Name: gene-therapy inspired polycation coating for protection of dna origami nanostructures
Uploaded: 2019-01-19T14:30:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures at JoVE.com

Этот проект получил финансирование от Европейского союза Horizon 2020 исследовательской и инновационной программы под Грант соглашение № 686647. ТЕА изображения были записаны на Morgagni, действовали на 80 кв на объекте EM Венской биоцентр основной зал GmbH (VBCF). Мы хотели бы поблагодарить Tadija Кекич за помощь в графический дизайн и Elisa де LIano за проектирование каркасных наноструктур.

<ol>
	<li>Jones, M. R., Seeman, N. C., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials.+Programmable+materials+and+the+nature+of+the+DNA+bond.">Nanomaterials. Programmable materials and the nature of the DNA bond.</a> Science. 347 (6224), 1260901 (2015).</li><li>Rothemund, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li><li>Takabayashi, S., Klein, W. P., Onodera, C., Rapp, B., Flores-Estrada, J., Lindau, E., Snowball, L., Sam, J. T., Padilla, J. E., Lee, J., Knowlton, W. B., Graugnard, E., Yurke, B., Kuang, W., Hughes, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+and+high+yield+fabrication+of+dense+nanoparticle+arrays+onto+DNA+origami+at+statistically+independent+binding+sites.">High precision and high yield fabrication of dense nanoparticle arrays onto DNA origami at statistically independent binding sites.</a> Nanoscale. 6 (22), 13928-13938 (2014).</li><li>Kuzyk, A., Schreiber, R., Zhang, H., Govorov, A. O., Liedl, T., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconfigurable+3D+plasmonic+metamolecules.">Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules.</a> Nature Material. 13 (9), 862-866 (2014).</li><li>Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+logic-gated+nanorobot+for+targeted+transport+of+molecular+payloads.">A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads.</a> Science. 335 (6070), 831-834 (2012).</li><li>Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reconfigurable+DNA+Accordion+Rack.">A Reconfigurable DNA Accordion Rack.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).</li><li>Kielar, C., Xin, Y., Shen, B., Kostiainen, M. A., Grundmeier, G., Linko, V., Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+stability+of+DNA+origami+nanostructures+in+low-magnesium+buffers.">On the stability of DNA origami nanostructures in low-magnesium buffers.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (30), 9470-9474 (2018).</li><li>Hahn, J., Wickham, S. F. J., Shih, W. M., Perrault, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+the+instability+of+DNA+nanostructures+in+tissue+culture.">Addressing the instability of DNA nanostructures in tissue culture.</a> ACS Nano. 8 (9), 8765-8775 (2014).</li><li>Al-Dosari, M. S., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+Gene+Delivery:+Principle,+limitations,+and+recent+progress.">Nonviral Gene Delivery: Principle, limitations, and recent progress.</a> The AAPS Journal. 11 (4), 671 (2009).</li><li>Ibraheem, D., Elaissari, A., Fessi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+and+DNA+delivery+systems.">Gene therapy and DNA delivery systems.</a> International Journal of Pharmaceutics. 459 (1-2), 70-83 (2014).</li><li>Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+development+of+polymers+for+gene+delivery.">Design and development of polymers for gene delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).</li><li>Ponnuswamy, N., Bastings, M. M. C., Nathwani, B., Ryu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligolysine-based+coating+protects+DNA+nanostructures+from+low-salt+denaturation+and+nuclease+degradation.">Oligolysine-based coating protects DNA nanostructures from low-salt denaturation and nuclease degradation.</a> Nature Communication. 8, 15654 (2017).</li><li>Agarwal, N. P., Matthies, M., G&#252;r, F. N., Osada, K., Schmidt, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Block+copolymer+micellization+as+a+protection+strategy+for+DNA+origami.">Block copolymer micellization as a protection strategy for DNA origami.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (20), 5460-5464 (2017).</li><li>Kiviaho, J. K., Linko, V., Ora, A., Tiainen, T., J&#228;rvihaavisto, E., Mikkil&#228;, J., Tenhu, H., Nonappac, M. A., Kostiainen, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+polymers+for+DNA+origami+coating+-+examining+their+binding+efficiency+and+tuning+the+enzymatic+reaction+rates.">Cationic polymers for DNA origami coating - examining their binding efficiency and tuning the enzymatic reaction rates.