Name: gene-therapy inspired polycation coating for protection of dna origami nanostructures
Uploaded: 2019-01-19T14:30:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures at JoVE.com

Dette prosjektet har mottatt støtte fra EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon program under grant avtalen nr. 686647. TEM bilder ble registrert på en Morgagni drives på 80 kV på EM anlegget i Wien Biocenter Core fasiliteter GmbH (VBCF). Vi vil gjerne takke Tadija Kekic for assistanse i grafisk design og Elisa De LIano for å utforme trådramme-nanostructure.

1. klargjør Polycation lager løsning
<ol><li>LPEI lager løsning<ol>
<li>Legge til 10 mg av LPEI i en glass kanne inneholder < 10 mL av H2O.</li>
		<li>For å løse LPEI, legge HCl (32%) til å nå pH 2.0.</li>
		<li>Justere pH 7.0 ved å legge NaOH (10 M).</li>
		<li>Juster volumet til det siste konsentrasjonen av 1 mg/mL.</li>
		<li>Filtrer LPEI lager løsningen gjennom en 0.22 µm membran.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chitosan lagerløsning<ol>
<li>Oppløse 16,6 mg av chitosan oligosaccharide laktat (Mw ~ 5 kDa, 60% oligosaccharide komposisjon, deacetylated fra chitin med 90%) i 1 mL av eddiksyre (10%) vandige media å forberede en lagerløsning med en konsentrasjon av 10 mg/mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. rensing av DNA Origami nanostrukturer
<ol><li>Mix 100 µL av DNA origami utvalget (5 mM Tris, 1 mM EDTA, 5 mM NaCl buffer (betegnet som TB) inkludert 18 mM MgCl2) med tilsvarende volumet av 22 mM MgCl supplert2 TB (100 µL) i en 1,5 mL tube.</li>
	<li>Legge til 200 µL av rensing buffer (15% (w/v) pinne 8000, 5 mM Tris, 1 mM EDTA og 505 mM NaCl). Bland forsiktig ved tube inversjon.</li>
	<li>Spinne prøven 16.000 × g ved romtemperatur (r.t.) for 25 min.</li>
	<li>Forkast nedbryting nøye og resuspend pellet 16 mM MgCl2 supplert TB buffer. Nedbryting og pellet inneholder overflødig stift tråder og utfelt DNA origami, henholdsvis.</li>
	<li>Inkuber prøven for en dag r.t. på 650 rpm i en thermomixer. Dette trinnet er for resuspendering av DNA origami.</li>
</ol>3. Agarose Gel geleelektroforese (alder)
<ol><li>Legge til 1.6 g av agarose og 80 mL 0,5 x TAE buffer (20 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 10 mM eddiksyre, pH 8) i et glass beaker å forberede en 2% agarose gel. Mikrobølgeovn for 5 min. Swirl innholdet begeret i 1 min i et vannbad. Legg 352 µL av MgCl2 (2,5 M) å forberede gel med 11 mM MgCl2. Før flekken gel med 10 µL av DNA gel flekken.</li>
	<li>Hell gel løsningen i en tørr gel boks og sette en gel geleelektroforese kam. La løsningen stivne på r.t. i 15-30 min.</li>
	<li>Supplere kjører buffer (0,5 x TAE buffer) med 11 mM MgCl2.</li>
	<li>Bland 10-20 µL av utvalget med 20% av 6 x lasting buffer (30% (v/v) glyserol, 0,25% (w/v) bromophenol blå, 0,25% (w/v) xylen cyanol FF) og laste den inn i agarose gel brønnene.</li>
	<li>Kjøre gel på 70 V på r.t. for 2,5 - 3 h.</li>
	<li>Visualisere gel med en UV-skanner.</li>
</ol>4. negative flekken overføring elektronmikroskop (nsTEM)
<ol><li>Bruk 5 µL av fortynnet nanostructure eller polyplex en glød-utladet karbon-belagt Cu400 TEM rutenett. La det adsorberes for ca. 1 min.</li>
	<li>Drain overflødig væske fra kanten av rutenettet av filter papir.</li>
	<li>Bruke 5 µL av en 2% uranyl acetate vandig løsning og vente 1 min.</li>
	<li>Bruk filter papir kanten for å tømme helt overflødig væske fra kanten av rutenettet.</li>
	<li>La rutenettet tørke før injisere det i TEM.</li>
</ol>5. Polyplex-formasjonen
Merk: Illustrerende eksempel for å forberede en polyplex bestående av DNA origami og chitosan på N/P 0,01-8 prosenter.
<ol><li>Beregne antall aminer per polycation ved hjelp av Formel-1 (tabell 1).</li>
	<li>Måle konsentrasjonen av renset DNA origami bruker en ultra violet spektrofotometer på 260 nm. Bruke 2 µL TB bufferen samt blank for å kalibrere maskinen. Beregne "nmol av fosfat" bruker formel-2.</li>
	<li>Forberede 15 µL av DNA origami inkludert 1 nmol av fosfat.</li>
	<li>Bruk formel-3 til å beregne volumet av chitosan, som kreves for å forberede polyplex på N/P 0,01-8. For eksempel for å forberede polyplex N/P 8, 1,8 µL av chitosan (0,8 mg/mL) er nødvendig (N/P er 8, nmol av fosfat er 1, molekylvekt av chitosan er 5000 g/mol, konsentrasjonen av chitosan lagerløsning er 0,8 mg/mL og aminer per chitosan er 28). Legge til 13,2 µL av TB 1,8 µL av chitosan (0,8 mg/mL). Legge til 15 µL av kitosan løsning (0,8 mg/mL) 15 µL av DNA origami fra trinn 5.3 å få en DNA origami-chitosan polyplex med NP 8. Polyplex er dannet spontant.</li>
	<li>Gjenta trinn 5.4 å forberede polyplexes på forskjellige N/P forhold.</li>
	<li>Utfør en alder som beskrevet i trinn 3 (figur 1A). Inkluder den nakne DNA origami kontroll.</li>
	<li>Bilde av polyplex som beskrevet i trinn 4 (figur 2). Formel 1) antall Amin grupper pr. polycation <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq1.jpg"> Formel-2) Molo med fosfat =<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq2.jpg"> Formel-3) Volum (µL) av polycations =<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq3.jpg">
</li>
</ol>6. utpakking med dekstran sulfat
<ol><li>Beregne antall sulfat grupper pr. dekstran sulfat bruker formel-4 (tabell 2).</li>
