Name: gene-therapy inspired polycation coating for protection of dna origami nanostructures
Uploaded: 2019-01-19T14:30:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures at JoVE.com

इस परियोजना को अनुदान समझौते सं ६८६६४७ के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से धन प्राप्त हुआ है. उनि छवियां एक Morgagni पर दर्ज की गई ८० एम पर संचालित वियना के लिए केंद्र की सुविधा GmbH (VBCF) । हम चित्रमय डिजाइन में सहायता के लिए Tadija Kekic और एलिसा De LIano वायरफ़्रेम nanostructure डिजाइनिंग के लिए धंयवाद देना चाहूंगा ।

<ol>
	<li>Jones, M. R., Seeman, N. C., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials.+Programmable+materials+and+the+nature+of+the+DNA+bond.">Nanomaterials. Programmable materials and the nature of the DNA bond.</a> Science. 347 (6224), 1260901 (2015).</li><li>Rothemund, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li><li>Takabayashi, S., Klein, W. P., Onodera, C., Rapp, B., Flores-Estrada, J., Lindau, E., Snowball, L., Sam, J. T., Padilla, J. E., Lee, J., Knowlton, W. B., Graugnard, E., Yurke, B., Kuang, W., Hughes, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+and+high+yield+fabrication+of+dense+nanoparticle+arrays+onto+DNA+origami+at+statistically+independent+binding+sites.">High precision and high yield fabrication of dense nanoparticle arrays onto DNA origami at statistically independent binding sites.</a> Nanoscale. 6 (22), 13928-13938 (2014).</li><li>Kuzyk, A., Schreiber, R., Zhang, H., Govorov, A. O., Liedl, T., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconfigurable+3D+plasmonic+metamolecules.">Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules.</a> Nature Material. 13 (9), 862-866 (2014).</li><li>Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+logic-gated+nanorobot+for+targeted+transport+of+molecular+payloads.">A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads.</a> Science. 335 (6070), 831-834 (2012).</li><li>Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reconfigurable+DNA+Accordion+Rack.">A Reconfigurable DNA Accordion Rack.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).</li><li>Kielar, C., Xin, Y., Shen, B., Kostiainen, M. A., Grundmeier, G., Linko, V., Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+stability+of+DNA+origami+nanostructures+in+low-magnesium+buffers.">On the stability of DNA origami nanostructures in low-magnesium buffers.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (30), 9470-9474 (2018).</li><li>Hahn, J., Wickham, S. F. J., Shih, W. M., Perrault, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+the+instability+of+DNA+nanostructures+in+tissue+culture.">Addressing the instability of DNA nanostructures in tissue culture.</a> ACS Nano. 8 (9), 8765-8775 (2014).</li><li>Al-Dosari, M. S., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+Gene+Delivery:+Principle,+limitations,+and+recent+progress.">Nonviral Gene Delivery: Principle, limitations, and recent progress.</a> The AAPS Journal. 11 (4), 671 (2009).</li><li>Ibraheem, D., Elaissari, A., Fessi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+and+DNA+delivery+systems.">Gene therapy and DNA delivery systems.</a> International Journal of Pharmaceutics. 459 (1-2), 70-83 (2014).</li><li>Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+development+of+polymers+for+gene+delivery.">Design and development of polymers for gene delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).</li><li>Ponnuswamy, N., Bastings, M. M. C., Nathwani, B., Ryu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligolysine-based+coating+protects+DNA+nanostructures+from+low-salt+denaturation+and+nuclease+degradation.">Oligolysine-based coating protects DNA nanostructures from low-salt denaturation and nuclease degradation.</a> Nature Communication. 8, 15654 (2017).</li><li>Agarwal, N. P., Matthies, M., G&#252;r, F. N., Osada, K., Schmidt, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Block+copolymer+micellization+as+a+protection+strategy+for+DNA+origami.">Block copolymer micellization as a protection strategy for DNA origami.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (20), 5460-5464 (2017).</li><li>Kiviaho, J. K., Linko, V., Ora, A., Tiainen, T., J&#228;rvihaavisto, E., Mikkil&#228;, J., Tenhu, H., Nonappac, M. A., Kostiainen, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+polymers+for+DNA+origami+coating+-+examining+their+binding+efficiency+and+tuning+the+enzymatic+reaction+rates.">Cationic polymers for DNA origami coating - examining their binding efficiency and tuning the enzymatic reaction rates.</a> Nanoscale. 8 (22), 11674-11680 (2016).</li><li>Perrault, S. D., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-inspired+membrane+encapsulation+of+DNA+nanostructures+to+achieve+in+vivo+stability.">Virus-inspired membrane encapsulation of DNA nanostructures to achieve in vivo stability.</a> ACS Nano. 8 (5), 5132-5140 (2014).</li><li>Ahmadi, Y., De Llano, E., Bari&#353;i&#263;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Poly)cation-induced+protection+of+conventional+and+wireframe+DNA+origami+nanostructures.">(Poly)cation-induced protection of conventional and wireframe DNA origami nanostructures.</a> Nanoscale. 10 (16), 7494-7504 (2018).</li><li>Douglas, S. M., Marblestone, A. H., Teerapittayanon, S., Vazquez, A., Church, G. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+of+3D+DNA-origami+shapes+with+caDNAno.">Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).</li><li>Veneziano, R., Ratanalert, S., Zhang, K., Zhang, F., Yan, H., Chiu, W., Bathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+nanoscale+DNA+assemblies+programmed+from+the+top+down.">Designer nanoscale DNA assemblies programmed from the top down.</a> Science. 352 (6293), 1534 (2016).</li><li>Castro, C. E., Kilchherr, F., Kim, D. N., Shiao, E. L., Wauer, T., Wortmann, P., Bathe, M., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+to+scaffolded+DNA+origami.">A primer to scaffolded DNA origami.</a> Nature Methods. 8 (3), 221-229 (2011).</li><li>Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+and+Characterization+of+a+Bio-responsive+Robot+from+DNA+Origami.">Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami.</a> Journal of Visualized Experiment. (106), 51272 (2015).</li><li>Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+bio-responsive+robot+from+DNA+origami.">Designing a bio-responsive robot from DNA origami.</a> Journal of Visualized Experiment. (77), 50268 (2013).</li><li>Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+complex+two-dimensional+shapes+from+single-stranded+DNA+tiles.">Self-assembly of complex two-dimensional shapes from single-stranded DNA tiles.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), 52486 (2015).</li><li>Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+scalable+preparation+of+pure+and+dense+DNA+origami+solutions.">Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).</li><li>Grigsby, C. L., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+protection+and+release+of+DNA:+tools+to+address+a+bottleneck+of+non-viral+gene+delivery.">Balancing protection and release of DNA: tools to address a bottleneck of non-viral gene delivery.</a> Journal of the Royal Society Interface. 7 (1), 67-82 (2010).</li><li>Li, T., Dong, S., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplex+aptamers+with+peroxidase-like+DNAzyme+functions:+which+is+the+best+and+how+does+it+work.">G-quadruplex aptamers with peroxidase-like DNAzyme functions: which is the best and how does it work.</a> Chemistry - An Asian Journal. 4 (6), 918-922 (2009).</li><li>Cassinelli, V. 1., Oberleitner, B., Sobotta, J., Nickels, P., Grossi, G., Kempter, S., Frischmuth, T., Liedl, T., Manetto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Step+Formation+of+"Chain-Armor"-Stabilized+DNA+Nanostructures.">One-Step Formation of "Chain-Armor"-Stabilized DNA Nanostructures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (27), 7795-7798 (2015).</li><li>Gerling, T., Kube, M., Kick, B., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-programmable+covalent+bonding+of+designed+DNA+assemblies.">Sequence-programmable covalent bonding of designed DNA assemblies.</a> Science Advances. , 1157 (2018).</li><li>Xia, T., Kovochich, M., Liong, M., Meng, H., Kabehie, S., George, S., Zink, J. I., Nel, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+Coating+Enhances+the+Cellular+Uptake+of+Mesoporous+Silica+Nanoparticles+and+Allows+Safe+Delivery+of+siRNA+and+DNA+Constructs.">Polyethyleneimine Coating Enhances the Cellular Uptake of Mesoporous Silica Nanoparticles and Allows Safe Delivery of siRNA and DNA Constructs.</a> ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).</li></ol>