</a> Nanoscale. 8 (22), 11674-11680 (2016).</li><li>Perrault, S. D., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-inspired+membrane+encapsulation+of+DNA+nanostructures+to+achieve+in+vivo+stability.">Virus-inspired membrane encapsulation of DNA nanostructures to achieve in vivo stability.</a> ACS Nano. 8 (5), 5132-5140 (2014).</li><li>Ahmadi, Y., De Llano, E., Bari&#353;i&#263;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Poly)cation-induced+protection+of+conventional+and+wireframe+DNA+origami+nanostructures.">(Poly)cation-induced protection of conventional and wireframe DNA origami nanostructures.</a> Nanoscale. 10 (16), 7494-7504 (2018).</li><li>Douglas, S. M., Marblestone, A. H., Teerapittayanon, S., Vazquez, A., Church, G. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+of+3D+DNA-origami+shapes+with+caDNAno.">Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).</li><li>Veneziano, R., Ratanalert, S., Zhang, K., Zhang, F., Yan, H., Chiu, W., Bathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+nanoscale+DNA+assemblies+programmed+from+the+top+down.">Designer nanoscale DNA assemblies programmed from the top down.</a> Science. 352 (6293), 1534 (2016).</li><li>Castro, C. E., Kilchherr, F., Kim, D. N., Shiao, E. L., Wauer, T., Wortmann, P., Bathe, M., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+to+scaffolded+DNA+origami.">A primer to scaffolded DNA origami.</a> Nature Methods. 8 (3), 221-229 (2011).</li><li>Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+and+Characterization+of+a+Bio-responsive+Robot+from+DNA+Origami.">Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami.</a> Journal of Visualized Experiment. (106), 51272 (2015).</li><li>Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+bio-responsive+robot+from+DNA+origami.">Designing a bio-responsive robot from DNA origami.</a> Journal of Visualized Experiment. (77), 50268 (2013).</li><li>Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+complex+two-dimensional+shapes+from+single-stranded+DNA+tiles.">Self-assembly of complex two-dimensional shapes from single-stranded DNA tiles.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), 52486 (2015).</li><li>Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+scalable+preparation+of+pure+and+dense+DNA+origami+solutions.">Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).</li><li>Grigsby, C. L., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+protection+and+release+of+DNA:+tools+to+address+a+bottleneck+of+non-viral+gene+delivery.">Balancing protection and release of DNA: tools to address a bottleneck of non-viral gene delivery.</a> Journal of the Royal Society Interface. 7 (1), 67-82 (2010).</li><li>Li, T., Dong, S., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplex+aptamers+with+peroxidase-like+DNAzyme+functions:+which+is+the+best+and+how+does+it+work.">G-quadruplex aptamers with peroxidase-like DNAzyme functions: which is the best and how does it work.</a> Chemistry - An Asian Journal. 4 (6), 918-922 (2009).</li><li>Cassinelli, V. 1., Oberleitner, B., Sobotta, J., Nickels, P., Grossi, G., Kempter, S., Frischmuth, T., Liedl, T., Manetto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Step+Formation+of+"Chain-Armor"-Stabilized+DNA+Nanostructures.">One-Step Formation of "Chain-Armor"-Stabilized DNA Nanostructures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (27), 7795-7798 (2015).</li><li>Gerling, T., Kube, M., Kick, B., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-programmable+covalent+bonding+of+designed+DNA+assemblies.">Sequence-programmable covalent bonding of designed DNA assemblies.</a> Science Advances. , 1157 (2018).</li><li>Xia, T., Kovochich, M., Liong, M., Meng, H., Kabehie, S., George, S., Zink, J. I., Nel, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+Coating+Enhances+the+Cellular+Uptake+of+Mesoporous+Silica+Nanoparticles+and+Allows+Safe+Delivery+of+siRNA+and+DNA+Constructs.">Polyethyleneimine Coating Enhances the Cellular Uptake of Mesoporous Silica Nanoparticles and Allows Safe Delivery of siRNA and DNA Constructs.</a> ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).</li></ol>

Авторы заявляют нет конфликтов интересов, связанных к настоящему докладу.