	<li>Beregne volumet av dekstran sulfat trengs for decomplexation av polyplex på en A / P forholdet ved hjelp av formel-5. A / P lade forholdet er forholdet mellom sulfat gruppene med polyanion (A) til fosfat grupper (P) av DNA origami. Mye dekstran sulfat er nødvendig for en effektiv decomplexation for polyplexes (f.eks 500-1000). For eksempel å decomplex polyplex forberedt i del 5 (polyplex inneholder 1 nmol av fosfat) på A / P 1000, 3,6 µL av dekstran sulfat 40 kDa (50 mg/mL) er nødvendig (A / P er 1000, nmol av fosfat 1, molekylvekt av dekstran sulfat 40.000 g/mol konsentrasjonen av dekstran sulfat lagerløsning er 50 mg/mL og sulfat er 220). Legge til 3,6 µL av dekstran sulfat (50 mg/mL) av polyplex fra trinn 5.4 og bland godt.</li>
	<li>Hvis arbeider med en chitosan polyplex, legge NaOH for å forenkle decomplexation prosessen. Legge NaOH for en siste konsentrasjon av 10 mM. Hoppe denne steg for LPEI polyplexes.</li>
	<li>Utfør en alder som beskrevet i trinn 3 (figur 1B). Inkluder naken DNA origami og polyplex som kontroll. Formel-4) antall sulfat grupper pr. polyanion = <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq4.jpg"> Formel-5) Volum (µL) på dekstran sulfat =<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq5.jpg">
</li>
</ol>7. stabilitet mot Mg uttømming
<ol><li>Vask 20 µL av en DNA origami eller den tilsvarende polyplex (inkludert 2 nmol fosfat) med 4 x 600 µL Mg null bufferen (5 mM Tris, 1 mM EDTA og 30 mM NaCl) bruke kolonnen ultrafiltrasjon (MWCO ~ 3 kDa). Spinn hver vask 14.000 × g på r.t. for 3-5 minutter.</li>
	<li>Samle de gjenværende løsningen (80 µL) og ruge på 37 ° C for en dag på 650 rpm i en thermomixer.</li>
	<li>Hvis du tester LPEI polyplex, kan du legge til 2,5 µL av MgCl2 (500 mM) for en siste konsentrasjon av 16 mM MgCl2. Legg deretter til 7 µL av dekstran sulfat-40 kDa (50 mg/mL) (tilsvarende a / P 1000) å rakne kjernen DNA nanostrukturer (utpakking, se trinn 6). Merk: Hoppe over dette trinnet hvis arbeider med chitosan polyplex eller naken DNA origami.</li>
	<li>Følg nsTEM avbildning som beskrevet i trinn 3 (figur 2).</li>
</ol>8. DNase jeg titrering analysen av nakne DNA Origami nanostrukturer
<ol><li>Mix 3 µL av nakne DNA origami inkludert 1 nmol fosfat med 2 µL av 10 x DNase jeg buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, pH 7.6) 1 µL av MgCl2 (250 mM), 12 µL av vann i 0,2 mL PCR rør. Legge til 2 µL av DNase jeg (10 x). Justere lager konsentrasjonen av DNase jeg (10 x) å få siste DNase jeg konsentrasjoner av 0.25-2 U/mL.</li>
	<li>Inkuber prøvene ved 37 ° C i 1-2 h i en thermocycler.</li>
	<li>Fordype prøvene i isen og deaktivere nucleolytic aktiviteten ved å legge til 2 µL av 500 mM dithiothreitol (DTT) og 2,5 µL av EGTA (33 mM).</li>
	<li>Analysere eksemplene bruker en alder som beskrevet i trinn 3.</li>
</ol>9. stabiliteten i Polyplexes mot DNase jeg
<ol><li>Blanding 4 µL av en polyplex (inkludert 1 nmol av fosfat, forberedt på forskjellige N/P forhold) med 1,5 µL av en DNase jeg buffer (10 x), 8 µL av TB og 1,5 µL av DNase I (100 U/mL) i en 0,2 mL PCR rør.</li>
	<li>Inkuber utvalget for 24 h på 37 ° C i en thermocycler.</li>
	<li>Legg 2 µL av proteinasen K (20 mg/mL) å fordøye DNase I. ruge i 30 min på 37 ° C i en thermocycler. Merk: i stedet for enzymatisk fordøyelsen, kjemiske deaktivering av DNase jeg legge 1,5 µL av DTT (500 mM) og 2 µL av EGTA (33 mM) kan utføres.</li>
	<li>Legge til 3,6 µL av dekstran sulfat-40 kDa (50 mg/mL) (tilsvarende a / P 1000) å rakne kjernen DNA nanostrukturer.</li>
	<li>Utfør alder som beskrevet i trinn 3 (figur 3A, Figur 3 c). Inkluder ny DNA origami kontroll for å måle og sammenligne bandet intensiteten på gel.</li>
	<li>Avgiftsdirektoratet bandet på alder og ekstrakt DNA origami av skvis fryse utvinning kolonne basert på protokollen leveres av leverandøren.</li>
	<li>Følg nsTEM avbildning som beskrevet i trinn 4 (figur 2).</li>
</ol>10. stabilitet mot fosterets bovin Serum (FBS)
<ol><li>Blanding 4 µL av nakne DNA origami eller den tilsvarende polyplex (inkludert 1 nmol av fosfat) med 17 µL av TB + 10% FBS i 0,2 mL PCR rør. Bruk ferske tinte FBS.</li>
	<li>Inkuber prøven på 37 grader i en termisk cycler 24 h.</li>
	<li>Fordype eksemplet i en isbadet.</li>
	<li>Hvis du tester polyplex, utføre utpakking prosessen ved å legge til 3,6 µL av dekstran sulfat-40 kDa (50 mg/mL). I tillegg legge NaOH hvis arbeider med chitosan polyplexes (se trinn 6.3)</li>
	<li>Utfør en alder som beskrevet i trinn 3. Inkluder den nye DNA origami kontroll for å måle og sammenligne bandet intensiteten på gel.</li>
	<li>Avgiftsdirektoratet bandet på alder og ekstra DNA origami av en klem fryse utvinning kolonne.</li>
	<li>Legge 2 µL av proteinasen K (20 mg/mL) til utdraget DNA origami løsningen (20 µL) i et 0,2 mL PCR rør. Inkuber i 30 min på 37 ° C i en thermocycler å fordøye serumproteiner som er bundet til nanostrukturer.</li>
	<li>Vask prøven med 5 x 500 µL av TB inkludert 16 mM MgCl2 bruke kolonnen ultracentrifugation (MWCO ~ 100 kDa) å vaske proteinasen K (MW ~ 28,9 kDa) unna. Spinn hver vask 14.000 × g på r.t. for 3-5 minutter.</li>
	<li>Utføre nsTEM avbildning som beskrevet i trinn 4 (Figur 3). Merk: Gel utdraget prøven fra trinn 10.6 kan direkte brukes for nsTEM bildebehandling. Imidlertid kan avbilding være svært utfordrende på grunn av feste serumproteiner til DNA origami nanostrukturer. Proteinasen K behandling (trinn 10,7-10.9) anbefales derfor å lette avbildingsprosessen.</li>
</ol>11. testing adresserbarhet av pepperrot Peroxidase enzym (HRP)-functionalized DNA Origami på belegg med Polycations
<ol><li>Rense selv montert biotinylated-NR (Biotin-NR) som beskrevet i trinn 2.</li>
