Name: a plate competition assay as a quick preliminary assessment of disease suppression
Uploaded: 2018-10-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression at JoVE.com

Vermont jordbruks Experiment Station konkurrenskraftiga Hatch Program VT-HO1609 finansierade forskningen. Lynn Fang används metoden som en del av sin M.S. avhandling vid University of Vermont6.

1. Förbered i förväg
<ol><li>Master svamp kultur (testorganismen)<ol>
<li>Beställ från amerikanska typ kultur insamling, mikrobiologi samling9, genom dess teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) eller MYA 4031.</li>
		<li>Alternativt: Samla lokala isolat som görs av författarna. Plantor av röda rädisa (Raphanus sativus) fungerar bra som en bete växt; samla in jord från en plats känd för att ha en historia av dämpning-off eller Rota rötan orsakas a...

<ol>
	<li>Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review.+Biology+and+systematics+of+the+form+genus+Rhizoctonia.">Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia.</a> Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).</li><li>Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+soilborne+fungal+diseases+with+organic+amendments.">Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments.</a> Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).</li><li>Noble, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+and+benefits+of+soil+amendment+with+composts+in+relation+to+plant+pathogens.">Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens.</a> Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).</li><li>Wichuk, K. M., McCartney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compost+stability+and+maturity+evaluation+-+a+literature+review.">Compost stability and maturity evaluation - a literature review.</a> Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).</li><li>Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+composted+olive+mill+wastes+to+predict+potential+plant+disease+suppressiveness.">Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness.</a> Biological Control. 3, 199-207 (2011).</li><li>Fang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani. , (2015).</li><li>Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+characteristics+of+organic+soil+amendments+that+suppress+soilborne+plant+diseases.">Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).</li><li>Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecoenzymes+as+indicators+of+compost+to+suppress+Rhizoctonia+solani.">Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani.</a> Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).</li><li>. ATCC&#174; Mycology Culture Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx">https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx</a> (2018)</li><li>Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -. D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gamma-sterilization+and+autoclaving+on+soil+organic+matter+structure+as+studied+by+solid+state+NMR,+UV+and+fluorescence+spectroscopy.">Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy.</a> European Journal of Soil Science. 59, (2008).</li></ol>

Vi vet från tidigare forskning, att vissa komposter är effektiva på att undertrycka R. solani och att suppressiv effekterna är på grund av de mikrober som lever i komposten, inte abiotiska egenskaperna för kompost6,8. Användningen av autoklav som ett sätt att 'döda' bakterieflora har kritiserats eftersom den påverkar de media10kol kemi. Vi jämförde användningen av autoklavering till dammsugarfilter genom Whatman nr 1 ...