В самостоятельной сборки из ДНК-оригами, основных нитей обычно добавляются в избыточный соотношение 5-10 на эшафот. Также эти излишки основных нитей связать поликатион и формы polyplexes в диапазоне Перекрываемая, который далее трудно отделить от ДНК оригами polyplexes. Таким образом важным шагом в формировании polyplex является удалить избыток основных нитей и использовать хорошо очищенная ДНК оригами наноструктур.
Другие методы были разработаны для стабилизации ДНК наноструктур например циклизация нитей ДНК через клик реакции26. Алкины и азид изменение основных нитей необходимы для формирования блокируемые одноцепочечной колец, этот метод ограничен для стабилизации малых наноструктур такой catenane ДНК, а это не охотно масштабируемость для больших ДНК-оригами Структура таких, которые используются в настоящем Протоколе. Недавно, Герлинг etl.27 сообщил метод для создания ковалентной cyclobutene пиримидина димер (CPD) связей между соседними thymidines в ДНК наноструктур с помощью ультрафиолетового облучения. Хотя этот метод является сайт селективный и масштабируемым, его эффективность в деле защиты ДНК-оригами гораздо ниже, чем поликатион покрытия. К примеру ДСП стабилизированный ДНК оригами объектов терпеть только 0,4 ед/мл DNase я за 1 ч, в то время как polyplexes были стабилен в присутствии 10 ед/мл DNase я по крайней мере один день.
Вкратце, генная терапия вдохновил хитозаном и LPEI покрытие является низкая стоимость, одношаговое и эффективный метод для решения долгосрочной стабильности ДНК оригами наноструктур в мг истощены и нуклеиназы богатые средства массовой информации. Обратимость формирования polyplex облегчает его применение в многоэтапный диагностические тесты, где защита ДНК-оригами против nucleolytic деградации или истощения соль имеет решающее значение в один шаг, но может вызвать проблемы в других такие шаги, как ДНК усиление. Кроме того покрытие поликатион-потенциальный подход для повышения клеточного поглощения ДНК оригами наноструктур для доставки лекарств приложения28.

