Name: gene-therapy inspired polycation coating for protection of dna origami nanostructures
Uploaded: 2019-01-19T14:30:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures at JoVE.com

Detta projekt har fått finansiering från EU: s Horizon 2020 forskning och innovation program under lån avtal nr 686647. TEM bilder har spelats in på en Morgagni som drivs på 80 kV vid EM anläggningen av den Vienna Biocenter Core faciliteter GmbH (VBCF). Vi vill tacka Tadija Kekic för bistånd i grafisk design och Elisa De LIano för att utforma wireframe nanostrukturen.

1. förbereda Polycation lager lösning
<ol><li>LPEI stamlösning<ol>
<li>Lägga till 10 mg LPEI i ett glasbägare som innehåller < 10 mL H2O.</li>
		<li>För att helt upplösa LPEI, lägga till HCl (32%) tills når pH 2,0.</li>
		<li>Justera pH till 7,0 av NaOH (10 M).</li>
		<li>Justera volymen till en slutlig koncentration av 1 mg/mL.</li>
		<li>Filtratet LPEI lager lösningen genom ett 0,22 µm membran.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chitosan stamlösning<ol>
<li>Lös 16,6 mg chitosan oligosackarid laktat (Mw ~ 5 kDa, 60% oligosackarid sammansättning, deacetylated från Chitinen av 90%) i 1 mL ättiksyra (10%) vattenmedium att förbereda en utgångslösning med en koncentration på 10 mg/mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. rening av DNA Origami nanostrukturer
<ol><li>Mix 100 µL av origami DNA-provet (i 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 5 mM NaCl buffert (betecknas som TB) inklusive 18 mM MgCl2) med motsvarande volymen av 22 mM MgCl kompletterade2 TB (100 µL) i en 1,5 mL tub.</li>
	<li>Tillsätt 200 µL av rening buffert (15% (w/v) PEG 8.000, 5 mM Tris, 1 mM EDTA och 505 mM NaCl). Blanda försiktigt genom röret inversion.</li>
	<li>Snurra provet vid 16.000 × g i rumstemperatur (r.t.) i 25 min.</li>
	<li>Noggrant avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 16 mM MgCl2 kompletteras TB buffert. Supernatanten och pelleten innehålla överflödig krampa kardeler och utfällda DNA-origami, respektive.</li>
	<li>Inkubera provet för en dag på r.t. på 650 rpm i en thermomixer. Detta steg är för komplett resuspension av DNA-origami.</li>
</ol>3. agaros Gel-elektrofores (år)
<ol><li>Tillsätt 1,6 g agaros och 80 mL 0.5 x TAE buffert (20 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 10 mM ättiksyra, pH 8) i en glasbägare att förbereda en 2% agarosgel. Mikrovågsugn för 5 min. snurra innehållet i bägaren för 1 min i ett vattenbad. Tillsätt 352 µL av MgCl2 (2,5 M) att förbereda gelen med 11 mM MgCl2. Pre fläcken gelen med 10 µL av DNA gel fläcken.</li>
	<li>Häll en torr gelboxen gellösningen och infoga en gelelektrofores kam. Låt lösningen stelna på r.t. för 15-30 min.</li>
	<li>Komplettera det rinnande buffert (0,5 x TAE buffert) med 11 mM MgCl2.</li>
	<li>Blanda 10-20 µL av provet med 20% av 6 x lastning buffert (30% (v/v) glycerol, 0,25% (w/v) bromofenolblått, 0,25% (w/v) xylen cyanol FF) och ladda den i agaros gel brunnar.</li>
	<li>Kör gelen vid 70 V på r.t. för 2,5 - 3 h.</li>
	<li>Visualisera gelen med en UV scanner.</li>
</ol>4. negativa fläcken transmissionselektronmikroskopi (nsTEM)
<ol><li>Gäller 5 µL utspädda nanostrukturen eller polyplex på en glöd-urladdat kol-belagd Cu400 TEM rutnät. Låt det adsorbera för ca. 1 min.</li>
	<li>Dränera överflödig vätska från kanten av rutnätet genom att en bit av filterpapper.</li>
	<li>Tillsätt 5 µL av en 2% uranyl acetat vattenlösning och vänta i 1 min.</li>
	<li>Använd filterpapper kanten att helt tömma överflödig vätska från kanten av rutnätet.</li>
	<li>Låt rutnätet torka helt innan injicera det i TEM.</li>
</ol>5. Polyplex bildandet
Obs: Belysande exempel för att förbereda ett polyplex bestående av DNA-origami och chitosan vid N/P 0,01-8 förhållanden.