लेखक इस रिपोर्ट से संबंधित हित का कोई टकराव नहीं घोषित करते हैं.

आत्म-डीएनए origami के विधानसभा में, प्रधान किस्में आम तौर पर पाड़ को 5-10 अतिरिक्त अनुपात में जोड़ रहे हैं । ये अतिरिक्त प्रधान किस्में भी monometer रेंज में polycation और फॉर्मल polyplexes को बाँधती हैं जो आगे चलकर मुश्किल से डीएनए origami polyplexes से अलग हो जाती हैं. इसलिए, polyplex गठन में एक महत्वपूर्ण कदम अतिरिक्त प्रधान किस्में हटाने और अच्छी तरह से शुद्ध डीएनए origami nanostructures का उपयोग करने के लिए है ।
अंय तरीकों से एक क्लिक प्रतिक्रिया26के माध्यम से डीएनए किस्में के cyclization जैसे डीएनए nanostructures स्थिर करने के लिए विकसित किया गया है । के रूप में alkyne-और azide-संशोधित स्टेपल किस्में इंटरलॉकिंग एकल-असहाय छल्ले के गठन के लिए आवश्यक हैं, इस तकनीक छोटे nanostructures के स्थिरीकरण ऐसे डीएनए catenane के लिए सीमित है, और यह बड़ा डीएनए origami के लिए आसानी से स्केलेबल नहीं है इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए लोगों के रूप में संरचना । हाल ही में, Gerling एट एएल27 आबंध cyclobutene न्यूक्लियोटाइड डिमर (सीपीडी) डीएनए thymidines में पराबैंगनी विकिरण का उपयोग कर के भीतर पड़ोसी nanostructures के बीच बांड बनाने के लिए एक विधि की सूचना दी । हालांकि इस विधि साइट चयनात्मक और स्केलेबल है, डीएनए origami की रक्षा में अपनी दक्षता polycation कोटिंग की तुलना में बहुत कम है । उदाहरण के लिए, सीपीडी-स्थिर डीएनए origami वस्तुओं केवल ०.४ यू/एमएल DNase मैं 1 घंटे के लिए सहना, जबकि polyplexes 10 यू/एमएल DNase मैं कम एक दिन के लिए की उपस्थिति में स्थिर थे ।
संक्षेप में, जीन थेरेपी प्रेरित chitosan और LPEI कोटिंग एक कम लागत, एक कदम और कुशल विधि के लिए डीएनए origami nanostructures की दीर्घकालिक स्थिरता का पता है Mg-घट और nuclease-रिच मीडिया । polyplex गठन की reversibility बहु-चरणीय नैदानिक परीक्षणों में अपने आवेदन की सुविधा देती है जहां nucleolytic क्षरण या नमक-घट के विरुद्ध डीएनए origami की सुरक्षा एक कदम में महत्वपूर्ण है लेकिन अन्य चरणों में ऐसी समस्या पैदा हो सकती है जैसे डीएनए प्रवर्धन. साथ ही, polycation कोटिंग के लिए एक संभावित दृष्टिकोण है सेलुलर बढ़ाने के लिए डीएनए origami nanostructures दवा वितरण अनुप्रयोगों के लिए28.