ДНК является универсальным строительным блоком для программируемых самостоятельной сборки из наноразмерных структур1. Наиболее популярным методом для создания наноструктур ДНК это ДНК оригами технику, которая основана на самостоятельной сборки длинные круговые, единый мель ДНК лески с помощью сотен короче формы определение синтетических штапель нити2. Сегодня создание ДНК наноструктур в почти любой геометрии и морфология легко осуществимо. Наноструктур ДНК может быть site-specifically функционализированных с высокой точностью3,4 и может быть запрограммирован для прохождения аллостерический конформационные изменения5,6. Следовательно использование ДНК в качестве строительного материала предлагает уникальную возможность для создания программируемых и отзывчивым специально наноструктур для приложений biosensing, диагностика и доставки лекарств. Однако ДНК наноструктур подвержены пищеварение экзо- и Эндо-nucleases и на основе решетки наноструктур 3D оригами ДНК, как правило, требуют высокой солености буферов (например., 5-20 мм Mg+ 2) для поддержания их целостность7,8.
Быстрой деградации ДНК в nucleases присутствует в крови и внеклеточного матрикса является серьезным препятствием для эффективной в естественных условиях доставки генетических продуктов в клетки9. Чтобы преодолеть это ограничение, в не вирусных генов доставки, ДНК смешивается с катионных полимеров на определенный коэффициент (коэффициент аминов в поликатион фосфатов в ДНК) N/P заряд10. Комплекс из ДНК с Катионный полимер, известный как polyplex, защищает ДНК от нуклеиназы опосредованной деградации и повышает его клеточного поглощения11. Вдохновленный достижений доставки генов, oligolysine12, oligolysine полиэтилен гликоль (PEG) сополимеры13, поли (2-диметиламино ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-на основе полимеров14и вирус капсульных белков15 были использованы для стабилизации ДНК оригами наноструктур.
Недавно мы сообщали метод для защиты ДНК оригами наноструктур в мг истощены и нуклеиназы Рич медиа, используя природный полисахарид Катионный хитозана и синтетические линейной полиэтиленимина (LPEI) был сообщил16. Эта статья является адаптация нашей предыдущей работы и описывает подробный протокол для подготовки polyplexes, их характеристики, тестирование стабильности голый и защищенных наноструктур в низким содержанием соли и нуклеиназы богатые средства массовой информации и изучения возможность адресации функционализированных фермента и aptamer ДНК оригами наноструктур при поликатион покрытия.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1135px;" width="1136">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">10&#215; DNase I reaction buffer</td>
			<td style="width:239px;">New England Biolab (NEB)</td>
			<td style="width:183px;">B0303</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">ABTS (2&#8242;-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt)</td>
			<td style="width:239px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:183px;">J65535</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Amicon ultracentrifugation columns</td>
			<td style="width:239px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:183px;">UCF500308, UCF510024</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:547px;">Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, &#62; 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">523682</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Design-specific staple strands</td>
			<td style="width:239px;">Integrate DNA Technologies (IDT)</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">75027</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">42867</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">DNA gel loading dye (6&#215;)</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">R0611</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">DNase I (RNase free)</td>
			<td style="width:239px;">New England Biolab (NEB)</td>
			<td style="width:183px;">M0303</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">E3889</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, &#8805;99% (titration)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">EDS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Freeze&#39;N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns</td>
			<td style="width:239px;">Biorad</td>
			<td style="width:183px;">7326165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Hemin</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">H9039</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">HEPES</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">H3375</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Hydrogen peroixde slution (32 wt%)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">216763</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">LPEI-25 kDa</td>
			<td style="width:239px;">Polysciences, Inc</td>
			<td style="width:183px;">23966-1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT))</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">NP0004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:547px;">Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da)</td>
			<td style="width:239px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:183px;">O263.1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI &#8804;1.2</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">765090</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI &#8804;1.3</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">764582</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Proteinase K solution (20 mg/ml)</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">AM2548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Streptavidin-conjugated HRP</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">N100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">SYBER safe DNA gel stain</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">S33102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene-therapy inspired polycation coating for protection of dna origami nanostructures

ДНК оригами наноструктур провести огромный потенциал, который будет использоваться для биологических и медицинских приложений. Однако низким содержанием соли условия и nucleases в физиологических жидкостях побудить денатурации и деградации собственн-собранные nanostructures ДНК. В не вирусных генов доставки энзимной деградации ДНК преодолевается инкапсуляции отрицательно заряженной ДНК в катионной оболочки. Здесь, вдохновленные гена доставки достижений, простой, одношаговый и надежной методологии представлены для стабилизации ДНК оригами наноструктур путем покрытия их с хитозаном и линейных полиэтиленимина. Поликатион покрытие эффективно защищает ДНК оригами наноструктур в мг истощены и нуклеиназы богатые средства массовой информации. Этот метод также сохраняет полную адресуемости на основе ферментов и aptamer функционализации ДНК наноструктур.