<ol><li>Beräkna antalet aminer per polycation använder formel-1 (tabell 1).</li>
	<li>Mätning av koncentrationen av renade DNA-origami använder en ultra violett spektrofotometer vid 260 nm. Använda 2 µL av TB buffert som tomrummet för att kalibrera maskinen. Beräkna den ”nmol av fosfat” använda formel-2.</li>
	<li>Förbereda 15 µL av de DNA-origami struktur inklusive 1 nmol av fosfat.</li>
	<li>Använd formel-3 för att beräkna volymen av kitosan, som behövs för att förbereda polyplex på N/P 0,01-8. Exempelvis för att förbereda polyplex på N/P 8, 1,8 µL av kitosan (0,8 mg/mL) behövs (N/P 8, nmol av fosfat är 1, molekylvikt av kitosan är 5.000 g/mol, koncentration av kitosan stamlösning är 0,8 mg/mL och antalet aminer per chitosan är 28). Lägga till 13,2 µL av TB 1.8 µL av kitosan (0,8 mg/mL). Tillsätt 15 µL chitosan lösning (0,8 mg/mL) i 15 µL av de DNA-origami från steg 5.3 att få en DNA-origami-chitosan polyplex med NP 8. Polyplex bildas spontant.</li>
	<li>Upprepa steg 5,4 att förbereda polyplexes på olika N/P nyckeltal.</li>
	<li>Utför en ålder som beskrivs i steg 3 (figur 1A). Inkludera den nakna DNA-origami som kontroll.</li>
	<li>Bild av polyplex enligt beskrivningen i Steg4 (figur 2). Formel-1) antal amine grupper per polycation <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq1.jpg"> Formel-2) Mole av fosfat =<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq2.jpg"> Formel-3) Volym (µL) av polycations =<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq3.jpg">
</li>
</ol>6. avkodning av inkapsling med Dextran sulfat
<ol><li>Beräkna antalet sulfat grupper per dextran sulfat använder formel-4 (tabell 2).</li>
	<li>Beräkna volymen av dextran sulfat behövs för decomplexation av polyplex på en fördefinierad A / P förhållandet med formel-5. A / P charge förhållandet är förhållandet mellan sulfat grupperna av polyanion (A) till den DNA-origami fosfat grupperna (P). Ett självriskbelopp dextran sulfat behövs för en effektiv decomplexation av polyplexes (t.ex. 500-1 000). Till exempel decomplex polyplex beredda i avsnitt 5 (polyplex innehåller 1 nmol av fosfat) vid A / P 1000, 3,6 µL av dextran sulfat 40 kDa (50 mg/mL) behövs (A / P är 1000 nmol av fosfat är 1, molekylvikten för dextran sulfat är 40.000 g/mol koncentrationen av dextran sulfat stamlösning är 50 mg/mL och antalet sulfat är 220). Lägga till 3,6 µL dextran sulfat (50 mg/mL) i polyplex från steg 5,4 och blanda väl.</li>
	<li>Om arbetar med en chitosan polyplex, tillsätt NaOH för att underlätta decomplexation. Tillsätt NaOH i en slutlig koncentration på 10 mM. Hoppa över detta steg för LPEI polyplexes.</li>
	<li>Utför en ålder som beskrivs i steg 3 (figur 1B). Inkludera en naken DNA-origami och polyplex som kontroll. Formel-4) antal av sulfat grupper per polyanion = <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq4.jpg"> Formel-5) Volym (µL) dextran sulfat =<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq5.jpg">
</li>
</ol>7. stabilitet mot Mg utarmning
<ol><li>Tvätta 20 µL av en DNA-origami eller den motsvarande polyplex (inklusive 2 nmol fosfat) med 4 x 600 µL av Mg-noll buffert (5 mM Tris, 1 mM EDTA och 30 mM NaCl) med hjälp av kolumnen ultrafiltrering (MWCO ~ 3 kDa). Snurra varje tvätt på 14.000 × g på r.t. för 3-5 min.</li>
	<li>Samla de återstående lösningen (80 µL) och inkubera vid 37 ° C för en dag på 650 rpm i en thermomixer.</li>
	<li>Om testning LPEI polyplex, tillsätt 2,5 µL av MgCl2 (500 mM) för en slutlig koncentration på 16 mM MgCl2. Lägg sedan till 7 µL av dextran sulfat-40 kDa (50 mg/mL) (motsvarande till A / P 1000) nysta kärnan DNA nanostrukturer (avkodning av inkapsling, se steg 6). Obs: Hoppa över detta steg om arbetar med chitosan polyplex eller nakna DNA-origami.</li>
	<li>Följ nsTEM imaging som beskrivs i steg 3 (figur 2).</li>
</ol>8. DNAS jag titrering haltbestämning av Naket DNA Origami nanostrukturer
<ol><li>Blanda 3 µL av nakna DNA-origami inklusive 1 nmol fosfat med 2 µL 10 x DNAS jag buffert (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, pH 7,6) 1 µL av MgCl2 (250 mM), 12 µL av vatten i 0,2 mL PCR-rör. Tillsätt 2 µL av DNAS jag (10 x). Justera DNAS lager koncentration jag (10 x) att få slutgiltiga DNAS jag koncentrationer av 0,25-2 U/mL.</li>
	<li>Inkubera proverna vid 37 ° C i 1-2 h i en termocykler.</li>
	<li>Sänk ned proverna i isen och inaktivera aktiviteten nucleolytic genom att lägga till 2 µL 500 mM Ditiotreitol (DTT) och 2,5 µL av EGTA (33 mM).</li>
	<li>Analysera proverna med en ålder som beskrivs i steg 3.</li>
</ol>9. stabilitet av Polyplexes mot DNAS jag
<ol><li>Blanda 4 µL av en polyplex (inklusive 1 nmol av fosfat, beredd på olika N/P nyckeltal) med 1,5 µL av en DNAS jag buffra (10 x), 8 µL av TB och 1,5 µL av DNAS I (100 U/mL) i en 0,2 mL PCR tube.</li>