	<li>Inkuber 200 µL av renset Biotin-NR (36 nM, i 16 mM supplert TB buffer) med 200 µL av HRP-konjugerte streptavidin (540 nM, TB buffer). Legge til 4,8 µL MgCl2 (500 mM) en siste konsentrasjon av 14 mM. Ruge på r.t. 12 h på 650 rpm i en thermomixer</li>
	<li>Rense HRP-functionalized NR (HRP-NR) av en PEG rensing metoden (som beskrevet i trinn 2) for å fjerne ubundet HRP enzymer. Resuspend utfelt HRP-NR i TB inkludert 16 mM MgCl2.</li>
	<li>Mix 6.5 µL av renset HRP-NR (36 nM) med 6,5 µL av polycations for variant å forberede polyplex på N/P prosenter av 1, 2, 4, 10 og 20 (med formel 3).</li>
	<li>Gjenta trinn 11.2-11.4 for ikke-biotinylated NR. Som HRP enzymet kan binde nonspecifically til DNA origami, ikke-biotinylated DNA origami, som er behandlet med HRP enzymer og PEG renset (lik Biotin-NR), vil tjene som kontrollen i analysen.</li>
	<li>Mix 6.5 µL av destillert vann med 6,5 µL av polycations for variant tilsvarer definerte N/P prosenter av 1, 2, 4, 10 og 20. Avhandlinger prøver tjene som gruppen tomt.</li>
	<li>Legge til løsningen i trinn 11.4-11,6 (12.5 µL) til en 96-brønns plate inkludert sine 72.5 µL HEPES bufferen (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, 0,05% Triton X-100, 1% DMSO pH 7.4) og bland godt.</li>
	<li>Legge til 10 µL av 2, 2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 mM).</li>
	<li>Legg til 5 µL av H2O2 (12 mM) og bland godt pipettering opp og ned. H2O2 starter reaksjonen.</li>
	<li>Måle absorbans ved 421 nm over 4 h med en multimode plate leseren (figur 4A).</li>
</ol>12. testing adresserbarhet av Hemin-bindende Aptamers (HBA)-functionalized DNA Origami på belegg med Polycations
<ol><li>Rense den HBA functionalized-NR (HBA-NR) som beskrevet i trinn 2. Resuspend utfelt HBA-NR i TB med 6 mM MgCl2 (høyere saltkonsentrasjon fører til aggregering av HBA-NR).</li>
	<li>Bland 10 µL av HBA-NR (40 nM) med 10 µL av polycations på varierende konsentrasjon å forberede polyplex av definerte N/P prosenter av 1, 2, 10 og 20.</li>
	<li>Bland 10 µL av nakne-NR (40 nM) eller destillert vann med 10 µL av polycations i ulike konsentrasjoner tilsvarer N/P prosenter av 1, 2, 10 og 20.</li>
	<li>Legge til 20 µL forberedt løsningen fra trinn 12.2 og 12.3 i 96-brønnen platen inkludert 60 µL HEPES bufferen (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, 0,05% Triton X-100, 1% DMSO pH 7.4) og bland godt. Inneholde minst én tom eksempel erstatte 20 µL polyplex eller polycation løsningen (fra trinn 12.2 og 12.3) med vann.</li>
	<li>Legge til 5 µL av hemin (0.04 mM) etterfulgt av 10 µL av ATBS (15 mM). Plass platen på en orbital shaker i 5 min.</li>
	<li>Legg til 5 µL av H2O2 (12 mM) og bland godt pipettering opp og ned.</li>
	<li>Måle absorbans ved 421 nmover 30 min med multimode plate leseren (figur 4B).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jones, M. R., Seeman, N. C., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials.+Programmable+materials+and+the+nature+of+the+DNA+bond.">Nanomaterials. Programmable materials and the nature of the DNA bond.</a> Science. 347 (6224), 1260901 (2015).</li><li>Rothemund, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li><li>Takabayashi, S., Klein, W. P., Onodera, C., Rapp, B., Flores-Estrada, J., Lindau, E., Snowball, L., Sam, J. T., Padilla, J. E., Lee, J., Knowlton, W. B., Graugnard, E., Yurke, B., Kuang, W., Hughes, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+and+high+yield+fabrication+of+dense+nanoparticle+arrays+onto+DNA+origami+at+statistically+independent+binding+sites.">High precision and high yield fabrication of dense nanoparticle arrays onto DNA origami at statistically independent binding sites.</a> Nanoscale. 6 (22), 13928-13938 (2014).</li><li>Kuzyk, A., Schreiber, R., Zhang, H., Govorov, A. O., Liedl, T., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconfigurable+3D+plasmonic+metamolecules.">Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules.</a> Nature Material. 13 (9), 862-866 (2014).</li><li>Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+logic-gated+nanorobot+for+targeted+transport+of+molecular+payloads.">A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads.</a> Science. 335 (6070), 831-834 (2012).</li><li>Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reconfigurable+DNA+Accordion+Rack.">A Reconfigurable DNA Accordion Rack.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).</li><li>Kielar, C., Xin, Y., Shen, B., Kostiainen, M. A., Grundmeier, G., Linko, V., Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+stability+of+DNA+origami+nanostructures+in+low-magnesium+buffers.">On the stability of DNA origami nanostructures in low-magnesium buffers.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (30), 9470-9474 (2018).</li><li>Hahn, J., Wickham, S. F. J., Shih, W. M., Perrault, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+the+instability+of+DNA+nanostructures+in+tissue+culture.">Addressing the instability of DNA nanostructures in tissue culture.</a> ACS Nano. 8 (9), 8765-8775 (2014).</li><li>Al-Dosari, M. S., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+Gene+Delivery:+Principle,+limitations,+and+recent+progress.">Nonviral Gene Delivery: Principle, limitations, and recent progress.</a> The AAPS Journal. 11 (4), 671 (2009).</li><li>Ibraheem, D., Elaissari, A., Fessi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+and+DNA+delivery+systems.">Gene therapy and DNA delivery systems.</a> International Journal of Pharmaceutics. 459 (1-2), 70-83 (2014).