Были разработаны три ДНК оригами наноструктур различных конфигураций, включая nanorod (NR), nanobottle (NB) и каркас наноструктур (WN) (3D модели наноструктур проиллюстрированы на рис. 2). NR и NB были разработаны основанные на площади и сотовые решетки, соответственно, с помощью caDNAno17 и WN был создан с помощью программного обеспечения Дедал18. Всеобъемлющего протокола для проектирования и самостоятельной сборки наноструктур ДНК была опубликована уже19,20,,2122. Форму конкретных штапель пряди были приказал, самостоятельно собранных и далее очищенный на основе протокола описаны Stahl и др. 23 (шаг 2).
Polyplexes характеризовались гель отсталости пробирного и nsTEM томографии. После смешивания ДНК-оригами с поликатионами, переход в полосе голый наноструктуре к катоду было отмечено (рис. 1А). Это может объясняться противовеса отрицательный заряд фосфатной группы после привязки к поликатионами и общий размер увеличения комплекса. Добавление дополнительного количества полианионами например декстран сульфата может обратить вспять polyplex формирования. В этой связи, декстран сульфата более высокой молекулярной массы (MW ~ 40 кДа) показали, чтобы быть более эффективным по сравнению с нижней низкомолекулярного декстрана сульфат decomplexation (MW ~ 4 кДа) (рис. 1Б).
Во время визуализации LPEI polyplexes по уранила ацетат негативные пятно ТЕА, было трудно изображение любой частицы. Это было предположить, что LPEI может помешать уранила ацетат от привязки к костяк фосфата из-за жесткой экранирование ДНК-оригами. Таким образом до nsTEM изображений, избыточное количество декстран сульфата был добавлен в ЛЕПИ polyplexes. Разгадана наноструктур оригами ДНК показали никаких признаков дефекта, ни разложения. В отличие хитозана polyplexes были успешно воспроизведен образ без необходимости для лечения полианионом (рис. 2).
Все голые ДНК наноструктур (независимо от их различных конфигураций) были денатурированного полностью после одного дня инкубации при 37 ° C в буфере мг ноль, что подтверждается nsTEM изображений. В отличие от наноструктур с покрытием LPEI или хитозана на N/P≥1 остались нетронутыми. Аналогичным образом, DNase I титрования анализы показали восприимчивость незащищенных наноструктур к ферментативного пищеварения. В то время как голый наноструктур были полностью переваривается в присутствии 1 ед/мл DNase, я после 2 h, ЛЕПИ или Хитозан инкапсулированные ДНК-оригами остался неизменным в мг нулевой буфер дополнена 10 ед/мл DNase я как минимум один день (рис. 2). Более высокой стабильности к nucleolytic пищеварение было достигнуто путем увеличения коэффициента N/P polyplexes. Кроме того LPEI защищает ДНК наноструктур более эффективно по сравнению с хитозаном (рис. 3A, рис. 3C), вероятно, из-за более высокой плотности заряда ЛЕПИ, и, таким образом, выше сродство к ДНК24 . Было отмечено никакой разницы при использовании LPEI разной молекулярной массы (рисунок3B).
Адресация в ДНК наноструктур, после инкапсуляции в полимерной оболочке является важной особенностью функциональных групп. Кроме того был рассмотрен совместимости поликатион покрытия с энзим пероксидазы хрена (ПХ) и ДНК-оригами аптамеры (HBA) функционализированных гемин привязки. Три основных нитей биотинилированным торчали от поверхности NR и затем функционализированных с ПХ конъюгированных стрептавидина (три ферментов на ДНК-оригами). Каталитически высокоактивные (Kd: 439 Нм) HBA aptamer PS2. M (5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3') был выбран для этих экспериментов25. До 24 основных пряди были торчали от поверхности NR с компоновщик 5-Нм длины (5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3') следуют PS2. Последовательность М (24 аптамеры на ДНК-оригами). Не замечательный помеха ферментативной или aptamer активность наблюдалась после покрытия HRP - или HBA-функционализированных ДНК-оригами с LPEI и хитозана на вариант N/P коэффициенты (рис. 4A-B)16. Однако кинетическая энзимом HRP резко изменилась после привязки к ДНК-оригами (рис. 