डीएनए नेनो संरचनाओं1के प्रोग्राम स्व-विधानसभा के लिए एक बहुमुखी इमारत ब्लॉक है । डीएनए nanostructures बनाने के लिए सबसे लोकप्रिय तरीका डीएनए origami तकनीक है, जो स्वयं पर आधारित है एक लंबे परिपत्र के विधानसभा, एकल असहाय डीएनए पाड़ छोटे आकार के सैकड़ों की सहायता के साथ सिंथेटिक स्टेपल किस्में2का निर्धारण । आज, डीएनए nanostructures का निर्माण लगभग किसी भी ज्यामिति और आकृति विज्ञान में आसानी से संभव है । डीएनए nanostructures साइट हो सकता है-विशेष रूप से उच्च परिशुद्धता के साथ कार्यात्मक3,4 और allosteric के गठन के परिवर्तन से गुजरना क्रमादेशित किया जा सकता है5,6। इसलिए, एक निर्माण सामग्री के रूप में डीएनए का उपयोग कर अद्वितीय संवेदन, निदान और दवा वितरण में अनुप्रयोगों के लिए प्रोग्राम और उत्तरदायी कस्टम डिजाइन nanostructures बनाने का अवसर प्रदान करता है । हालांकि, डीएनए nanostructures exoद्वारा पाचन के लिए अतिसंवेदनशील होते है-और इंडो-nucleases, और जाली आधारित 3 डी डीएनए origami nanostructures आम तौर पर उच्च लवणता बफ़र्स (जैसे, 5-20 mM मिलीग्राम+ 2) की आवश्यकता को बनाए रखने के लिए अपने निष्ठा7,8.
रक्त में मौजूद nucleases द्वारा डीएनए का तेजी से क्षरण और extracellular मैट्रिक्स9कोशिकाओं में आनुवंशिक उत्पादों के वितरण vivo में कुशल करने के लिए एक बड़ी बाधा है । इस सीमा पर काबू पाने के लिए, गैर वायरल जीन डिलीवरी में, डीएनए एक cationic बहुलक के साथ एक परिभाषित एन/पी चार्ज अनुपात में मिलाया जाता है (polycation में डीएनए में फॉस्फेट्स के अनुपात)10। एक cationic बहुलक के साथ डीएनए के परिसर, polyplex के रूप में जाना जाता है, nuclease-मध्यस्थता क्षरण से डीएनए की रक्षा और अपनी सेलुलर वृद्धि11बढ़ाता है । जीन डिलिवरी प्रगति से प्रेरित, oligolysine12, oligolysine-पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) copolymers13, पाली (2-dimethylamino-ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-आधारित पॉलिमर14, और वायरस कैप्सिड प्रोटीन15 डीएनए origami nanostructures स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।
हाल ही में, हम डीएनए origami nanostructures के संरक्षण के लिए एक विधि की सूचना दी मिलीग्राम-घट और nuclease-रिच प्राकृतिक cationic polysaccharide chitosan और सिंथेटिक रैखिक polyethyleneimine (LPEI) का उपयोग कर मीडिया16बताया गया था । यह लेख हमारे पहले काम का एक अनुकूलन है और polyplexes की तैयारी के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन, उनके लक्षण वर्णन, नग्न और संरक्षित nanostructures में कम नमक और nuclease अमीर मीडिया की स्थिरता का परीक्षण और जांच एंजाइम की पता-और aptamer कार्यात्मक polycation कोटिंग पर डीएनए origami nanostructures ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1135px;" width="1136">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">10&#215; DNase I reaction buffer</td>
			<td style="width:239px;">New England Biolab (NEB)</td>
			<td style="width:183px;">B0303</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">ABTS (2&#8242;-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt)</td>
			<td style="width:239px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:183px;">J65535</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Amicon ultracentrifugation columns</td>
			<td style="width:239px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:183px;">UCF500308, UCF510024</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:547px;">Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, &#62; 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">523682</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Design-specific staple strands</td>
			<td style="width:239px;">Integrate DNA Technologies (IDT)</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">75027</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">42867</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">DNA gel loading dye (6&#215;)</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">R0611</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">DNase I (RNase free)</td>
			<td style="width:239px;">New England Biolab (NEB)</td>
			<td style="width:183px;">M0303</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">E3889</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, &#8805;99% (titration)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">EDS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Freeze&#39;N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns</td>
			<td style="width:239px;">Biorad</td>
			<td style="width:183px;">7326165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Hemin</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">H9039</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">HEPES</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">H3375</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Hydrogen peroixde slution (32 wt%)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">216763</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">LPEI-25 kDa</td>
			<td style="width:239px;">Polysciences, Inc</td>
			<td style="width:183px;">23966-1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT))</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">NP0004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:547px;">Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da)</td>
			<td style="width:239px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:183px;">O263.1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI &#8804;1.2</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">765090</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI &#8804;1.3</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">764582</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Proteinase K solution (20 mg/ml)</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">AM2548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Streptavidin-conjugated HRP</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">N100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">SYBER safe DNA gel stain</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">S33102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene-therapy inspired polycation coating for protection of dna origami nanostructures