Rhizoctonia representerar ett brett komplex av svampar, av vilka Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk (anamorph = Rhizoctonia solani Kühn) är den patogen som orsakar rotröta och dämpning-off1. Rhizoctonia solani är en aggressiv patogen och en saprophyte som kan överleva som sklerotier under ogynnsamma miljöförhållanden1. Som ett resultat, den har en global distribution och kan orsaka sjukdom på brett utbud av växten varar värd inklusive Solanaceae, ärtväxter, Asteraceae och korsblommiga växter som medför allvarliga ekonomiska förluster.
Komposten har kapacitet att hysa Agrilus agenter för vissa växt patogener2. Dock inte alla komposter är likadana, inte heller påverkar de alla patogener likaså3. Trä-baserade kol har högre lignin till cellulosa nyckeltal än hö eller halm-kol baserade komposter. R. solani föredrar lättillgängliga kol Funna i halm. Däremot är biologisk bekämpning svampar, såsom Trichoderma spp., mer effektiva när kol är mindre lättillgängliga. Nyttiga svampar och bakterier till kompost kan undertrycka växtsjukdomar genom konkurrens, antagonism eller reglera växt tillväxt3. Föreslagna analysen identifierar primärt antagonism skapad av produktion av antibiotika, ecoenzymes eller kelater som är skadliga för patogen.
Växter bioassays är en guld-standard för att avgöra om komposter gynna eller avskräcka växt tillväxt4. Växter bioassays är dock tidskrävande (veckor till månader) att slutföra som kan vara längre än önskat och kräver mer arbete att extrahera växter med rötter att kvantifiera graden av rotsystem. Comparably robust men snabbare (dagar) analyser skulle vara perfekt för kvalitetskontroll program. Syftet med denna uppsats är att visa en relativt snabb och noggrann test för att förutsäga suppressiv potential av kompost. Metoden var mönstrad efter Alfano o.a. 5 med två undantag, kompost extrakt späddes och vatten agar användes i stället för potatis dextros agar (PDA). R. solani växer snabbt på enkelt vatten agar media PDA främjat tillväxt av bakterier och andra svampar som förorenat den kultur6.
Denna plattan analys fungerar som en indikator av förtryck som gäller för en rad växt patogener som överlever i jord som saprofyter inklusive R. solani7, Alternaria tidiga blights, Fusarium vissnesjuka, Phytophthora rotröta och Pythium rotröta. Plattan konkurrens analysen är användbar till skärmen en rad kompost produkter för innehåller samhällen av mikrober som tjänar som biologiska kontrollagenter jord patogener. Analysen var en av de mest konsekventa indikatorerna av sjukdom bekämpande i kommersiella kompost produkter6,8. Produkter valdes för sin variation i recept, mognad och produktionsprocessen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoclavable narrow-neck glass conical flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-040D</td>
			<td>125-mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dehydrated granulated agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0145-17-0</td>
			<td>500 g quantity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat resistant gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MEMGG1314WL</td>
			<td>several brands available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm (strips of 2-3 cm wide)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PM992 13-374-16</td>
			<td>5 or 10 cm widths work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable polystyrene petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R80116</td>
			<td>comes in sleeves of 20/ea or cases of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dehydrated potato dextrose agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0013-15-8</td>
			<td>comes in quantities of 100, 500 and 2000 grams</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benchtop reciprocal shaker</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1227Y31</td>
			<td>other models will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>S37363</td>
			<td>5L general purpose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear ruler, flat, at least 10 cm</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>use metric rule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATCC culture</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 10154</td>
			<td>teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) or MYA 4031;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15935</td>
			<td>autoclavable and removable, 1&#34; wide preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water resistant marker</td>
			<td>office or scientific supply</td>
			<td>Sharpie fine tip</td>
			<td>write sample number on tape</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plate competition assay as a quick preliminary assessment of disease suppression

Målet var att utveckla och optimera en enkel, prisvärd och effektiv bioassay för att upptäcka sjukdom suppressiv förmågan hos en specifik kompost mot soilborne svampen Rhizoctonia solani. R. solani är en patogen av ett brett utbud av växten varar värd över hela världen. Svampen överlever i jordar som en saprophyte och växer snabbt på enkelt vatten agar media. Plattan analysen är en snabb metod att jämföra komposter för deras förmåga att bromsa tillväxten av R. solani. Analysen också korrelerar väl med dämpning av andra soilborne svamp patogener som överlever som saprofyter i jordar som Alternaria tidiga blights, Fusarium vissnesjuka, Phytophthora rotröta och Pythium rotröta.

Färdiga komposten bör vara stabil och mogen, två termer som ofta används omväxlande, så det kan vara säkert förpackade och transporteras, och inte orsaka negativa effekter under dess slutanvändning4. Stabilitet är ett motstånd mot nedbrytning och vanligtvis bestäms med hjälp av index av mikrobiell aktivitet. Allmänna åtgärder av mikrobiell andning kan mäta kompost stabilitet, men inte nödvändigtvis sjukdom dämpning av en aggressiv patog...

Watch this Scientific Journal Video about A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression at JoVE.com

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

Presenteras är ett protokoll för en tallrik konkurrens analys identifiera om en specifik kompost sannolikt innehåller bakterier och svampar som hämmar tillväxten av Rhizoctonia solani.