	<li>Inkubera provet för 24 h vid 37 ° C i en termocykler.</li>
	<li>Tillsätt 2 µL av proteinas K (20 mg/mL) att smälta den DNAS I. Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C i en termocykler. Obs: i stället för enzymatisk nedbrytning, kemisk inaktivering av DNAS I genom att lägga till 1,5 µL DTT (500 mM) och 2 µL av EGTA (33 mM) kan utföras.</li>
	<li>Tillsätt 3,6 µL av dextran sulfat-40 kDa (50 mg/mL) (motsvarande till A / P 1000) nysta kärnan DNA nanostrukturer.</li>
	<li>Utför ålder som beskrivs i steg 3 (figur 3A, figur 3 c). Inkludera färsk DNA-origami som kontroll för att mäta och jämföra stödnivåerna som band på gelen.</li>
	<li>Punktskatt bandet på ålder och extrahera den DNA-origami av en squeeze frysa utvinning kolumn utifrån protokollet tillhandahålls av leverantören.</li>
	<li>Följ nsTEM imaging som beskrivs i Steg4 (figur 2).</li>
</ol>10. stabilitet mot fostrets bovint Serum (FBS)
<ol><li>Blanda 4 µL nakna DNA-origami eller dess motsvarande polyplex (inklusive 1 nmol av fosfat) med 17 µL av TB + 10% FBS i 0,2 mL PCR-rör. Använd färska tinade FBS.</li>
	<li>Inkubera provet vid 37 ° c i en termocykel för 24 h.</li>
	<li>Fördjupa provet i ett isbad.</li>
	<li>Om testning av polyplex, utför avkodning av inkapsling processen genom att lägga till 3,6 µL av dextran sulfat-40 kDa (50 mg/mL). Lägg dessutom till NaOH om arbetar med chitosan polyplexes (se steg 6.3)</li>
	<li>Utför en ålder som beskrivs i steg 3. Inkludera den färska DNA-origami som kontroll för att mäta och jämföra stödnivåerna som band på gelen.</li>
	<li>Punktskatt bandet på ålder och extrahera den DNA-origami genom en squeeze frysa utvinning kolumn.</li>
	<li>Tillsätt 2 µL av proteinas K (20 mg/mL) till extraherad DNA origami lösningen (20 µL) i en 0,2 mL PCR-rör. Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C i en termocykler att smälta serumproteiner bunden till nanostrukturerna.</li>
	<li>Tvätta provet med 5 x 500 µL av TB inklusive 16 mM MgCl2 använda kolumnen ultracentrifugering (MWCO ~ 100 kDa) att tvätta proteinas K (MW ~ 28,9 kDa) bort. Snurra varje tvätt på 14.000 × g på r.t. för 3-5 min.</li>
	<li>Utföra nsTEM imaging som beskrivs i steg 4 (figur 3). Obs: Gel extraherade provet från steg 10,6 kan användas direkt för nsTEM imaging. Bildtagning kan dock mycket utmanande på grund av fastsättning av serumproteiner till DNA origami nanostrukturerna. Proteinas K behandling (steg 10.7-10.9) rekommenderas därför att underlätta avbildningsprocessen.</li>
</ol>11. testning av adressering av pepparrotperoxidas enzym (HRP)-functionalized DNA-Origami vid beläggning med Polycations
<ol><li>Rena själv monterade biotinylerade-NR (Biotin-NR) som beskrivs i steg 2.</li>
	<li>Inkubera 200 µL av renat Biotin-NR (36 nM, i 16 mM kompletteras TB buffert) med 200 µL av HRP-konjugerad streptividin (540 nM, i TB-buffert). Tillsätt 4,8 µL av MgCl2 (500 mM) till en slutkoncentration på 14 mM. Inkubera vid r.t. för 12 h på 650 rpm i en thermomixer</li>
	<li>Rena HRP-functionalized NR (HRP-NR) genom en PEG reningsmetod (som beskrivs i steg 2) för att ta bort de obundna HRP-enzymerna. Återsuspendera den utfällda HRP-NR i TB inklusive 16 mM MgCl2.</li>
	<li>Blanda 6,5 µL av renat HRP-NR (36 nM) med 6,5 µL av polycations av variant koncentrationer att förbereda polyplex på N/P nyckeltal 1, 2, 4, 10 och 20 (med formel 3).</li>
	<li>Upprepa steg 11.2-11.4 för icke-biotinylerade NR. Som enzymet HRP kan binda icke-specifikt till den DNA-origami, den icke-biotinylerade DNA-origami, som behandlas med HRP enzymer och PEG renat (liknar Biotin-NR), kommer att fungera som kontroll i analysen.</li>
	<li>Blanda 6,5 µL destillerat vatten med 6,5 µL av polycations av variant koncentrationer motsvarande de definierade N/P-kvot för 1, 2, 4, 10 och 20. Avhandlingar prover fungera som gruppen tom.</li>
	<li>Lägga den beredda lösningen i steg 11,4-11,6 (12,5 µL) till en plattan med 96 brunnar inklusive 72.5 µL av HEPES buffert (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, 0,05% Triton x-100, 1% DMSO, pH 7,4) och blanda väl.</li>
	<li>Tillsätt 10 µL av 2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 mM).</li>
	<li>Tillsätt 5 µL H2O2 (12 mM) och blanda väl genom pipettering upp och ner. H2O2 initierar reaktionen.</li>
	<li>Mät absorbansen vid 421 nm över 4 h med en multimode Plattläsare (figur 4A).</li>
</ol>12. testning av adressering av Hemin-bindande Aptamers (HBA)-functionalized DNA-Origami vid beläggning med Polycations
<ol><li>Rena HBA functionalized-NR (HBA-NR) som beskrivs i steg 2. Återsuspendera den utfällda HBA-NR i TB kompletteras med 6 mM MgCl2 (högre saltkoncentration leder till sammanläggning av HBA-NR).</li>
	<li>Blanda 10 µL av HBA-NR (40 nM) med 10 µL polycations vid varierande koncentration att förbereda polyplex av definierade N/P nyckeltal 1, 2, 10 och 20.</li>