डीएनए origami nanostructures एक अपार क्षमता पकड़ जैविक और चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए । हालांकि, कम नमक की स्थिति और शारीरिक तरल पदार्थ में nucleases विकार और आत्म इकट्ठे डीएनए nanostructures के क्षरण के लिए प्रेरित । गैर वायरल जीन डिलिवरी में, डीएनए के एंजाइमी क्षरण एक cationic खोल में नकारात्मक आरोप डीएनए के encapsulation से दूर है । इस के साथ साथ, जीन प्रसव प्रगति, एक सरल, एक कदम और मजबूत पद्धति से प्रेरित डीएनए origami nanostructures के स्थिरीकरण के लिए उंहें chitosan और रैखिक polyethyleneimine के साथ कोटिंग द्वारा प्रस्तुत किया है । polycation कोटिंग कुशलतापूर्वक एमजी-घट और nuclease-रिच मीडिया में डीएनए origami nanostructures की रक्षा करता है । यह विधि भी एंजाइम की पूर्ण पता और डीएनए nanostructures के aptamer आधारित functionalization को बरकरार रखता है ।

तीन डीएनए origami nanostructures विभिंन विंयास के डिजाइन किए गए थे, जिसमें एक nanorod (NR), एक nanobottle (एनबी) और एक वायरफ़्रेम nanostructure (WN) (nanostructures के 3d मॉडल चित्रा 2में सचित्र हैं) । NR और NB एक वर्ग और छत्ते जाली के आधार पर डिजाइन किए गए थे, क्रमशः,17 caDNAno का उपयोग कर और WN डेडोलस सॉफ्टवेयर18का उपयोग कर बनाया गया था. डिजाइन और आत्म डीएनए nanostructures के विधानसभा के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल पहले से ही प्रकाशित किया गया है19,20,21,22। आकार विशिष्ट स्टेपल किस्में आदेश दिया, स्वयं इकट्ठे हुए थे और आगे एक Stahl एट अलद्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के आधार पर शुद्ध । 23 (चरण 2) ।
Polyplexes जेल मंदता परख और nsTEM इमेजिंग द्वारा विशेषता थे । polycations, कैथोड की ओर नग्न nanostructure बैंड में एक बदलाव के साथ डीएनए origami मिश्रण पर (चित्रा 1ए) मनाया गया । यह polycations के लिए बाध्यकारी और परिसर के समग्र आकार वृद्धि पर फॉस्फेट समूहों के नकारात्मक प्रभार के प्रतिसंतुलन के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । dextran सल्फेट जैसे polyanions की एक अतिरिक्त राशि जोड़ने polyplex गठन रिवर्स कर सकते हैं । इस संबंध में, उच्च आणविक वजन की dextran सल्फेट (एमडब्ल्यू ~ ४० केडीए) कम आणविक भार dextran सल्फेट (एमडब्ल्यू ~ 4 केडीए) की तुलना में विरूपण के लिए अधिक कुशल होना दिखाया (चित्रा 1बी).
जबकि इमेजिंग LPEI polyplexes द्वारा uranyl एसीटेट नेगेटिव दाग उनि, यह किसी भी कणों छवि मुश्किल था । यह कल्पना की थी कि LPEI uranyl एसीटेट के लिए डीएनए origami के तंग ढाल के कारण फॉस्फेट रीढ़ की बाध्यकारी से बाधा हो सकती है । इसलिए, nsTEM इमेजिंग करने से पहले, dextran सल्फेट की एक अतिरिक्त राशि LEPI polyplexes में जोड़ा गया था । खंडित डीएनए origami nanostructures दोष और न ही अपघटन का कोई संकेत नहीं दिखाया । इसके विपरीत, chitosan polyplexes सफलतापूर्वक polyanion उपचार (चित्रा 2) के लिए कोई ज़रूरत नहीं के साथ छवि थे ।
सभी नग्न डीएनए nanostructures (अपने अलग विंयास की परवाह किए बिना) पूरी तरह से ३७ ° c में एमजी में एक दिन के बाद विकृत थे शूंय बफर, के रूप में nsTEM इमेजिंग द्वारा की पुष्टि की । इसके विपरीत, N/P ≥ 1 पर LPEI या chitosan के साथ लेपित nanostructures बरकरार रहे । इसी प्रकार, DNase मैं अनुमापन परख एंजाइमी पाचन के प्रति असुरक्षित nanostructures की संवेदनशीलता को दिखाया । जबकि नग्न nanostructures पूरी तरह से 1 यू की उपस्थिति में पचा रहे थे/एमएल DNase मैं 2 घंटे के बाद, LEPI या chitosan समझाया डीएनए origami मिलीग्राम में बरकरार शूंय बफर 10 U/एमएल DNase मैं एक दिन की एक ंयूनतम के लिए के साथ पूरक (2 चित्रा) । nucleolytic पाचन की दिशा में उच्च स्थिरता polyplexes के एन/पी अनुपात में वृद्धि के द्वारा प्राप्त किया गया था । इसके अतिरिक्त, LPEI डीएनए nanostructures अधिक कुशलता से chitosan (चित्रा 3ए, चित्रा 3सी) की तुलना में, शायद LEPI के उच्च प्रभार घनत्व के कारण, और इस प्रकार, 24 डीएनए के प्रति उच्च बाध्यकारी अपनत्व की रक्षा करता है . अलग आणविक भार (चित्रबी) के LPEI का उपयोग करते समय कोई अंतर नहीं देखा गया ।
एक बहुलक खोल में encapsulation के बाद डीएनए nanostructures में कार्यात्मक समूहों के पते एक महत्वपूर्ण विशेषता है । इसके अलावा, सहिजन peroxidase एंजाइम (एचआरपी) और हेमीन-बाध्यकारी aptamers (बांधणी) कार्यात्मक डीएनए origami के साथ polycation कोटिंग की अनुकूलता की जांच की थी । तीन biotinylated स्टेपल किस्में NR की सतह से बहर और फिर एचआरपी संयुग्मित streptavidin के साथ कार्यात्मक (डीएनए origami प्रति तीन एंजाइमों) थे । उत्प्रेरक अत्यधिक सक्रिय (कश्मीरडी: ४३९ एनएम) बांधणी aptamer PS2 । एम (5 '-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3 ') को इन प्रयोगों के लिए25चुना गया था । के लिए 24 स्टेपल किस्में एक 5 एनएम लंबाई linker (5 '-AAAAGAAAAGAAAAA-3 ') PS2 द्वारा पीछा के साथ NR सतह से फैला रहे