En tallrik konkurrens analys som en snabb preliminär bedömning av sjukdom dämpning

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor som rör biologisk kontroll av jordburna växtpatogener. Guldmyntfoten för att testa material som kompost är att ha en växt bioassay att testa om det är giftigt för växterna. Men det tar tre veckor.Denna metod kan göras i ungefär två till tre dagar. Den största fördelen med denna teknik är att det är enkelt, prisvärd, och effektiv. Denna analys är en snabb screening av specifik kompost för att undertrycka tillväxten av Rhizoctonia solani.Emellertid, Denna halt kan också användas mot andra soilborne växt patogener, såsom Fusariums, Pythiums, och Phytophthoras. Visuell demonstration av denna metod är kritisk eftersom den tar hand om att isolera och upprätthålla en ren kultur av en svamp samtidigt som man undviker kontaminering. Demonstrera isolering förfarandet kommer att Taylor Readyhough, en doktorand från mitt laboratorium.Emma Wright, en grundutbildning student från mitt laboratorium, kommer att visa tävlingen analysen. Till att börja, så röd rädisa frön i jord kända för att ha en historia av sjukdom som orsakas av R.solani. Efter tre till fyra veckor, ta bort plantorna från jorden och skölj dem med kranvatten.Med hjälp av ett rakblad, skär en centimeter segment av hypocotyl och rot som har en brun färg. Använd sedan flamsteriliserade tyfningar för att doppa segmenten i 10%blekmedelslösning i en minut. Efter detta, skölj segmenten i sterilt vatten.Därefter använder flamma-steriliserade tyfningar för att överföra segmenten till en pappershandduk. Klappa segmenten torra, och överföra dem till en petriskål med vattenagar. Placera petriskålen inuti en behållare med lock och inkubera segmenten i rumstemperatur.För att etablera en dotterkultur, överför en av segmenten till mitten av en färsk tallrik potatis dextros agar. Efter detta autoklav 25-milliliter provrör som innehåller 10 milliliter vatten. Tillsätt två 0,5-gramsprover av varje provprov till ett par autoklaverade provrör med 10 milliliter sterilt vatten, och skaka provrören över natten.Efter 24 timmar, tillsätt 1,5 gram vanlig agar och 90 milliliter destillerat vatten till ett par koniska kolvar. Efter autoklavering av kolvarna, placera dem i en 45-graders Celsius vattenbad i 30 minuter. Därefter häller du det autoklaverade referensprovet och det levande provet i den smälta agaren.Häll blandningarna från varje kolv i fem petriskålar. För att skydda de inhemska mikroberna är det viktigt att inte lägga till komposten medan agarn är för varm. Låt därför agaren svalna till 45 grader Celsius innan du lägger till komposten.Med hjälp av aseptisk teknik överför du bitar av R.solani till varje par av provplattor. Därefter, inkubera plattorna i rumstemperatur i en till två dagar. Slutligen, använd en klar, platt linjal och ett stereomikroskop för att mäta mycelets radie i varje platta till närmaste millimeter.I detta protokoll, extrakt från levande komposter undertryckt R.solani tillväxt betydligt mer än autoklaverade prover, visar att effekten var mikrobiell och inte näringsbaserade. Suppressivitet mäts som en minskning av tillväxten jämfört med den autoklaverade kontrollen. Tillväxten påverkades inte av varaktigheten av mognad eller härdning av komposten.Tillväxten påverkades avsevärt av kompostmetod och ingredienser recept, särskilt med vermicompost, windrow processer, och recept med lövträ bark. Efter dess utveckling, denna teknik kan vara en kandidat för kommersiell certifiering av kompost för sjukdomsdämpande egenskaper.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Tillämpning av en C. elegans Dopamin Neuron Degeneration-analys för validering av potentiella Parkinsons sjukdomsgener

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Sigmas Ospecifika Protease Activity-analys - Kasein som substrat

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

Användning av Rotorod som en metod för kvalitativ analys av Walking i Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosom Bundna framväxande Polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; För att identifiera Translationell Paus webbplatser Längs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Använda SecM Arrest sekvens som ett verktyg för Isolera ribosom Bundna Polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Övervakning av intraspecieskonkurrens i en bakteriecellpopulation genom kokultivering av fluorescerande märkta stammar

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Xenopus laevis som en modell för att identifiera Översättning Nedskrivningar

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analys - En hög genomströmning, Realtid PCR-analys för Sc2.0 Genotypning

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

Time-lapse video Mikroskopi för bedömning av EYFP-Parkin Aggregation som en markör för Cellular Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...