	<li>Blanda 10 µL av nakna-NR (40 nM) eller destillerat vatten med 10 µL polycations på varierande koncentrationer motsvarande N/P nyckeltal 1, 2, 10 och 20.</li>
	<li>Lägg till 20 µL beredda lösningen från steg 12.2 och 12.3 i den plattan med 96 brunnar inklusive 60 µL av HEPES buffert (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, 0,05% Triton x-100, 1% DMSO, pH 7,4) och blanda väl. Inkludera minst ett blindprov ersätta 20 µL polyplex eller polycation lösningen (från steg 12.2 och 12.3) med vatten.</li>
	<li>Tillsätt 5 µL av hemin (0,04 mM) följt av 10 µL av ATBS (15 mM). Placera plattan i orbitalskak för 5 min.</li>
	<li>Tillsätt 5 µL H2O2 (12 mM) och blanda väl genom pipettering upp och ner.</li>
	<li>Mät absorbansen vid 421 nmover 30 min med multimode plattan läsaren (figur 4B).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jones, M. R., Seeman, N. C., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials.+Programmable+materials+and+the+nature+of+the+DNA+bond.">Nanomaterials. Programmable materials and the nature of the DNA bond.</a> Science. 347 (6224), 1260901 (2015).</li><li>Rothemund, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li><li>Takabayashi, S., Klein, W. P., Onodera, C., Rapp, B., Flores-Estrada, J., Lindau, E., Snowball, L., Sam, J. T., Padilla, J. E., Lee, J., Knowlton, W. B., Graugnard, E., Yurke, B., Kuang, W., Hughes, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+and+high+yield+fabrication+of+dense+nanoparticle+arrays+onto+DNA+origami+at+statistically+independent+binding+sites.">High precision and high yield fabrication of dense nanoparticle arrays onto DNA origami at statistically independent binding sites.</a> Nanoscale. 6 (22), 13928-13938 (2014).</li><li>Kuzyk, A., Schreiber, R., Zhang, H., Govorov, A. O., Liedl, T., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconfigurable+3D+plasmonic+metamolecules.">Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules.</a> Nature Material. 13 (9), 862-866 (2014).</li><li>Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+logic-gated+nanorobot+for+targeted+transport+of+molecular+payloads.">A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads.</a> Science. 335 (6070), 831-834 (2012).</li><li>Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reconfigurable+DNA+Accordion+Rack.">A Reconfigurable DNA Accordion Rack.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).</li><li>Kielar, C., Xin, Y., Shen, B., Kostiainen, M. A., Grundmeier, G., Linko, V., Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+stability+of+DNA+origami+nanostructures+in+low-magnesium+buffers.">On the stability of DNA origami nanostructures in low-magnesium buffers.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (30), 9470-9474 (2018).</li><li>Hahn, J., Wickham, S. F. J., Shih, W. M., Perrault, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+the+instability+of+DNA+nanostructures+in+tissue+culture.">Addressing the instability of DNA nanostructures in tissue culture.</a> ACS Nano. 8 (9), 8765-8775 (2014).</li><li>Al-Dosari, M. S., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+Gene+Delivery:+Principle,+limitations,+and+recent+progress.">Nonviral Gene Delivery: Principle, limitations, and recent progress.</a> The AAPS Journal. 11 (4), 671 (2009).</li><li>Ibraheem, D., Elaissari, A., Fessi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+and+DNA+delivery+systems.">Gene therapy and DNA delivery systems.</a> International Journal of Pharmaceutics. 459 (1-2), 70-83 (2014).</li><li>Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+development+of+polymers+for+gene+delivery.">Design and development of polymers for gene delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).</li><li>Ponnuswamy, N., Bastings, M. M. C., Nathwani, B., Ryu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligolysine-based+coating+protects+DNA+nanostructures+from+low-salt+denaturation+and+nuclease+degradation.">Oligolysine-based coating protects DNA nanostructures from low-salt denaturation and nuclease degradation.</a> Nature Communication. 8, 15654 (2017).</li><li>Agarwal, N. P., Matthies, M., G&#252;r, F. N., Osada, K., Schmidt, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Block+copolymer+micellization+as+a+protection+strategy+for+DNA+origami.">Block copolymer micellization as a protection strategy for DNA origami.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (20), 5460-5464 (2017).</li><li>Kiviaho, J. K., Linko, V., Ora, A., Tiainen, T., J&#228;rvihaavisto, E., Mikkil&#228;, J., Tenhu, H., Nonappac, M. A., Kostiainen, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+polymers+for+DNA+origami+coating+-+examining+their+binding+efficiency+and+tuning+the+enzymatic+reaction+rates.">Cationic polymers for DNA origami coating - examining their binding efficiency and tuning the enzymatic reaction rates.