Name: a plate competition assay as a quick preliminary assessment of disease suppression
Uploaded: 2018-10-28T15:00:00
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O Vermont agrícola Experiment Station competitiva Hatch programa VT-HO1609 financiou a pesquisa. Lynn Fang usou o método como parte de sua tese de M.S. na Universidade de Vermont6.

1. preparar com antecedência
<ol><li>Cultura de fungosa mestre (organismo de teste)<ol>
<li>Encomendar o American Type Culture Collection, coleção de microbiologia9, pelo seu teleomorfo Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) ou MYA 4031.</li>
		<li>Como alternativa: Colete locais isolados como feito pelos autores. Mudas de vermelho rabanete (Raphanus sativus) funcionam bem como uma planta de isca; colete o solo de um local conhecido por ter um histórico de umedeciment...

<ol>
	<li>Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review.+Biology+and+systematics+of+the+form+genus+Rhizoctonia.">Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia.</a> Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).</li><li>Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+soilborne+fungal+diseases+with+organic+amendments.">Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments.</a> Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).</li><li>Noble, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+and+benefits+of+soil+amendment+with+composts+in+relation+to+plant+pathogens.">Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens.</a> Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).</li><li>Wichuk, K. M., McCartney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compost+stability+and+maturity+evaluation+-+a+literature+review.">Compost stability and maturity evaluation - a literature review.</a> Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).</li><li>Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+composted+olive+mill+wastes+to+predict+potential+plant+disease+suppressiveness.">Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness.</a> Biological Control. 3, 199-207 (2011).</li><li>Fang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani. , (2015).</li><li>Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+characteristics+of+organic+soil+amendments+that+suppress+soilborne+plant+diseases.">Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).</li><li>Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecoenzymes+as+indicators+of+compost+to+suppress+Rhizoctonia+solani.">Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani.</a> Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).</li><li>. ATCC&#174; Mycology Culture Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx">https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx</a> (2018)</li><li>Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -. D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gamma-sterilization+and+autoclaving+on+soil+organic+matter+structure+as+studied+by+solid+state+NMR,+UV+and+fluorescence+spectroscopy.">Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy.</a> European Journal of Soil Science. 59, (2008).</li></ol>

Sabemos por pesquisas anteriores, que certos compostos são eficazes na supressão de r. solani e que os efeitos supressivos são devido os micróbios que vivem no adubo, não as propriedades abióticos de adubo6,8. O uso de autoclave como um meio para 'matar' a microbiota tem sido criticado porque afeta a química do carbono da mídia10. Comparou-se o uso de autoclave a vácuo filtração através de papel Whatman n º 1. Tratame...