थे । एम अनुक्रम (डीएनए origami प्रति 24 aptamers) । एंजाइमी या aptamer गतिविधि का कोई उल्लेखनीय बाधा कोटिंग एचआरपी पर देखा गया था-या बांधणी-कार्यात्मक डीएनए origami के साथ LPEI और chitosan पर संस्करण N/P अनुपात (चित्रा 4A-B)16. हालांकि, एचआरपी एंजाइम की काइनेटिक है नाटकीय रूप से डीएनए origami (चित्रा 4सी) के लिए बाध्यकारी के बाद बदल गया है ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig1.jpg"> चित्रा 1 : polyplex गठन और decapsulation के प्रतिनिधि आयु छवियां । (क) 0.01-8 के एन/पी अनुपात में chitosan के साथ मिश्रित नायब के लिए electrophoretic गतिशीलता पारी परख । प्रत्येक लेन 1 nmol एनबी शामिल हैं । पहली लेन के संदर्भ एनबी है । (B) polyanionic dextran सल्फेट (DS) द्वारा polyplexes का Decapsulation. यह आंकड़ा एक पहले से प्रकाशित चित्र16से संशोधित किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig2.jpg"> चित्रा 2 : नकारात्मक दाग उनि डीएनए का माइक्रोग्राफ origami और polyplexes. 3d मॉडल और nsTEM नग्न डीएनए origami nanostructures के माइक्रोग्राफ (कॉलम 1 और 2) । LPEI polyplexes (decapsulation के बाद) और chitosan polyplexes (कॉलम 3 और 4) के nsTEM माइक्रोग्राफ । नग्न और संरक्षित डीएनए origami (polyplex) के nsTEM छवियों को एमजी कमी (कॉलम 5, 6 और 7), एंजाइमी क्षरण (कॉलम 8 और 9), सीरम पाचन (कॉलम 10 और 11) के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक दिन के लिए अधीन । इस परख में LPEI-5 केडीए का इस्तेमाल किया गया । नग्न डीएनए nanostructures 1 यू/एमएल DNase मैं या टीबी में 10% FBS की उपस्थिति में एक उंर पर पता लगाने से परे नीचा थे ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन के 2 एच के बाद । स्केल बार्स: १०० एनएम । यह आंकड़ा एक पहले से प्रकाशित चित्र16से संशोधित किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig3.jpg"> चित्रा 3 : DNase मैं सुरक्षा परख के प्रतिनिधि परिणाम । (क) LPEI के साथ WN के polyplexes के लिए DNase I प्रोटेक्शन परख-5 केडीए, LPEI-10 केडीए और LPEI-25 केडीए ने 2, 4, 8 और 10 के एन/पी अनुपात में तैयार किया. नमूने ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 10 यू/एमएल DNase I के अधीन थे । पिछले लेन नियंत्रण WN है । polyplexes जेल में लोड करने से पहले decapsulated थे । (ख) उम्र छवि से निकाले गए विभिन्न LPEI के साथ डीएनए origami के polyplexes के लिए सामान्यीकृत मतलब बैंड तीव्रता-A. Y अक्ष सामान्यीकृत माध्य बैंड तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है । (ग) 1, 2, 4, 10 और 20 के N/P अनुपात में तैयार chitosan-WN polyplexes की DNase I protection परख । नमूने ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 10 यू/एमएल DNase I के अधीन थे । लेन 6 नियंत्रण polyplex (N/पी 20) है । पिछले लेन नियंत्रण WN है । सभी chitosan polyplexes जेल में पहले से लोड decapsulated थे । यह आंकड़ा एक पहले से प्रकाशित चित्र16से संशोधित किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig4.jpg"> चित्रा 4: वर्णमिति एंजाइम के प्रतिनिधि परिणाम-और aptamer-कार्यात्मक डीएनए origami परख । (क) एंजाइम की वर्णमिति परख कार्यात्मक nanostructures (एचआरपी-NR) प्रतिक्रिया शुरू होने के बाद chitosan ३.७ ज के साथ लेपित । (ख) aptamer के वर्णमिति परख कार्यात्मक nanostructures (बांधणी-NR) chitosan, प्रतिक्रिया दीक्षा के बाद 6 मिनट के साथ लेपित । Y अक्ष सामान्यीकृत अवशोषक का प्रतिनिधित्व करता है । (ग) एचआरपी की वर्णमिति परख और एचआरपी-NR समय के साथ निगरानी. यह आंकड़ा एक पहले से प्रकाशित चित्र16से संशोधित किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Cationic पॉलीमर्स</td>
			<td>Chitosan</td>
			<td>LPEI-5 केडीए</td>
			<td>LPEI-10 केडीए</td>
			<td>LPEI-25 केडीए</td>
		</tr>
<tr>
<td>बहुलक का आणविक भार (केडीए)</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>मोनोमर के Molecualr वजन (g/</td>
			<td>१६१</td>
			<td>४३</td>
			<td>४३</td>
			<td>४३</td>
		</tr>
<tr>
<td>प्रति मोनोमर अमीन की संख्या</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>प्रति बहुलक अमीन की संख्या</td>
			<td>28</td>
			<td>११६</td>
			<td>२३२</td>
			<td>५८१</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1. polycation प्रति अमीन समूहों की संख्या की गणना.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>dextran सल्फेट (केडीए) का आणविक भार</td>
			<td>4</td>
			<td>४०</td>
		</tr>
<tr>
<td>मोनोमर के आणविक वजन (जी/</td>
			<td>३६६</td>
			<td>३६६</td>
		</tr>
<tr>
<td>प्रति मोनोमर सल्फेट की संख्या</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>प्रति बहुलक सल्फेट की संख्या</td>
			<td>22</td>
			<td>२२०</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 2. प्रति polyanion सल्फेट समूहों की संख्या की गणना.