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig1.jpg"> Рисунок 1 : Представитель возраст изображения polyplex формирования и деинкапсуляции. (A) assay переноса электрофоретической подвижности для NB смешанного с хитозаном на N/P соотношения 0.01-8. Каждый Лейн содержит 1 нмоль NB. Первый Лейн является ссылкой NB. (B) деинкапсуляции polyplexes, Полианионная декстран сульфата (DS). Этот показатель был изменен ранее опубликованные на рисунке16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig2.jpg"> Рисунок 2 : Негативные пятно ТЕА микроскопии ДНК-оригами и polyplexes. 3D модель и nsTEM микроскопии голый ДНК оригами наноструктур (колонки 1 и 2). nsTEM микроскопии LPEI polyplexes (после деинкапсуляции) и хитозана polyplexes (колонки 3 и 4). nsTEM изображения обнаженных и охраняемых ДНК оригами (polyplex) подвергается мг истощения (колонки 5, 6 и 7), энзимной деградации (колонки 8 и 9), сыворотка пищеварения (колонок 10 и 11) за один день на 37 ° C. LPEI-5 кДа был использован в этот assay. Голый наноструктур ДНК были деградированных за пределы обнаружения на эпоху присутствии 1 ед/мл DNase I или в ТБ + 10% FBS после 2 ч инкубации при температуре 37 ° C. Масштаб бары: 100 Нм. Этот показатель был изменен ранее опубликованные на рисунке16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig3.jpg"> Рисунок 3 : Представитель результаты DNase I защита анализов. (A) DNase I assay защиты для polyplexes WN с LPEI-5 кДа, LPEI-10 кДа и LPEI-25 кДа, подготовленный на N/P коэффициент 2, 4, 8 и 10. Образцы были подвергнуты 10 ед/мл DNase I для 24 ч при 37 ° C. Последний Лейн является элементом управления WN. Polyplexes были очищенные до погрузки в гель. (B) интенсивность нормализованных средней полосы для polyplexes ДНК origamis с различными LPEI извлеченные из возраста изображения A. Ось Y представляет собой нормализованное средняя полоса интенсивности. (C) DNase I защита пробирного Хитозан WN polyplexes подготовлен на N/P соотношения 1, 2, 4, 10 и 20. Образцы были подвергнуты 10 ед/мл DNase I для 24 ч при 37 ° C. Переулок 6 является элемент управления polyplex (N/P 20). Последний Лейн является элементом управления WN. Все хитозана polyplexes были очищенные до загрузки в гель. Этот показатель был изменен ранее опубликованные на рисунке16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig4.jpg"> Рисунок 4: результаты представитель колориметрические фермента - и aptamer функционализированных анализов ДНК оригами. (A) колориметрические assay фермента функционализированных наноструктур (HRP-NR) покрытием с хитозаном 3.7 ч после начала реакции. (B) колориметрического анализа aptamer функционализированных наноструктур (HBA-NR) покрытием с хитозаном, 6 мин после начала реакции. Ось Y представляет собой нормализованное поглощения. (C) мониторинг колориметрические assay HRP и ПХ-NR с течением времени. Этот показатель был изменен ранее опубликованные на рисунке16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Катионные полимеры</td>
			<td>Хитозан</td>
			<td>LPEI-5 кДа</td>
			<td>LPEI-10 кДа</td>
			<td>LPEI-25 кДа</td>
		</tr>
<tr>
<td>Молекулярная масса полимера (кДа)</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Молекулярная масса мономера (г/моль)</td>
			<td>161</td>
			<td>43</td>
			<td>43</td>
			<td>43</td>
		</tr>
<tr>
<td>Количество Амин на мономера</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Количество аминов в полимер</td>
			<td>28</td>
			<td>116</td>
			<td>232</td>
			<td>581</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1. Расчет числа групп аминов в поликатион.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Молекулярная масса декстран сульфата (кДа)</td>
			<td>4</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>Молекулярная масса мономера (г/моль)</td>
			<td>366</td>
			<td>366</td>
		</tr>
<tr>
<td>Количество сульфата на мономера</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Количество сульфата в полимер</td>
			<td>22</td>
			<td>220</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2. Расчет количество сульфата групп за полианионом.