</li><li>Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+development+of+polymers+for+gene+delivery.">Design and development of polymers for gene delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).</li><li>Ponnuswamy, N., Bastings, M. M. C., Nathwani, B., Ryu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligolysine-based+coating+protects+DNA+nanostructures+from+low-salt+denaturation+and+nuclease+degradation.">Oligolysine-based coating protects DNA nanostructures from low-salt denaturation and nuclease degradation.</a> Nature Communication. 8, 15654 (2017).</li><li>Agarwal, N. P., Matthies, M., G&#252;r, F. N., Osada, K., Schmidt, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Block+copolymer+micellization+as+a+protection+strategy+for+DNA+origami.">Block copolymer micellization as a protection strategy for DNA origami.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (20), 5460-5464 (2017).</li><li>Kiviaho, J. K., Linko, V., Ora, A., Tiainen, T., J&#228;rvihaavisto, E., Mikkil&#228;, J., Tenhu, H., Nonappac, M. A., Kostiainen, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+polymers+for+DNA+origami+coating+-+examining+their+binding+efficiency+and+tuning+the+enzymatic+reaction+rates.">Cationic polymers for DNA origami coating - examining their binding efficiency and tuning the enzymatic reaction rates.</a> Nanoscale. 8 (22), 11674-11680 (2016).</li><li>Perrault, S. D., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-inspired+membrane+encapsulation+of+DNA+nanostructures+to+achieve+in+vivo+stability.">Virus-inspired membrane encapsulation of DNA nanostructures to achieve in vivo stability.</a> ACS Nano. 8 (5), 5132-5140 (2014).</li><li>Ahmadi, Y., De Llano, E., Bari&#353;i&#263;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Poly)cation-induced+protection+of+conventional+and+wireframe+DNA+origami+nanostructures.">(Poly)cation-induced protection of conventional and wireframe DNA origami nanostructures.</a> Nanoscale. 10 (16), 7494-7504 (2018).</li><li>Douglas, S. M., Marblestone, A. H., Teerapittayanon, S., Vazquez, A., Church, G. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+of+3D+DNA-origami+shapes+with+caDNAno.">Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).</li><li>Veneziano, R., Ratanalert, S., Zhang, K., Zhang, F., Yan, H., Chiu, W., Bathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+nanoscale+DNA+assemblies+programmed+from+the+top+down.">Designer nanoscale DNA assemblies programmed from the top down.</a> Science. 352 (6293), 1534 (2016).</li><li>Castro, C. E., Kilchherr, F., Kim, D. N., Shiao, E. L., Wauer, T., Wortmann, P., Bathe, M., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+to+scaffolded+DNA+origami.">A primer to scaffolded DNA origami.</a> Nature Methods. 8 (3), 221-229 (2011).</li><li>Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+and+Characterization+of+a+Bio-responsive+Robot+from+DNA+Origami.">Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami.</a> Journal of Visualized Experiment. (106), 51272 (2015).</li><li>Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+bio-responsive+robot+from+DNA+origami.">Designing a bio-responsive robot from DNA origami.</a> Journal of Visualized Experiment. (77), 50268 (2013).</li><li>Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+complex+two-dimensional+shapes+from+single-stranded+DNA+tiles.">Self-assembly of complex two-dimensional shapes from single-stranded DNA tiles.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), 52486 (2015).</li><li>Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+scalable+preparation+of+pure+and+dense+DNA+origami+solutions.">Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).</li><li>Grigsby, C. L., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+protection+and+release+of+DNA:+tools+to+address+a+bottleneck+of+non-viral+gene+delivery.">Balancing protection and release of DNA: tools to address a bottleneck of non-viral gene delivery.</a> Journal of the Royal Society Interface. 7 (1), 67-82 (2010).</li><li>Li, T., Dong, S., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplex+aptamers+with+peroxidase-like+DNAzyme+functions:+which+is+the+best+and+how+does+it+work.">G-quadruplex aptamers with peroxidase-like DNAzyme functions: which is the best and how does it work.</a> Chemistry - An Asian Journal. 4 (6), 918-922 (2009).</li><li>Cassinelli, V. 1., Oberleitner, B., Sobotta, J., Nickels, P., Grossi, G., Kempter, S., Frischmuth, T., Liedl, T., Manetto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Step+Formation+of+"Chain-Armor"-Stabilized+DNA+Nanostructures.">One-Step Formation of "Chain-Armor"-Stabilized DNA Nanostructures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (27), 7795-7798 (2015).</li><li>Gerling, T., Kube, M., Kick, B., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-programmable+covalent+bonding+of+designed+DNA+assemblies.">Sequence-programmable covalent bonding of designed DNA assemblies.</a> Science Advances. , 1157 (2018).</li><li>Xia, T., Kovochich, M., Liong, M., Meng, H., Kabehie, S., George, S., Zink, J. I., Nel, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+Coating+Enhances+the+Cellular+Uptake+of+Mesoporous+Silica+Nanoparticles+and+Allows+Safe+Delivery+of+siRNA+and+DNA+Constructs.">Polyethyleneimine Coating Enhances the Cellular Uptake of Mesoporous Silica Nanoparticles and Allows Safe Delivery of siRNA and DNA Constructs.</a> ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konflikter av interesse knyttet til denne rapporten.