Watch this Scientific Journal Video about Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures at JoVE.com

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

जीन थेरेपी डीएनए Origami Nanostructures के संरक्षण के लिए प्रेरित Polycation कोटिंग

यहां, एमजी में डीएनए origami nanostructures के संरक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल समाप्त हो गया और nuclease-प्राकृतिक cationic polysaccharide chitosan और सिंथेटिक रैखिक polyethyleneimine (LPEI) कोटिंग्स का उपयोग कर अमीर मीडिया प्रस्तुत किया है ।

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...

डीएनए नैनोस्ट्रक्चर का जैविक स्थिरीकरण भविष्य में इन-वीवो अनुप्रयोगों, जैसे लक्षित दवा वितरण के लिए आवश्यक है । हालांकि, डीएनए विभिन्न एंजाइमों द्वारा शरीर में अपमानित हो जाता है। यहां हम एक कोटिंग तकनीक पेश करते हैं जो डीएनए नैनोस्ट्रक्चर को एंजाइमेटिक गिरावट से बचाता है।मुख्य फायदे यह हैं कि हमारे कोटिंग में गैर-जहरीले यौगिक शामिल हैं जो पहले से ही जीवित जीवों में उपयोग किए जाते हैं और सतह का कार्यात्मककरण संभव रहता है। यह कार्यात्मकीकरण लक्षित मान्यता के लिए आणविक सेंसर को शामिल करने और दवा कार्गो रिलीज के लिए स्विच करने के लिए महत्वपूर्ण है। पॉलीएकेशन कोटिंग्स में समझाया डीएनए ओरिगेमी संरचनाओं के सेलुलर तेज को काफी बढ़ाता है, इसलिए यह विधि निदान और चिकित्सीय में डीएनए ओरिगेमिस के अनुप्रयोगों के लिए दरवाजा खोल सकती है।डीएनए नैनो के संभावित जीन डिलीवरी अनुप्रयोगों के लिए सेलुलर तेज की भी आवश्यकता होती है। मैं मानता हूं कि विधि काफी सरल है और आसानी से महारत हासिल की जा सकती है। शुरू करने के लिए, शुद्ध डीएनए ओरिगामी की एकाग्रता को मापने के लिए।पराबैंगनी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर को कैलिब्रेट करने के लिए खाली के रूप में टीबी बफर के दो माइक्रोलीटर का उपयोग करें। और फिर २६० नैनोमीटर पर डीएनए ओरिगेमी एकाग्रता को मापते हैं । फिर पांडुलिपि में वर्णित सूत्र दो का उपयोग करके शुद्ध डीएनए ओरिगेमी समाधान में फॉस्फेट की मात्रा की गणना करें।कमजोर पड़ने के लिए टीबी बफर का उपयोग करके फॉस्फेट के एक नैनोमोल को शामिल करके डीएनए ओरिगेमी संरचना के 15 माइक्रोलीटर तैयार करें। टीबी में 13.2 माइक्रोलीटर मिलाकर 1.8 माइक्रोलीटर चिटोसन करें। और आठ के एन/पी अनुपात के साथ डीएनए ओरिगेमी चिटोसन पॉलीप्लेक्स विकसित करने के लिए डीएनए ओरिगेमी के 15 माइक्रोलीटर को डीएनए ओरिगेमी के 15 माइक्रोलीटर में जोड़ें ।पांडुलिपि में वर्णित गणनाओं का उपयोग करके विभिन्न एन/पी अनुपात के पॉलीप्लेक्स तैयार करना जारी रखें। 2% एगर उठे जेल के लिए एक ट्यूब के 80 मिलीमीटर तैयार करें। 2.5 मोलर मैग्नीशियम क्लोराइड के 352 माइक्रोलीटर जोड़ें और फिर डीएनए जेल दाग के 10 माइक्रोलीटर के साथ इसे पूर्व दाग।जेल समाधान को सूखे जेल बॉक्स में डालें। एक जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस कंघी डालें और इसे 15 से 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर जमना दें। इस बीच 11 मिलीमोलर मैग्नीशियम क्लोराइड के साथ चल रहे बफर को पूरक करें।6X लोडिंग बफर के 20% के साथ प्रत्येक नमूने के 10 से 20 माइक्रोलीटर मिलाएं। नमूनों को एगर उठे जेल कुओं में लोड करें, जिसमें नियंत्रण के रूप में एक नग्न डीएनए ओरिगेमी शामिल है। ढाई से तीन घंटे तक कमरे के तापमान पर 70 वोल्ट पर जेल चलाएं।फिर जेल की कल्पना करने के लिए एक यूवी स्कैनर का उपयोग करें। एक DNase I सुरक्षा परख करने के लिए, विभिन्न एन/पी अनुपात की तुलना में प्रत्येक पॉलीप्लेक्स के चार माइक्रोलीटर, 10X DNase I बफर के १.५ माइक्रोलीटर, टीबी के 8 माइक्रोलीटर, और DNase I के १.५ माइक्रोलीटर को एक अलग 2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में जोड़ें । फिर 24 घंटे के लिए एक थर्मोसाइकिलर में 37 डिग्री सेल्सियस पर ही इनक्यूबेट।