</a> Nanoscale. 8 (22), 11674-11680 (2016).</li><li>Perrault, S. D., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-inspired+membrane+encapsulation+of+DNA+nanostructures+to+achieve+in+vivo+stability.">Virus-inspired membrane encapsulation of DNA nanostructures to achieve in vivo stability.</a> ACS Nano. 8 (5), 5132-5140 (2014).</li><li>Ahmadi, Y., De Llano, E., Bari&#353;i&#263;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Poly)cation-induced+protection+of+conventional+and+wireframe+DNA+origami+nanostructures.">(Poly)cation-induced protection of conventional and wireframe DNA origami nanostructures.</a> Nanoscale. 10 (16), 7494-7504 (2018).</li><li>Douglas, S. M., Marblestone, A. H., Teerapittayanon, S., Vazquez, A., Church, G. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+of+3D+DNA-origami+shapes+with+caDNAno.">Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).</li><li>Veneziano, R., Ratanalert, S., Zhang, K., Zhang, F., Yan, H., Chiu, W., Bathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+nanoscale+DNA+assemblies+programmed+from+the+top+down.">Designer nanoscale DNA assemblies programmed from the top down.</a> Science. 352 (6293), 1534 (2016).</li><li>Castro, C. E., Kilchherr, F., Kim, D. N., Shiao, E. L., Wauer, T., Wortmann, P., Bathe, M., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+to+scaffolded+DNA+origami.">A primer to scaffolded DNA origami.</a> Nature Methods. 8 (3), 221-229 (2011).</li><li>Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+and+Characterization+of+a+Bio-responsive+Robot+from+DNA+Origami.">Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami.</a> Journal of Visualized Experiment. (106), 51272 (2015).</li><li>Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+bio-responsive+robot+from+DNA+origami.">Designing a bio-responsive robot from DNA origami.</a> Journal of Visualized Experiment. (77), 50268 (2013).</li><li>Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+complex+two-dimensional+shapes+from+single-stranded+DNA+tiles.">Self-assembly of complex two-dimensional shapes from single-stranded DNA tiles.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), 52486 (2015).</li><li>Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+scalable+preparation+of+pure+and+dense+DNA+origami+solutions.">Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).</li><li>Grigsby, C. L., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+protection+and+release+of+DNA:+tools+to+address+a+bottleneck+of+non-viral+gene+delivery.">Balancing protection and release of DNA: tools to address a bottleneck of non-viral gene delivery.</a> Journal of the Royal Society Interface. 7 (1), 67-82 (2010).</li><li>Li, T., Dong, S., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplex+aptamers+with+peroxidase-like+DNAzyme+functions:+which+is+the+best+and+how+does+it+work.">G-quadruplex aptamers with peroxidase-like DNAzyme functions: which is the best and how does it work.</a> Chemistry - An Asian Journal. 4 (6), 918-922 (2009).</li><li>Cassinelli, V. 1., Oberleitner, B., Sobotta, J., Nickels, P., Grossi, G., Kempter, S., Frischmuth, T., Liedl, T., Manetto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Step+Formation+of+"Chain-Armor"-Stabilized+DNA+Nanostructures.">One-Step Formation of "Chain-Armor"-Stabilized DNA Nanostructures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (27), 7795-7798 (2015).</li><li>Gerling, T., Kube, M., Kick, B., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-programmable+covalent+bonding+of+designed+DNA+assemblies.">Sequence-programmable covalent bonding of designed DNA assemblies.</a> Science Advances. , 1157 (2018).</li><li>Xia, T., Kovochich, M., Liong, M., Meng, H., Kabehie, S., George, S., Zink, J. I., Nel, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+Coating+Enhances+the+Cellular+Uptake+of+Mesoporous+Silica+Nanoparticles+and+Allows+Safe+Delivery+of+siRNA+and+DNA+Constructs.">Polyethyleneimine Coating Enhances the Cellular Uptake of Mesoporous Silica Nanoparticles and Allows Safe Delivery of siRNA and DNA Constructs.</a> ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).</li></ol>

Författarna förklarar inga intressekonflikter som relaterade till detta betänkande.

I den självmontering av DNA-origami, krampa trådar vanligtvis läggs i 5-10 överskott förhållande till schavotten. Dessa överskott krampa trådar binder också till den polycation och bildar polyplexes i intervallet monometer som ytterligare är svårt att skiljas från DNA origami polyplexes. Därmed är ett avgörande steg i polyplex bildandet att ta bort överflödig krampa trådar och använda väl renat DNA origami nanostrukturer.