I den selv-montering av DNA origami, stifte tråder vanligvis legges i 5-10 overflødig forhold til stillaset. Disse overflødig stift tråder også binder seg til den polycation og form polyplexes i området monometer som er mer vanskelig å skilles fra DNA origami polyplexes. Derfor er en avgjørende skritt i polyplex-formasjonen fjerne overflødig stift tråder og bruke godt renset DNA origami nanostrukturer.
Andre metoder har blitt utviklet for stabilisere DNA nanostrukturer som cyclization av DNA tilnærmingene via en klikk reaksjon26. Som alkyne - og azide-endret stift tråder er nødvendig for dannelsen av sammenstøt single-strandet ringer, denne teknikken er begrenset for stabilisering av små nanostrukturer slik en DNA-catenane, og det er ikke lett skaleres for større DNA origami strukturen som brukes i denne protokollen. Nylig Gerling et enl.27 rapportert en metode for å lage kovalente cyclobutene pyrimidine dimer (CPD) bånd mellom nærliggende thymidines i DNA nanostrukturer med ultrafiolett bestråling. Selv om denne metoden er område-selektiv og skalerbar, er dens effektivitet i å beskytte DNA origami mye lavere enn polycation belegg. For eksempel CPD-stabilisert DNA origami objekter holde ut bare 0,4 U/mL DNase jeg 1t, mens polyplexes var stabil i nærvær av 10 U/mL DNase jeg for minst en dag.
I korte trekk genterapi inspirert chitosan og LPEI belegg er en rimelig, ettrinns og effektiv metode å løse langsiktig stabilitet i DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmet og nuclease-rik media. Reversibilitet av polyplex formasjonen forenkler anvendelsen i flere trinn diagnostiske tester hvor beskyttelse av DNA origami mot nucleolytic fornedrelse eller salt-uttømming er avgjørende i ett trinn, men kan forårsake problemer i andre trinn som DNA forsterkning. I tillegg er polycation belegg en potensiell tilnærming for å øke cellulære opptaket av DNA origami nanostrukturer for narkotikarelaterte levering programmer28.