DNase I को पचाने के लिए, 20 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर प्रोटीन के दो माइक्रोलीटर जोड़ें और एक थर्मोसाइकिलर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, कोर डीएनए नैनोस्ट्रक्चर को जानने के लिए 50 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर 40 किलोडलटन डेक्सट्रान सल्फेट के 3.6 माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर इन नमूनों और ताजा डीएनए ओरिगामी का उपयोग नियंत्रण के रूप में करने के लिए एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का प्रदर्शन करने के लिए जैसा कि पहले वर्णित किया गया है।जेल से भरे नमूनों के अनुरूप बैंड को उत्पादित करें। डीएनए ओरिगामी निकालने के लिए, एक निचोड़ फ्रीज निष्कर्षण कॉलम का उपयोग करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें और पांडुलिपि में वर्णित नकारात्मक दाग संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के साथ जारी रखें। शुद्ध 36 नैनोमोलर एचआरपी-एनआर के 6.5 माइक्रोलीटर को अलग-अलग सांद्रता के पॉलीकेशन के 6.5 माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं।एक, दो, चार, 10 और 20 के एन/पी अनुपात में एक पॉलीप्लेक्स तैयार करने के लिए, एक, दो, चार, 10 और 20 के एन/पी अनुपात के अनुरूप विभिन्न सांद्रता के पॉलीकेशन के ६.५ माइक्रोलीटर के साथ आसुत जल के ६.५ माइक्रोलीटर मिलाकर एक खाली समूह तैयार करें । फिर 96 अच्छी प्लेट के एक अलग कुएं में इनमें से प्रत्येक तैयार समाधानों में से 12.5 माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर प्रत्येक अच्छी तरह से हेपेट्स बफर के 72.5 माइक्रोलीटर जोड़ें और मिलाएं।15 मिलीमोलर एबीटीएस के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें और फिर प्रत्येक कुएं में 12 मिलीमोलर हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 5 माइक्रोलीटर जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। अंत में, चार घंटे से अधिक 421 नैनोमीटर पर अवशोषण को मापने के लिए एक मल्टीमोड प्लेट रीडर का उपयोग करें। जेल मंदता परख का उपयोग करके पॉलीप्लेक्स का विश्लेषण करने के बाद, कैथोड की ओर नग्न नैनोस्ट्रक्चर में बदलाव हुआ, शायद पॉलीकेशन के लिए बाध्यकारी होने पर फॉस्फेट समूहों के नकारात्मक शुल्क के प्रतिसंतुलन के कारण, और परिसर का आकार बढ़ गया।जब डेक्सट्रान सल्फेट जैसे पॉलीएनियन की एक अतिरिक्त मात्रा जोड़ी गई, तो पॉलीप्लेक्स गठन को उलट दिया गया। उच्च आणविक वजन के डेक्सट्रान सल्फेट कम आणविक वजन की तुलना में अधिक कुशल होने के लिए दिखाया । नकारात्मक दाग संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर पॉलीप्लेक्स का विश्लेषण करने के बाद, माइक्रोग्राफ ने नग्न डीएनए ओरिगेमी नैनोस्ट्रक्चर, डेस्केप्सुलेशन के बाद रैखिक पॉलीथीनमाइन पॉलीप्लेक्स, चिटोसन पॉलीप्लेक्स, नग्न और संरक्षित डीएनए ओरिगेमी की छवियों को मैग्नीशियम की कमी, एंजाइमेटिक क्षरण और सीरम पाचन के अधीन दिखाया।DNase I की उपस्थिति में, दो घंटे के बाद, नग्न नैनोस्ट्रक्चर पूरी तरह से पचा गए थे, जबकि चिटोसन के रैखिक पॉलीथीनमाइन पॉलीप्लेक्स ने डीएनए ओरिगेमी को प्रति मिलीलीटर DNase I.रैखिक पॉलीथीनिन पॉलीप्लेक्स डीएनए नैनोस्ट्रक्चर की तुलना में अधिक कुशलता से रक्षा की। जब पॉलीप्लेक्स का एन/पी रेशियो बढ़ जाता है तो डीएनए पाचन कम होता था। एंजाइम कोटिंग के बाद, या अधिक कार्यात्मक डीएनए ओरिगामी के बाद, वैरिएंट एन/पी अनुपात में रैखिक पॉलीथीनमाइन पॉलीप्लेक्स और चिटोसन के साथ, एंजाइमेटिक गतिविधि के साथ कोई उल्लेखनीय हस्तक्षेप नहीं देखा गया ।दूसरी ओर, डीएनए ओरिगेमी के लिए बाध्यकारी होने के बाद एचआरपी एंजाइम की गतिज नाटकीय रूप से बदल गई। यह अच्छी तरह से शुद्ध, डीएनए ओरिगामी संरचनाओं के साथ शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है । एक स्थिर कतरा मौजूद है जो पॉलीकेशन से भी बांध सकता है।इनका डीएनए ओरिगामी पॉलीप्लेक्स से अलग होना मुश्किल होता है। जीन थेरेपी अनुप्रयोगों में हमारे कोटिंग अणुओं का भी उपयोग किया जाता है। इसका मतलब यह है कि डीएनए नैनोस्ट्रक्चर का उपयोग भविष्य में जीवित जीवों के जीनोम को बदलने के लिए किया जा सकता है ।एगर उठे जेल धुंधला के लिए, आमतौर पर अणुओं का उपयोग किया जाता है जो डीएनए को इंटरकैलेट करते हैं और संभावित रूप से म्यूटाजेनिक होते हैं। डीएनए धुंधला करते समय कृपया अपनी प्रयोगशाला के सुरक्षा निर्देशों का पालन करें।