Watch this Scientific Journal Video about Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures at JoVE.com

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

Генная терапия вдохновил поликатион покрытие для защиты ДНК оригами наноструктур

Здесь представлен протокол для защиты ДНК оригами наноструктур в мг истощены и нуклеиназы богатые средства массовой информации, используя природный полисахарид Катионный хитозана и синтетические линейной полиэтиленимина (LPEI) покрытия.

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...

Биологическая стабилизация наноструктур ДНК имеет важное значение для будущих виво-приложений, таких как целевая доставка лекарств. Тем не менее, ДНК деградирует в организме различными ферментами. Здесь мы представляем технику покрытия, которая защищает наноструктуры ДНК от энзиматической деградации.Основные преимущества заключается в том, что наше покрытие состоит из нетоксичных соединений, которые уже используются в живых организмах, и что функционализация поверхности остается возможной. Эта функционализация имеет важное значение для включения молекулярных датчиков для распознавания целевых и переключателей для выпуска наркотиков. Поликационные покрытия значительно увеличивают клеточное поглощение инкапсулированных структур оригами ДНК, поэтому этот метод может открыть дверь для применения ДНК-оригамиса в диагностике и терапии.Клеточное поглощение также необходимо для потенциального применения генов в нанотехнологиях ДНК. Я считаю, что метод довольно прост и может быть легко освоен. Для начала измерьте концентрацию очищенных оригами ДНК.Используйте два микролитров буфера туберкулеза в качестве пробела для калибровки ультрафиолетового спектрофотометра. А затем измерить концентрацию оригами ДНК на 260 нанометров. Затем вычислите количество фосфатов в очищенной ДНК оригами раствор, используя формулу 2, как описано в рукописи.Подготовьте 15 микролитров структуры оригами ДНК, включив в него одну наномолу фосфата, используя буфер туберкулеза для разбавления. Добавьте 13,2 микролитров к ТБ до 1,8 микролитров хитозана. И добавьте 15 микролитров хитозанового раствора в 15 микролитров оригами ДНК для разработки ДНК-оригами хитозан-полиплекса с соотношением N/P восемь.Продолжить подготовку полиплексов различных соотношений N/P, используя расчеты, описанные в рукописи. Приготовьте 80 миллиметров трубки для 2%agarose геля. Добавьте 352 микролитера 2,5 мларного хлорида магния, а затем предварительно окрашивайте его 10 микролитров пятна геля ДНК.Налейте гель раствор в сухую коробку геля. Вставьте гель электрофорез гребень и дайте ему затвердеть при комнатной температуре в течение 15 до 30 минут. Тем временем дополните бегущий буфер 11 миллимолярдным хлоридом магния.Смешайте от 10 до 20 микролитров каждого образца с 20% буфера загрузки 6X. Загрузите образцы в колодцы агарозы геля, в том числе голые оригами ДНК в качестве контроля. Вы запустите гель на 70 вольт при комнатной температуре в течение двух с половиной до трех часов.Затем используйте УФ-сканер для визуализации геля. Для выполнения анализа защиты DNase I добавьте четыре микролитера каждого полиплекса по сравнению с различными коэффициентами N/P, 1,5 микролитров буфера 10X DNase I, 8 микролитров туберкулеза и 1,5 микролитров DNase I в отдельную 2 миллилитровую ПЦР-трубку. Затем инкубировать же при 37 градусах по Цельсию в термоциклере в течение 24 часов.Чтобы переварить DNase I, добавьте два микролитров по 20 миллиграммов на миллилитров протеиназы K и инкубировать в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию в термоциклере. Затем, чтобы разгадать основные наноструктуры ДНК добавить 3,6 микролитров 50 миллиграммов на миллилитр 40 килодальтонов декстран сульфата. Затем используйте эти образцы и свежие оригами ДНК в качестве контроля для выполнения агарозы гель электрофорез, как описано ранее.Акцизная полоса, соответствующая загруженным образцам из геля. Для извлечения оригами ДНК используйте колонку для извлечения замораживания сжатия и следуйте инструкциям производителя и продолжайте с помощью изображения электронной микроскопии передачи отрицательных пятен, как описано в рукописи. Смешайте 6,5 микролитров очищенных 36 наномолярных HRP-NR с 6,5 микролитров поликаций различной концентрации.Для подготовки полиплекса в соотношении N/P один, два, четыре, 10 и 20, подготовьте пустую группу, смешивая 6,5 микролитров дистиллированной воды с 6,5 микролитров поликаций различных концентраций, соответствующих соотношению N/P одного, двух, четырех, 10 и 20. Затем добавьте 12,5 микролитров каждого из этих подготовленных растворов в отдельный колодец из 96 пластин. Затем добавьте 72,5 микролитров буфера HEPES к каждой колодец и перемешайте.Добавьте 10 микролитров 15 миллимолярной ABTS, а затем 5 микролитров перекиси водорода 12 миллимоляров к каждой хорошо и смешайте путем трубопроводов вверх и вниз. Наконец, используйте мультимодный считыватель пластин для измерения абсорбции на 421 нанометров в течение четырех часов. После анализа полиплексов с помощью анализа гелезащиты, произошло смещение голой наноструктуры в сторону катода, вероятно, из-за уравновешивания отрицательного заряда фосфатных групп при связывании с поликациями, а также увеличения размера комплекса.При добавлении дополнительного количества полианионов, таких как декстран сульфат, полиплексное образование было обращено вспять. Декстран сульфат более высокого молекулярного веса показал свою эффективность по сравнению с более низким молекулярным весом. Проанализировав полиплексы с помощью электронной микроскопии передачи отрицательных пятен, микрографы показали голые наноструктуры ДНК оригами, линейные полиэтилениминные полиплексы после декапсулирования, хитозан-полиплексы, изображения обнаженных и защищенных ДНК оригами, подвергаемых истощению магния, энзиматической деградации и пищеварению сыворотки.В присутствии DNase I, через два часа, голые наноструктуры были полностью переварены, в то время как линейные полиэтиленимин полиплексы хитозан инкапсулированных ДНК оригами остались нетронутыми в присутствии 10 единиц на миллилитр DNase I.Linear полиэтилениленимин полиплексы защищают наноструктуры ДНК более эффективно по сравнению с хитозан. Когда соотношение N/P полиплекса увеличивается, пищеварение ДНК было ниже. После покрытия фермента, или после более функционализированной ДНК оригами, с линейными политиленимин полиплексами и хитозаном в варианте N/P коэффициентов, никаких замечательных помех с ферментативной активностью не наблюдалось.С другой стороны, кинетик фермента HRP резко изменился после связывания с оригами ДНК. Важно начать с хорошо очищенных структур оригами ДНК. Существует более стабильная нить, которая также может связываться с поликациями.Их трудно отделить от полиплексов оригами ДНК. Наши молекулы покрытия также используются в применениях генной терапии. Это означает, что наноструктуры ДНК могут быть использованы в будущем для изменения генома живых организмов.Для окрашивания геля агарозы, как правило, используются молекулы, которые интеркалируют ДНК и потенциально мутагеничны. Пожалуйста, следуйте инструкциям по безопасности вашей лаборатории при окрашивания ДНК.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