DNA er en allsidig byggekloss for programmerbare selvstendig montering av nanoskala strukturer1. Den mest populære metoden for å lage DNA nanostrukturer er DNA origami teknikken, som er basert på det selv-montering av en lang runde, enkelt strandet DNA stillaset ved hjelp av hundrevis av kortere figur-bestemme syntetiske stift tråder2. I dag, er etableringen av DNA nanostrukturer nesten alle geometri og morfologi lett mulig. DNA nanostrukturer kan være site-specifically functionalized med høy presisjon3,4 og kan programmeres til å gjennomgå allosteric conformational endringer5,6. Derfor bruker DNA som byggemateriale, har en unik mulighet til å opprette programmerbare og responsive spesialdesignede nanostrukturer for programmer i biosensing, diagnostikk og narkotika-leveranser. DNA nanostrukturer er imidlertid utsatt for fordøyelsen av exo- og endo-nucleases og gitter-basert 3D DNA origami nanostrukturer krever vanligvis hřy salinitet buffere (f.eks., 5-20 mM Mg2) å opprettholde deres integritet7,8.
Rask nedbrytning av DNA ved nucleases finnes i blod og ekstracellulær matrix er en stor utfordring for effektiv i vivo levering av genetisk produkter i celler9. For å overkomme denne begrensningen i ikke-viral gen levering, er DNA blandet med en kationisk polymer på en definert N/P kostnad forholdet (forholdet mellom aminer i polycation til fosfater i DNA)10. Komplekset av DNA med en kationisk polymer, kjent som polyplex, beskytter DNA fra nuclease-mediert fornedrelse og forbedrer sin mobilnettet opptak11. Inspirert av genet levering fremskritt, oligolysine12, oligolysine-polyethylene glycol (PEG) copolymers13, poly (2-dimethylamino-ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-baserte polymerer14og virus kapsid proteiner15 har blitt brukt for stabilisere DNA origami nanostrukturer.
Nylig vi rapportert en metode for beskyttelse av DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmet og nuclease-rike medier ved hjelp av naturlige kationisk polysakkarid chitosan og syntetisk lineær polyethyleneimine (LPEI) ble rapportert16. Denne artikkelen er en tilpasning av våre tidligere arbeid og beskriver detaljert protokollen for utarbeidelsen av polyplexes, deres karakterisering, teste stabiliteten i naken og beskyttet nanostrukturer i lav-salt og nuclease-rik media og undersøker den adresserbarhet av enzym - og aptamer-functionalized DNA origami nanostrukturer på polycation belegg.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1135px;" width="1136">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">10&#215; DNase I reaction buffer</td>
			<td style="width:239px;">New England Biolab (NEB)</td>
			<td style="width:183px;">B0303</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">ABTS (2&#8242;-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt)</td>
			<td style="width:239px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:183px;">J65535</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Amicon ultracentrifugation columns</td>
			<td style="width:239px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:183px;">UCF500308, UCF510024</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:547px;">Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, &#62; 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">523682</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Design-specific staple strands</td>
			<td style="width:239px;">Integrate DNA Technologies (IDT)</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">75027</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">42867</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">DNA gel loading dye (6&#215;)</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">R0611</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">DNase I (RNase free)</td>
			<td style="width:239px;">New England Biolab (NEB)</td>
			<td style="width:183px;">M0303</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">E3889</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, &#8805;99% (titration)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">EDS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Freeze&#39;N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns</td>
			<td style="width:239px;">Biorad</td>
			<td style="width:183px;">7326165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Hemin</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">H9039</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">HEPES</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">H3375</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Hydrogen peroixde slution (32 wt%)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">216763</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">LPEI-25 kDa</td>
			<td style="width:239px;">Polysciences, Inc</td>
			<td style="width:183px;">23966-1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT))</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">NP0004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:547px;">Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da)</td>
			<td style="width:239px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:183px;">O263.1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI &#8804;1.2</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">765090</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI &#8804;1.3</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">764582</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Proteinase K solution (20 mg/ml)</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">AM2548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Streptavidin-conjugated HRP</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">N100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">SYBER safe DNA gel stain</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">S33102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene-therapy inspired polycation coating for protection of dna origami nanostructures

