a una gamma di agenti patogeni della pianta che sopravvivere nel suolo come saprofiti, tra cui r. solani7, primi arruginisce Alternaria, Fusarium, Phytophthora putrefazione di radice e marciume radicale Pythium. L'analisi di concorrenza del piatto è utile per lo screening di una gamma di prodotti di compost per contenente la comunità di microbi che fungono da agenti di controllo biologico degli agenti patogeni del suolo. Il dosaggio è stato uno degli indicatori più coerenti della soppressione della malattia in compost commerciale prodotti6,8. I prodotti sono stati scelti per la loro variazione nella ricetta, la maturità e processo di produzione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoclavable narrow-neck glass conical flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-040D</td>
			<td>125-mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dehydrated granulated agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0145-17-0</td>
			<td>500 g quantity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat resistant gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MEMGG1314WL</td>
			<td>several brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (strips of 2-3 cm wide)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PM992 13-374-16</td>
			<td>5 or 10 cm widths work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable polystyrene petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R80116</td>
			<td>comes in sleeves of 20/ea or cases of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dehydrated potato dextrose agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0013-15-8</td>
			<td>comes in quantities of 100, 500 and 2000 grams</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benchtop reciprocal shaker</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1227Y31</td>
			<td>other models will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>S37363</td>
			<td>5L general purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear ruler, flat, at least 10 cm</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>use metric rule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATCC culture</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 10154</td>
			<td>teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) or MYA 4031;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15935</td>
			<td>autoclavable and removable, 1&#34; wide preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water resistant marker</td>
			<td>office or scientific supply</td>
			<td>Sharpie fine tip</td>
			<td>write sample number on tape</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plate competition assay as a quick preliminary assessment of disease suppression

L'obiettivo era quello di sviluppare e ottimizzare analisi biologica un semplice, conveniente ed efficace per rilevare capacità soppressive di malattia di un compost specifico contro terricole fungo Rhizoctonia solani. R. solani è un agente patogeno di una vasta gamma di ospiti della pianta in tutto il mondo. Il fungo sopravvive in terreni come un saprofito e cresce rapidamente su agarizzati di semplice acqua. L'analisi del piatto è un metodo rapido per confrontare il compost per la loro capacità di rallentare la crescita di r. solani. L'analisi inoltre correla bene con soppressione di altri patogeni fungini terricole che sopravvivono come saprofiti nel suolo come primi arruginisce Alternaria, Fusarium, Phytophthora putrefazione di radice e marciume radicale Pythium.

Composto finito dovrebbe essere stabile e maturo, due termini che vengono spesso utilizzati in modo intercambiabile, quindi può essere confezionato e trasportato in modo sicuro e non causa effetti negativi durante il suo utilizzo finale4. Stabilità è una resistenza alla decomposizione e viene in genere determinato utilizzando gli indici di attività microbica. Misure generali di respirazione microbica possono misurare la stabilità di compost ma non nec...

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A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

Un protocollo per l'analisi di un concorso di piastra identificare se un compost specifico è probabile contenere batteri e funghi che sopprimono la crescita di Rhizoctonia solaniè presentato.

Un test di competizione di piatto come una rapida valutazione preliminare di soppressione di malattia

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave relative al controllo biologico degli agenti patogeni delle piante trasportate dal suolo. Il gold standard per testare materiali come il compost è quello di avere un saggio biologico vegetale per testare se è tossico per le piante. Tuttavia, ci vogliono tre settimane.Questo metodo può essere eseguito in circa due o tre giorni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice, conveniente ed efficace. Questo saggio è un rapido screening di compost specifico per sopprimere la crescita di Rhizoctonia solani.Tuttavia, questo saggio può anche essere usato contro altri patogeni vegetali nati sul suolo, come Fusarium, Pythiums e Phytophthoras. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché si cura di isolare e mantenere una cultura pura di un fungo evitando la contaminazione. A dimostrare la procedura di isolamento sarà Taylor Readyhough, una studentessa laureata del mio laboratorio.Emma Wright, una studentessa universitaria del mio laboratorio, dimostrerà il saggio del concorso. Per cominciare, seminare semi di ravanello rosso nel terreno noto per avere una storia di malattia causata da R.solani. Dopo tre o quattro settimane, rimuovere le piantine dal terreno e sciacquarle con acqua del rubinetto.Usando una lama di rasoio, tagliare segmenti di un centimetro dell'ipocotile e della radice che hanno un colore marrone. Quindi, utilizzare le forcep sterilizzate a fiamma per immergere i segmenti in una soluzione di candeggina al 10% per un minuto. Dopo questo, sciacquare i segmenti in acqua sterile.Quindi, utilizzare le forcep sterilizzate a fiamma per trasferire i segmenti su un tovagliolo di carta. Asciugare i segmenti e trasferirli in una piastra di Petri con agar d'acqua. Posizionare la piastra di Petri all'interno di un contenitore con un coperchio e incubare i segmenti a temperatura ambiente.Per stabilire una cultura figlia, trasferisci uno dei segmenti al centro di un piatto fresco di agar destrosio di patate. Successivamente, autoclave provette da 25 millilitri contenenti 10 millilitri di acqua. Aggiungere due campioni da 0,5 grammi di ciascun campione di prova a un paio di provette autoclavate con 10 millilitri di acqua sterile e scuotere le provette durante la notte.Dopo 24 ore, aggiungere 1,5 grammi di agar semplice e 90 millilitri di acqua distillata a un paio di fiasche coniche. Dopo aver autoclavato i contenitori, posizionarli in un bagno d'acqua Celsius di 45 gradi per 30 minuti. Quindi, versare il campione di riferimento autoclavato e il campione vivente nell'agar fuso.Versare le miscele da ogni pallone in cinque piastre di Petri. Per proteggere i microbi indigeni, è importante non aggiungere il compost mentre l'agar è troppo caldo. Pertanto, lasciare raffreddare l'agar a 45 gradi Celsius prima di aggiungere il compost.Usando la tecnica aseptica, trasferire pezzi di R.solani ad ogni coppia di piastre campione. Quindi, incubare le piastre a temperatura ambiente per uno o due giorni. Infine, utilizzare un righello chiaro e piatto e un microscopio stereo per misurare il raggio del micelio in ogni piastra al millimetro più vicino.In questo protocollo, gli estratti di compost viventi hanno soppresso la crescita di R.solani significativamente più dei campioni autoclavati, dimostrando che l'effetto era microbico e non a base di nutrienti. La soppressività è misurata come una riduzione della crescita rispetto al controllo autoclavato. La crescita non è stata influenzata dalla durata di maturazione o polimerizzazione del compost.La crescita è stata significativamente influenzata dal metodo del compost e dagli ingredienti delle ricette, in particolare con vermicompost, processi di windrow e ricette con corteccia di legno duro. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può essere un candidato per la certificazione commerciale del compost per le proprietà soppressive della malattia.

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