Rhizoctonia representa um amplo complexo de fungos, dos qual Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk (anamorfo = Rhizoctonia solani Kühn) é o agente patogênico causando podridão de raiz e umedecimento-fora1. Rhizoctonia solani é um patógeno agressivo e uma Saprófita que pode sobreviver como esclerócios sob condições ambientais adversas1. Como resultado, tem uma distribuição global e podem causar doenças em ampla gama de hospedeiros de planta incluindo Solanaceae, Fabaceae, Asteraceae e Brassicaceae, resultando em sérios prejuízos econômicos.
O adubo tem a capacidade de abrigar agentes de biocontrole para determinados agentes patogénicos de planta2. No entanto, nem todos os compostos são iguais, nem eles afetam todos os agentes patogénicos da mesma forma3. Carbono à base de madeira tem lignina mais elevada rácios de celulose de compostos à base de feno ou palha-carbono. R. solani prefere carbono prontamente disponível encontrado em palha. Em contraste, o controle biológico de fungos, como Trichoderma spp., são mais eficazes quando o carbono é menos prontamente disponível. Benéficos fungos e bactérias em adubo podem suprimir a doença de planta através de competição, antagonismo ou regulador de crescimento de planta3. O ensaio proposto primeiramente detecta antagonismo criado pela produção de antibióticos, ecoenzymes ou quelantes que são prejudiciais ao patógeno.
Bioensaios de planta são um padrão-ouro para determinar se o terriço favorece ou impedir o crescimento de planta4. No entanto, a planta bioensaios são demoradas (semanas a meses) para concluir que pode ser mais do que o desejado e exige mais trabalho para extrair plantas com raízes para quantificar a severidade de sistemas da raiz. Comparativamente robusto, mas, mais rápido os ensaios (dias) seria ideais para programas de controle de qualidade. O objetivo deste trabalho é demonstrar um teste relativamente rápido e exato para prever potencial supressivo de adubo. O método foi padronizado após Alfano et al 5 com duas exceções, adubo extratos foram diluídos e ágar água foi usada no lugar de ágar de batata dextrose (PDA). R. solani cresce rapidamente em meios de ágar simples água Considerando que PDA promoveu o crescimento de bactérias e outros fungos que contaminou a cultura6.
Este ensaio de placa serve como um indicador de supressão que se aplica a uma gama de patógenos vegetais que sobrevivem no solo como saprófitas, incluindo r. solani7início definha Alternaria, murcha de Fusarium, podridão radicular de Phytophthora e Pythium podridão de raiz. O ensaio de competição de placa é útil para a tela uma gama de produtos de adubo para que contém comunidades de micróbios que servem como agentes de controle biológico de patógenos de solo. O ensaio foi um dos indicadores mais consistentes de supressão da doença em adubo comercial produtos6,8. Produtos foram escolhidos para sua variação na receita, maturidade e processo de produção.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoclavable narrow-neck glass conical flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-040D</td>
			<td>125-mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dehydrated granulated agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0145-17-0</td>
			<td>500 g quantity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat resistant gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MEMGG1314WL</td>
			<td>several brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (strips of 2-3 cm wide)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PM992 13-374-16</td>
			<td>5 or 10 cm widths work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable polystyrene petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R80116</td>
			<td>comes in sleeves of 20/ea or cases of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dehydrated potato dextrose agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0013-15-8</td>
			<td>comes in quantities of 100, 500 and 2000 grams</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benchtop reciprocal shaker</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1227Y31</td>
			<td>other models will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>S37363</td>
			<td>5L general purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear ruler, flat, at least 10 cm</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>use metric rule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATCC culture</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 10154</td>
			<td>teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) or MYA 4031;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15935</td>
			<td>autoclavable and removable, 1&#34; wide preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water resistant marker</td>
			<td>office or scientific supply</td>
			<td>Sharpie fine tip</td>
			<td>write sample number on tape</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plate competition assay as a quick preliminary assessment of disease suppression

O objetivo era desenvolver e otimizar um bioensaio de simples, acessível e eficaz para detectar a capacidade supressora de doença de um composto específico contra soilborne fungo Rhizoctonia solani. R. solani é um patógeno de uma vasta gama de hospedeiros de planta em todo o mundo. O fungo sobrevive no solo como uma Saprófita e cresce rapidamente em meios de ágar água simples. O ensaio de placa é um método rápido para comparar compostos por sua capacidade de retardar o crescimento de r. solani. O ensaio também se correlaciona bem com a supressão de outros patógenos fúngicos soilborne que sobrevivem como saprófitas em solos como início definha Alternaria, murcha de Fusarium, podridão radicular de Phytophthora e Pythium podridão de raiz.

Adubo terminado deve ser estável e maduro, dois termos que frequentemente são utilizados indistintamente, portanto pode com segurança ser embalado e transportado e não causa efeitos adversos durante a sua utilização final4. Estabilidade é uma resistência à decomposição e geralmente é determinada usando índices de atividade microbiana. Medidas gerais da respiração microbiana podem medir a estabilidade de adubo, mas não necessariamente doenç...