DNA origami nanostrukturer holder en enorme potensial som skal brukes for biologisk og medisinsk bruk. Men indusere lav-salt forhold og nucleases i fysiologiske væsker rødsprit og nedbrytning av selv montert DNA nanostrukturer. I ikke-viral gen levering overvinnes enzymatisk degradering av DNA ved innkapsling av negativt ladde DNA i et kationisk skall. Her, inspirert av genet levering fremskritt, en enkel, ettrinns og robust metode presenteres for stabilisering av DNA origami nanostrukturer av belegg dem med chitosan og lineær polyethyleneimine. Det polycation belegget beskytter effektivt DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmet og nuclease-rik media. Denne metoden bevarer også full adresserbarhet av enzym - og aptamer-baserte functionalization av DNA nanostrukturer.

Tre DNA origami nanostrukturer av ulike konfigurasjoner ble utformet, inkludert en nanorod (NR), en nanobottle (NB) og en trådramme nanostructure (WN) (3D-modeller av nanostrukturer er illustrert i figur 2). Feltet NR og NB ble designet basert på en square og honeycomb gitter, henholdsvis, caDNAno17 og WN ble opprettet med Daedalus programvare18. En omfattende protokoll for design og selvstendig montering av DNA nanostrukturer har vært publisert19,20,21,22. Figurer stiften tråder var bestilt, selv montert og ytterligere renset basert på en protokoll beskrevet av Stahl et al. 23 (trinn 2).
Polyplexes var preget av gel retardasjon analysen og nsTEM bildebehandling. På blande DNA origami med polycations, ble et skifte i naken nanostructure bandet mot katoden observert (figur 1A). Dette kan tilskrives counterbalancing av negativ ladning av fosfat grupper ved binding til polycations og den totale størrelsen øke av komplekset. Legge til ekstra mye av polyanions som dekstran sulfat kan reversere polyplex dannelsen. I denne forbindelse, dekstran sulfat av høyere molekylvekt (MW ~ 40 kDa) viste seg å være mer effektiv for decomplexation forhold til lavere molekylvekt dekstran sulfat (MW ~ 4 kDa) (figur 1B).
Mens imaging LPEI polyplexes av uranyl acetate negative flekken TEM, var det vanskelig å avbilde partikler. Var hypotesen at LPEI kan hindre uranyl acetate fra binding til fosfat ryggraden på grunn av stramme skjerming av DNA origami. Derfor før nsTEM bildebehandling, ble mye dekstran sulfat lagt til LEPI polyplexes. Den avslørt DNA origami nanostrukturer viste ingen tegn til defekt eller nedbryting. I motsetning, var chitosan polyplexes vellykket fotografert uten behov for polyanion behandling (figur 2).
Alle naken DNA nanostrukturer (uavhengig av deres forskjellige konfigurasjoner) var denaturert helt etter en dag med inkubering på 37 ° C i Mg null buffer, som bekreftes av nsTEM bildebehandling. Derimot nanostrukturer belagt med LPEI eller chitosan på N/P≥1 holdt seg intakt. Tilsvarende DNase jeg titrering analyser viste mottakelighet av ubeskyttet nanostrukturer mot enzymatisk fordøyelsen. Mens nakne nanostrukturer var helt fordøyd i nærvær av 1 U/mL DNase jeg etter 2 h, LEPI eller chitosan innkapslet DNA origami holdt intakt i supplert Mg null buffer med 10 U/mL DNase jeg i minst en dag (figur 2). Høyere stabilitet mot nucleolytic fordøyelsen ble oppnådd ved å øke N/P forholdet mellom polyplexes. I tillegg beskytter LPEI DNA nanostrukturer mer effektivt i forhold til chitosan (Figur 3A, Figur 3C), sannsynligvis på grunn av høyere kostnader tetthet av LEPI, og dermed høyere forpliktende tilhørighet mot DNA24 . Ingen forskjell ble observert mens du bruker LPEI av ulike molekylvekt (figur3B).
Adresserbarhet av funksjonelle grupper i DNA nanostrukturer etter innkapsling i en polymer shell er en viktig funksjon. Videre ble polycation belegg kompatibiliteten med pepperrot peroxidase enzym (HRP) og hemin-bindende aptamers (HBA) functionalized DNA origami undersøkt. Tre biotinylated stift tråder utsparinger stakk fra overflaten av NR og deretter functionalized med HRP-konjugert streptavidin (tre enzymer per DNA origami). Den katalytisk svært aktive (Kd: 439 nM) HBA aptamer PS2. M (5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3 ") ble valgt for disse eksperimentene25. Opptil 24 stift tråder var utsparinger stakk fra NR overflaten med et 5-nm lengde linker (5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3 ") etterfulgt av PS2. M sekvens (24 aptamers per DNA origami). Ingen bemerkelsesverdig hindring av enzymatisk eller aptamer aktivitet ble observert på belegg HRP - eller HBA-functionalized DNA origami med LPEI og chitosan variant N/P prosenter (Figur 4A-B)16. Men har den kinetiske av HRP enzym blitt dramatisk endret etter binding til DNA origami (Figur 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig1.jpg"> Figur 1 : Representant alder bilder av polyplex formasjon og utpakking. (A) electrophoretic mobilitet Skift analysen for NB blandet med chitosan på N/P prosenter 0,01-8. Hver fil inneholder 1 nmol NB. Første lane er referansen NB. (B) utpakking av polyplexes av polyanionic dekstran sulfat (DS). Dette tallet er endret fra en tidligere publiserte figur16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig2.jpg"> Figur 2 : Negative flekken TEM micrographs DNA origami og polyplexes. 3D modell og nsTEM micrographs av nakne DNA origami nanostrukturer (kolonne 1 og 2). nsTEM micrographs LPEI polyplexes (etter utpakking) og chitosan polyplexes (kolonner 3 og 4). nsTEM bilder av nakne og beskyttet DNA origami (polyplex) utsatt for Mg nedbryting (kolonner 5, 6 og 7), enzymatisk degradering (kolonner 8 og 9), serum fordøyelse (kolonner 10 og 11) for en dag på 37 ° C. LPEI-5 kDa ble brukt i denne analysen. Naken DNA nanostrukturer var dårligere utover deteksjon på en alder i nærvær av 1 U/mL DNase jeg eller TB + 10% FBS etter 2 timer med inkubering på 37 ° C. Skalere barer: 100 nm. Dette tallet er endret fra en tidligere publiserte figur16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig3.jpg"> Figur 3 : Representant resultatene av DNase jeg beskyttelse analyser. (A) DNase jeg beskyttelse analysen for polyplexes av WN med LPEI-5 kDa, LPEI-10 kDa og LPEI-25 kDa forberedt på N/P forholdet mellom 2, 4, 8 og 10. Prøvene ble utsatt for 10 U/mL DNase jeg for 24 h på 37 ° C. Siste lane er kontrollen WN. Polyplexes var decapsulated før lasting i gel. (B) normalisert mener bandet intensiteten for polyplexes av DNA origamis med forskjellige LPEI utdraget fra alder bilde-A. Y-aksen representerer normalisert mener bandet intensitet. (C) The DNase jeg beskyttelse analysen av chitosan-WN polyplexes forberedt på N/P prosenter av 1, 2, 4, 10 og 20. Prøvene ble utsatt for 10 U/mL DNase jeg for 24 h på 37 ° C. Lane 6 er kontroll polyplex (N/P 20). Siste lane er kontrollen WN. Alle chitosan polyplexes var decapsulated før lasting i gel. Dette tallet er endret fra en tidligere publiserte figur16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig4.jpg"> Figur 4: representant resultatene av kolorimetrisk enzym - og aptamer-functionalized DNA origami analyser. (A) kolorimetrisk analysen av enzym-functionalized nanostrukturer (HRP-NR) belagt med chitosan 3.7 h etter reaksjon starten. (B) kolorimetrisk analysen av aptamer-functionalized nanostrukturer (HBA-NR) belagt med chitosan, 6 min etter reaksjon oppstart. Y-aksen representerer normalisert absorbansen. (C) overvåking kolorimetrisk analysen HRP og HRP-NR over tid. Dette tallet er endret fra en tidligere publiserte figur16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Kationisk polymerer</td>
			<td>Chitosan</td>
			<td>LPEI-5 kDa</td>
			<td>LPEI-10 kDa</td>
			<td>LPEI-25 kDa</td>
		</tr>
<tr>
<td>Molekylvekt av polymer (kDa)</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Molecualr vekten av monomer (g/mol)</td>
			<td>161</td>
			<td>43</td>
			<td>43</td>
			<td>43</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antall Amin per monomer</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antall Amin per polymer</td>
			<td>28</td>
			<td>116</td>
			<td>232</td>
			<td>581</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. Beregne antall Amin grupper pr. polycation.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Molekylvekt av dekstran sulfat (kDa)</td>
			<td>4</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>Molekylvekt av monomer (g/mol)</td>
			<td>366</td>
			<td>366</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antall sulfat per monomer</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antall sulfat per polymer</td>
			<td>22</td>
			<td>220</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2. Beregne antall sulfat grupper pr. polyanion.