Andra metoder har utvecklats för att stabilisera DNA nanostrukturer såsom ringbildning av DNA-strängar via ett klick reaktion26. Som alkynen - och natriumazid-modifierade krampa delarna krävs för bildandet av förreglad enkelsträngat ringar, denna teknik är begränsad för stabiliseringen av små nanostrukturer sådan en DNA-catenane, och det är inte lätt skalbar för större DNA-origami struktur som används i detta protokoll. Nyligen, Gerling et enl.27 rapporterade en metod för att skapa kovalent cyclobutene pyrimidin dimer (CPD) obligationer mellan närliggande thymidines inom DNA nanostrukturer med ultraviolett bestrålning. Även om denna metod är webbplats-selektiv och skalbar, är dess effektivitet för att skydda DNA-origami mycket lägre än polycation beläggning. Till exempel uthärda CPD-stabiliserad DNA origami objekt bara 0.4 U/mL DNAS jag för 1 h, medan polyplexes var stabil i närvaro av 10 U/mL DNAS jag för minst en dag.
I korthet, genterapi inspirerad chitosan och LPEI beläggning är en låg kostnad, one-step och effektiv metod att ta itu med DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmat och nuclease-rika medier långsiktiga stabilitet. Reversibiliteten av polyplex bildandet underlättar dess tillämpning i flera steg diagnostiska tester där skydd av DNA-origami mot nucleolytic nedbrytning eller salt-utarmning är avgörande i ett steg men kan orsaka problem i andra åtgärder såsom DNA förstärkning. Dessutom är polycation beläggning en potentiell strategi för att öka cellulära upptaget av DNA origami nanostrukturer för drog-leverans program28.

DNA är en mångsidig byggsten för de programmerbara självmontering av nanoskala strukturer1. Den mest populära metoden för att skapa DNA nanostrukturer är den DNA-origami-teknik, som bygger på den självmontering av en lång cirkulär, enda stranded DNA strandar Rullställning med hjälp av hundratals kortare form-bestämma syntetiska stapelvara2. Idag är skapandet av DNA nanostrukturer nästan alla geometri och morfologi lätt genomförbart. DNA nanostrukturer kan vara anläggningsvis functionalized med hög precision3,4 och kan programmeras att genomgå Alloster konfirmerande ändringar5,6. Därför erbjuder använda DNA som byggnadsmaterial en unik möjlighet att skapa programmerbara och lyhörd specialdesignade nanostrukturer för applikationer i biosensing, diagnostik och läkemedel. Men DNA nanostrukturer är mottagliga för matsmältningen av exo- och endo-nukleaser och galler-baserat 3D DNA origami nanostrukturer kräver i allmänhet hög salthalt buffertar (t.ex., 5-20 mM Mg+ 2) att upprätthålla sin integritet7,8.
Den snabba nedbrytningen av DNA av nukleaser närvarande i blodet och den extracellular matrisen är ett stort hinder för effektiva i vivo leverans av genetiska produkter in i celler9. För att övervinna denna begränsning, icke-viral genen leveransen, blandas DNA med en katjoniska polymer ett definierade N/P avgift baserat (förhållandet mellan aminer i polycation till fosfater i DNA)10. Komplex av DNA med en katjoniska polymer, känd som polyplex, skyddar DNA från nuclease-medierad nedbrytning och förbättrar dess cellernas upptag11. Inspirerad av gen leverans framsteg, oligolysine12, oligolysine-polyetylen glykol (PEG) sampolymerer13, poly (2-dimethylamino-ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-baserade polymerer14, och virus kapsid proteiner15 har använts för att stabilisera DNA origami nanostrukturer.
Nyligen rapporterade vi en metod för skydd av DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmat och nuclease-rich media med den naturliga katjoniska polysackarid chitosan och den syntetiska linjära polyethyleneimine (LPEI) var rapporterade16. Denna artikel är en anpassning av vårt tidigare arbete och beskriver det detaljerade protokollet för beredning av polyplexes, deras karakterisering, testa stabiliteten i naken och skyddade nanostrukturer i låg salthalt och nuclease-rika medier och undersöka den adressering av enzym - och aptamer-functionalized DNA origami nanostrukturer vid polycation beläggning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1135px;" width="1136">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">10&#215; DNase I reaction buffer</td>
			<td style="width:239px;">New England Biolab (NEB)</td>
			<td style="width:183px;">B0303</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">ABTS (2&#8242;-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt)</td>
			<td style="width:239px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:183px;">J65535</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Amicon ultracentrifugation columns</td>
			<td style="width:239px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:183px;">UCF500308, UCF510024</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:547px;">Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, &#62; 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">523682</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Design-specific staple strands</td>
			<td style="width:239px;">Integrate DNA Technologies (IDT)</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">75027</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">42867</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">DNA gel loading dye (6&#215;)</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">R0611</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">DNase I (RNase free)</td>
			<td style="width:239px;">New England Biolab (NEB)</td>
			<td style="width:183px;">M0303</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">E3889</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, &#8805;99% (titration)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">EDS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Freeze&#39;N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns</td>
			<td style="width:239px;">Biorad</td>
			<td style="width:183px;">7326165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Hemin</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">H9039</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">HEPES</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">H3375</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Hydrogen peroixde slution (32 wt%)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">216763</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">LPEI-25 kDa</td>
			<td style="width:239px;">Polysciences, Inc</td>
			<td style="width:183px;">23966-1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT))</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">NP0004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:547px;">Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da)</td>
			<td style="width:239px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:183px;">O263.1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI &#8804;1.2</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">765090</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI &#8804;1.3</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">764582</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Proteinase K solution (20 mg/ml)</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">AM2548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">Streptavidin-conjugated HRP</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">N100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:547px;">SYBER safe DNA gel stain</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFischer sceintific</td>
			<td style="width:183px;">S33102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene-therapy inspired polycation coating for protection of dna origami nanostructures

DNA origami nanostrukturer håller en enorm potential att användas för biologiska och medicinska tillämpningar. Dock inducerar låg salthalt villkor och nukleaser i fysiologiska vätskor denaturering och nedbrytning av själv monterade DNA nanostrukturer. I icke-virala gen leverans, är enzymatiska nedbrytningen av DNA betagen av inkapsling av negativt laddade DNA i ett katjonaktiva skal. Häri, inspirerad av gen leverans framsteg, en enkel, one-step och robust metod presenteras för stabiliseringen av DNA origami nanostrukturer genom att täcka dem med chitosan och linjär polyethyleneimine. Polycation beläggningen skyddar effektivt DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmat och nuclease-rika medier. Denna metod bevarar också den fullständiga adressering av enzym - och aptamer-baserade funktionalisering av DNA nanostrukturer.