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A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

Apresentado é um protocolo para um ensaio de competição de placa identificar se um adubo específico é susceptível de conter bactérias e fungos que inibem o crescimento de Rhizoctonia solani.

Um ensaio de competição de placa como uma rápida avaliação preliminar de supressão da doença

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave relacionadas ao controle biológico de patógenos vegetais transportados pelo solo. O padrão-ouro para testar materiais como adubo é ter um bioensaio vegetal para testar se é tóxico para as plantas. No entanto, isso leva três semanas.Este método pode ser feito em cerca de dois a três dias. A principal vantagem dessa técnica é que ela é simples, acessível e eficaz. Este ensaio é uma rápida triagem de composto específico para suprimir o crescimento da Rizoctonia solani.No entanto, este ensaio também pode ser usado contra outros patógenos vegetais transportados pelo solo, como Fusariums, Pythiums e Phytophthoras. A demonstração visual deste método é fundamental porque é preciso isolar e manter uma cultura pura de fungo, evitando a contaminação. Demonstrando o procedimento de isolamento será Taylor Readyhough, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.Emma Wright, uma estudante de graduação do meu laboratório, vai demonstrar o ensaio da competição. Para começar, semeie sementes de rabanete vermelho no solo conhecido por ter um histórico de doença causada por R.solani. Após três a quatro semanas, retire as mudas do solo e enxágue-as com água da torneira.Usando uma lâmina de barbear, corte segmentos de um centímetro do hipocotyl e raiz que tenham uma cor marrom. Em seguida, use fórceps esterilizados por chamas para mergulhar os segmentos em solução de alvejante de 10% por um minuto. Depois disso, enxágue os segmentos em água estéril.Em seguida, use fórceps esterilizados por chamas para transferir os segmentos para uma toalha de papel. Bata os segmentos secos, e transfira-os para uma placa de Petri com ágar de água. Coloque a placa de Petri dentro de um recipiente com tampa, e incubar os segmentos à temperatura ambiente.Para estabelecer uma cultura filha, transfira um dos segmentos para o centro de um prato fresco de dextrose de batata ágar. Depois disso, autoclave tubos de ensaio de 25 mililitros contendo 10 mililitros de água. Adicione duas amostras de 0,5 gramas de cada amostra de teste a um par de tubos de ensaio autoclaved com 10 mililitros de água estéril, e agite os tubos de ensaio durante a noite.Após 24 horas, adicione 1,5 gramas de ágar simples e 90 mililitros de água destilada a um par de frascos cônicos. Depois de autoclavar os frascos, coloque-os em um banho de água Celsius de 45 graus por 30 minutos. Em seguida, despeje a amostra de referência autoclavada e a amostra viva no ágar derretido.Despeje as misturas de cada frasco em cinco pratos de Petri. Para proteger os micróbios indígenas, é importante não adicionar o adubo enquanto o ágar estiver muito quente. Portanto, deixe o ágar esfriar a 45 graus Celsius antes de adicionar o adubo.Utilizando técnica asséptica, transfira peças de R.solani para cada par de placas de amostra. Em seguida, incubar as placas em temperatura ambiente por um a dois dias. Finalmente, use uma régua clara e plana e um microscópio estéreo para medir o raio do micélio em cada placa até o milímetro mais próximo.Neste protocolo, extratos de compostos vivos suprimiram significativamente mais o crescimento de R.solani do que amostras autoclavadas, demonstrando que o efeito era microbiano e não à base de nutrientes. A supressividade é medida como uma redução do crescimento em comparação com o controle autoclaved. O crescimento não foi afetado pela duração do amadurecimento ou cura do composto.O crescimento foi significativamente afetado pelo método de compostagem e ingredientes de receita, especificamente com vermicompost, processos de windrow e receitas com casca de madeira. Após seu desenvolvimento, essa técnica pode ser candidata à certificação comercial de composto para propriedades supressivas de doenças.

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