Вдохновленные оригами самосборки Узорчатое и Reconfigurable Частицы

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Gyroid Nickel Nanostructures from Diblock Copolymer Supramolecules

Gyroid Никель Наноструктуры из диблоксополимера супрамолекул

Nanoporous metal foams possess a unique combination of properties - they are catalytically active, thermally and electrically conductive, and furthermore, ...

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Складной и характеристика Био-отзывчивого робота от ДНК оригами

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Самоорганизация сложных двумерных фигур из одноцепочечной ДНК Плитка

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

Подготовка слюды и кремниевых подложках для ДНК оригами анализа и экспериментированию

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Bio-inspired Polydopamine Surface Modification of Nanodiamonds and Its Reduction of Silver Nanoparticles

Био вдохновил Polydopamine поверхности модификация наноалмазов и его сокращение наночастиц серебра

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a ...

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

Стабильная ДНК мотивы, 1D и 2D наноструктур, построенных из небольшой циркуляр ДНК молекул

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Assembly of Gold Nanorods into Chiral Plasmonic Metamolecules Using DNA Origami Templates

Ассамблея золота наностержни в хиральная плазмонных Metamolecules с помощью ДНК оригами шаблонов

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic ...

DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

ДНК Оригами-Оригами-Оригами Субстрат Nanopatterning неорганических структур для зондирования приложений

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA ...

Single-Molecule SERS Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas

Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas

Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas (Video) | JoVE 

Измерения комбинационного рассеяния света с поверхностным усилением одной молекулы с помощью плазмонных наноантенн оригами ДНК

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) has the capability to detect single molecules for which high field enhancement is required. Single-molecule (SM) ...