Tre DNA origami nanostrukturer av olika konfigurationer utformades, inklusive en nanorod (NR), en nanobottle (NB) och en trådram nanostruktur (WN) (3D-modeller av nanostrukturerna illustreras i figur 2). NR och NB utformades utifrån ett torg och bikakestruktur galler, respektive, med caDNAno17 och WN skapades med hjälp av Daedalus programvara18. Ett omfattande protokoll för design och självmontering av DNA nanostrukturer har varit publicerade redan19,20,21,22. Form-specifika krampa delar beställdes, själv monterade och ytterligare renas baserat på ett protokoll som beskrivs av Stahl et al. 23 (steg 2).
Polyplexes präglades av gel utvecklingsstörning assay och nsTEM imaging. Vid blandning av DNA-origami med polycations, observerades en förskjutning i nakna nanostruktur bandet mot katoden (figur 1A). Detta kan tillskrivas den motvikt av den negativa laddningen av fosfat grupper vid bindning till polycations och den totala storleken ökar av komplexet. Lägga till ett extra belopp på polyanions såsom dextran sulfat kan återföra polyplex bildandet. I detta avseende, dextran sulfat med högre molekylvikt (MW ~ 40 kDa) visade sig vara mer effektivt för den decomplexation jämfört med lägre molekylvikt dextran sulfat (MW ~ 4 kDa) (figur 1B).
Medan avbildning LPEI polyplexes av uranyl acetat negativa fläcken TEM, var det svårt att bild partiklar. Det var en hypotes om att LPEI kan hindra uranyl acetat från att binda till fosfat ryggraden på grund av snäva skärmning av DNA-origami. Därför före nsTEM imaging lades ett självriskbelopp dextran sulfat till LEPI-polyplexes. Avslöjad DNA origami nanostrukturerna visade inga tecken på defekt eller nedbrytning. I stället var chitosan polyplexes framgångsrikt avbildas utan behov av polyanion behandling (figur 2).
Alla nakna DNA nanostrukturer (oavsett deras olika konfigurationer) var denaturerat helt efter en dag av inkubation vid 37 ° C i Mg-noll buffert, vilket bekräftas av nsTEM imaging. Däremot förblev nanostrukturer belagda med LPEI eller chitosan på N/P≥1 intakt. Likaså, DNase jag titrering analyserna visade känslighet av oskyddade nanostrukturer mot enzymatisk nedbrytning. Medan naken nanostrukturer var helt rötas i närvaro av 1 U/mL DNAS stannade jag efter 2 h, LEPI eller chitosan inkapslade DNA-origami intakt i kompletteras Mg-noll buffert med 10 U/mL DNAS jag för minst en dag (figur 2). Högre stabilitet mot nucleolytic matsmältningen uppnåddes genom att öka N/P förhållandet av polyplexes. Dessutom skyddar LPEI DNA nanostrukturerna mer effektivt jämfört med chitosan (figur 3A, figur 3C), förmodligen på grund av högre laddningstätheten LEPI, och således högre affinitet mot DNA24 . Ingen skillnad observerades när du använder LPEI med olika molekylvikt (figur3B).