Watch this Scientific Journal Video about Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures at JoVE.com

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

Genterapi inspirert Polycation belegg for beskyttelse av DNA Origami nanostrukturer

Her vises en protokoll for beskyttelse av DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmet og nuclease-rik media med naturlig kationisk polysakkarid chitosan og syntetisk lineær polyethyleneimine (LPEI) belegg.

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...

Den biologiske stabiliseringen av DNA nanostrukturer er avgjørende for fremtidige in-vivo applikasjoner, for eksempel målrettet narkotikalevering. DNA blir imidlertid degradert i kroppen av ulike enzymer. Her presenterer vi en beleggteknikk som beskytter DNA nanostrukturer mot enzymatisk nedbrytning.De viktigste fordelene er at vårt belegg består av giftfrie forbindelser som allerede brukes i levende organismer, og at funksjonaliseringen av overflaten forblir mulig. Denne funksjonaliseringen er viktig for å innlemme molekylære sensorer for målgjenkjenning og brytere for utslipp av legemiddellast. Polycation belegg øker betydelig cellulæropptak av innkapslede DNA origami strukturer, slik at denne metoden kan åpne døren for anvendelser av DNA origamis i diagnostikk og terapeutiske midler.Det cellulære opptaket er også nødvendig for potensielle genleveringsapplikasjoner av DNA nanoteknologi. Jeg anser at metoden er ganske grei og kan lett mestres. For å begynne, måle konsentrasjonen av renset DNA origami.Bruk to mikroliter tb buffer som blank for å kalibrere ultrafiolett spektrofotometer. Og deretter måle DNA origami konsentrasjon på 260 nanometer. Beregn deretter mengden fosfater i den rensede DNA-origamiløsningen, ved hjelp av formel to, som beskrevet i manuskriptet.Forbered 15 mikroliter av DNA-origamistrukturen ved å inkludere en nanomol fosfat, ved hjelp av TB-buffer for fortynning. Tilsett 13,2 mikroliter til TB til 1,8 mikroliter chitosan. Og tilsett 15 mikroliter av chitosan-løsningen til 15 mikroliter av DNA-origami for å utvikle et DNA origami chitosan polyplex med et N / P-forhold på åtte.Fortsett å forberede polypleksi av forskjellige N / P-forhold, ved hjelp av beregninger som beskrevet i manuskriptet. Forbered 80 millimeter av et rør for 2% agarose gel. Tilsett 352 mikroliter med 2,5 molar magnesiumklorid og deretter pre-flekk den med 10 mikroliter DNA gel flekk.Hell geloppløsningen i en tørr geleske. Sett inn en gelelektroforesekam og la den stivne ved romtemperatur i 15 til 30 minutter. I mellomtiden supplere løpebufferen med 11 millimolar magnesiumklorid.Bland 10 til 20 mikroliter av hver prøve med 20 % av 6X-lastbufferen. Last prøvene inn i agarose gel brønner, inkludert en naken DNA origami som kontroll. Kjør gelen på 70 volt ved romtemperatur i to og en halv til tre timer.Bruk deretter en UV-skanner til å visualisere gelen. For å utføre en DNase I beskyttelsesanalyse, legg til fire mikroliter av hver polyplex sammenlignet med forskjellige N / P-forhold, 1,5 mikroliter med 10X DNase I buffer, 8 mikroliter TB og 1,5 mikroliter DNase I til et separat 2 milliliter PCR-rør. Deretter inkubere det samme ved 37 grader celsius i en termocycler i 24 timer.For å fordøye DNase I, legg til to mikroliter på 20 milliliter proteinase K og inkuber i 30 minutter ved 37 grader celsius i en termocycler. Deretter, for å løse kjernen DNA nanostrukturer legge 3,6 mikroliter på 50 milligram per milliliter 40 kilodaltonn dextransulfat. Bruk deretter disse prøvene og fersk DNA origami som kontroll for å utføre agarose gel elektroforese som tidligere beskrevet.Avgiftsdirektoratet båndet som tilsvarer lastede prøver fra gelen. For å trekke ut DNA origami, bruk en klemme fryse ekstraksjon kolonne og følg produsentens instruksjoner og fortsette med negativ flekk overføring elektron mikroskopi imaging som beskrevet i manuskriptet. Bland 6,5 mikroliter renset 36 nanomær HRP-NR med 6,5 mikroliter polycations av varierende konsentrasjoner.For å forberede en polyplex ved N / P-forhold på en, to, fire, 10 og 20, forberede en tom gruppe ved å blande 6,5 mikroliter destillert vann med 6,5 mikroliter polycations av ulike konsentrasjoner som tilsvarer N / P-forholdene på en, to, fire, 10 og 20. Tilsett deretter 12,5 mikroliter av hver av disse tilberedte løsningene til en egen brønn av en 96-brønnplate. Tilsett deretter 72,5 mikroliter hepes buffer til hver brønn og bland.Tilsett 10 mikroliter med 15 millimolar ABTS og deretter 5 mikroliter av en 12 millimolar hydrogenperoksid til hver brønn og bland ved å pipetter opp og ned. Til slutt, bruk en multimode plateleser til å måle absorbans ved 421 nanometer over fire timer. Etter å ha analysert polypleksier ved hjelp av en gelhemmende analyse, var det et skifte i den nakne nanostrukturen mot katoden, sannsynligvis på grunn av motbalansering av negativ ladning av fosfatgrupper ved binding til polycations, og størrelsen øker komplekset.Når en ekstra mengde polyanioner, som dekstransulfat, ble tilsatt, ble polyplexdannelse reversert. Dekstransulfat med høyere molekylvekt viste seg å være mer effektiv sammenlignet med lavere molekylvekt. Etter å ha analysert polyplexes ved hjelp av negativ flekkoverføring elektronmikroskopi, viste mikrografer nakne DNA origami nanostrukturer, lineære polyetyleniminpolyplexes etter halshugging, chitosan polyplexes, bilder av naken og beskyttet DNA origami utsatt for magnesium uttømming, enzymatisk nedbrytning og serum fordøyelse.I nærvær av DNase I, etter to timer, nakne nanostrukturer ble helt fordøyd, mens lineære polyetylenimin polyplexes av chitosan innkapslet DNA origami forble intakt i nærvær av 10 enheter per milliliter DNase I.Linear polyetylenimin polyplexes beskytte DNA nanostrukturer mer effektivt sammenlignet med chitosan. Når N/P-forholdet mellom polyplex økes, var DNA-fordøyelsen lavere. Etter beleggenzym, eller etter mer funksjonalisert DNA origami, med lineære polyetylenimin polyplexes og chitosan ved variant N /P-forhold, ble det ikke observert bemerkelsesverdig interferens med enzymatisk aktivitet.På den annen side endret kinetisk HRP-enzymet seg dramatisk etter binding til DNA-origamien. Det er viktig å starte med godt renset, DNA origami strukturer. Det finnes en stabler tråd som også kan binde seg til polycations.De er vanskelige å skilles fra DNA origami polyplexes. Våre beleggmolekyler brukes også i genterapiapplikasjoner. Dette betyr at DNA nanostrukturer kan brukes i fremtiden for å endre genomet til levende organismer.For agarose gel farging, vanligvis molekyler brukes som intercalate DNA og er potensielt mutagent. Følg sikkerhetsinstruksjonene i laboratoriet når du ser DNA.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

Origami Inspirert Self-montering av mønstret og rekonfigurerbar Partikler

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Gyroid Nickel Nanostructures from Diblock Copolymer Supramolecules

Gyroid Nickel nanostrukturer fra diblock copolymer Supramolecules

Nanoporous metal foams possess a unique combination of properties - they are catalytically active, thermally and electrically conductive, and furthermore, ...

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Folding og karakterisering av en Bio-responsive Robot fra DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Selvbygging av komplekse Todimensjonale figurer fra Single DNA Fliser

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

Utarbeidelse av Mica og Silicon Underlag for DNA Origami analyse og eksperimentering

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Bio-inspired Polydopamine Surface Modification of Nanodiamonds and Its Reduction of Silver Nanoparticles

Bio-inspirert Polydopamine overflaten modifikasjon av Nanodiamonds og dens reduksjon av Silver nanopartikler

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a ...

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

Stabil DNA motiver og 1D 2D nanostrukturer konstruert fra små sirkulære DNA molekyler

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Assembly of Gold Nanorods into Chiral Plasmonic Metamolecules Using DNA Origami Templates

Montering av gull Nanorods i Chiral Plasmonic Metamolecules ved hjelp av DNA Origami maler

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic ...

DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

DNA Origami-mediert substrat Nanopatterning av uorganiske strukturer for sensing Applications

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA ...

Single-Molecule SERS Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas

Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas

Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas (Video) | JoVE 

Enkeltmolekylære overflateforbedrede Raman-spredningsmålinger aktivert av plasmoniske DNA-origami-nanoantenner

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) has the capability to detect single molecules for which high field enhancement is required. Single-molecule (SM) ...