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

Origami प्रेरणा नमूनों और Reconfigurable कण के स्व विधानसभा

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Gyroid Nickel Nanostructures from Diblock Copolymer Supramolecules

Diblock copolymer supramolecules से Gyroid निकल Nanostructures

Nanoporous metal foams possess a unique combination of properties - they are catalytically active, thermally and electrically conductive, and furthermore, ...

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

डीएनए origami से एक जैव संवेदनशील रोबोट की तह और विशेषता

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

एकल असहाय डीएनए टाइलें से जटिल दो आयामी आकार की आत्म विधानसभा

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

डीएनए origami विश्लेषण और प्रयोगों के लिए मीका और सिलिकॉन substrates की तैयारी

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Bio-inspired Polydopamine Surface Modification of Nanodiamonds and Its Reduction of Silver Nanoparticles

Nanodiamonds के जैव-प्रेरित Polydopamine सतह संशोधन और चांदी के नैनोकणों की कमी

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a ...

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

स्थिर डीएनए रूपांकनों, 1D और 2 डी Nanostructures छोटे परिपत्र डीएनए अणुओं से निर्माण

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Assembly of Gold Nanorods into Chiral Plasmonic Metamolecules Using DNA Origami Templates

डीएनए Origami टेम्पलेट्स का उपयोग कर चिरल plasmonic मेटामोलेक्सिक में सोने nanorods के विधानसभा

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic ...

DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

डीएनए Origami-मध्यस्थ Substrate नैनो पैटर्निंग के लिए संवेदन अनुप्रयोगों के लिए अकार्बनिक संरचनाओं

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA ...

Single-Molecule SERS Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas

Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas

Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas (Video) | JoVE 

प्लाज्मोनिक डीएनए ओरिगामी नैनोएंटेना द्वारा सक्षम एकल-अणु सतह-एन्हांस्ड रमन प्रकीर्णन माप

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) has the capability to detect single molecules for which high field enhancement is required. Single-molecule (SM) ...