Adressering av funktionella grupper i DNA nanostrukturer efter inkapsling i en polymer skal är en viktig funktion. Dessutom undersöktes polycation beläggning förenlighet med pepparrotperoxidas enzym (HRP) och hemin-bindande aptamers (HBA) functionalized DNA-origami. Tre biotinylerade krampa delarna var stack från ytan av NR och sedan functionalized med HRP konjugerat streptividin (tre enzymer per DNA-origami). De katalytiskt högaktiv (Kd: 439 nM) HBA aptamer PS2. M (5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3') valdes för dessa experiment25. Upp till 24 krampa trådar var stack från NR ytan med en 5-nm längd länkare (5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3') följt av PS2. M-sekvens (24 aptamers per DNA-origami). Inga anmärkningsvärda hinder av enzymatiska eller aptamer aktivitet observerades vid beläggning HRP - eller HBA-functionalized DNA-origami med LPEI och chitosan variant N/P nyckeltal (figur 4A-B)16. Dock har den kinetiska av HRP enzym dramatiskt ändrats efter bindning till DNA-origami (figur 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig1.jpg"> Figur 1 : Representativa ålder bilder av polyplex bildandet och avkodning av inkapsling. (A) elektroforetiska mobilitet Skift analysen för NB blandat med chitosan på N/P förhållandet mellan 0,01-8. Varje lane innehåller 1 nmol NB. Den första lanen är referensen NB. (B) avkodning av inkapsling av polyplexes av polyanjonisk dextran sulfat (DS). Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerade figur16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig2.jpg"> Figur 2 : Negativa fläcken TEM micrographs av DNA-origami och polyplexes. 3D modell och nsTEM micrographs av nakna DNA origami nanostrukturer (kolumnerna 1 och 2). nsTEM micrographs LPEI polyplexes (efter avkodning av inkapsling) och chitosan polyplexes (kolumnerna 3 och 4). nsTEM bilder av nakna och skyddade DNA-origami (polyplex) utsätts för Mg utarmning (kolumnerna 5, 6 och 7), enzymatisk nedbrytning (kolumner 8 och 9), serum matsmältningen (kolumner 10 och 11) för en dag vid 37 ° C. LPEI-5 kDa användes i denna analys. Nakna DNA nanostrukturer var förstörd bortom upptäckt på en ålder i närvaro av 1 U/mL DNAS jag eller i TB + 10% FBS efter 2 h inkubation vid 37 ° C. Skala barer: 100 nm. Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerade figur16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig3.jpg"> Figur 3 : Representativa resultat av DNAS jag skydd analyser. (A) DNAS jag analys för polyplexes WN med LPEI-5 kDa, LPEI-10 kDa och LPEI-25 kDa beredd på N/P förhållandet mellan 2, 4, 8 och 10. Proverna utsattes för 10 U/mL DNAS för 24 timmar vid 37 ° C. Den senaste lanen är kontrollen WN. Polyplexes var decapsulated före lastning i gelen. (B) normaliserad menar bandet intensiteten för polyplexes av DNA origamis med olika LPEI utvinns ur ålder bild-A. Y-axeln representerar normaliserade menar bandet intensitet. (C) The DNAS jag analys av kitosan-WN polyplexes beredd på N/P nyckeltal 1, 2, 4, 10 och 20. Proverna utsattes för 10 U/mL DNAS för 24 timmar vid 37 ° C. Lane 6 är den kontroll polyplex (N/P 20). Den senaste lanen är kontrollen WN. Alla chitosan polyplexes var decapsulated före lastning i gelen. Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerade figur16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig4.jpg"> Figur 4: representant resultaten av kolorimetriska enzym - och aptamer-functionalized DNA origami analyser. (A) den kolorimetriska analysen av enzym-functionalized nanostrukturer (HRP-NR) belagd med chitosan 3.7 h efter reaktion. (B) kolorimetriska analys av aptamer-functionalized nanostrukturer (HBA-NR) belagd med chitosan, 6 min efter reaktion inledningen. Y-axeln representerar normaliserade absorbansen. (C) övervaka den kolorimetriska analysen av HRP och HRP-NR över tiden. Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerade figur16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Katjoniska polymerer</td>
			<td>Chitosan</td>
			<td>LPEI-5 kDa</td>
			<td>LPEI-10 kDa</td>
			<td>LPEI-25 kDa</td>
		</tr>
<tr>
<td>Molekylvikt av polymer (kDa)</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Molecualr vikt av monomer (g/mol)</td>
			<td>161</td>
			<td>43</td>
			<td>43</td>
			<td>43</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antal amine per monomer</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antal amine per polymer</td>
			<td>28</td>
			<td>116</td>
			<td>232</td>
			<td>581</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. Beräkningen av antalet amine grupper per polycation.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Molekylvikt dextran sulfat (kDa)</td>
			<td>4</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>Molekylvikt av monomer (g/mol)</td>
			<td>366</td>
			<td>366</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antal sulfat per monomer</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antal sulfat per polymer</td>
			<td>22</td>
			<td>220</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2. Beräkningen av antalet sulfat grupper per polyanion.

Watch this Scientific Journal Video about Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures at JoVE.com

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

Genterapi inspirerade Polycation beläggning för skydd av DNA Origami nanostrukturer

Här presenteras ett protokoll för att skydda DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmat och nuclease-rich media med naturliga katjoniska polysackarid chitosan och syntetiska linjära polyethyleneimine (LPEI) beläggningar.

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...

Den biologiska stabiliseringen av DNA-nanostrukturer är avgörande för framtida in vivo-tillämpningar, såsom riktad läkemedelstillförsel. Emellertid, DNA blir försämras i kroppen av olika enzymer. Här presenterar vi en beläggningsteknik som skyddar DNA-nanostrukturer från enzymatisk nedbrytning.De största fördelarna är att vår beläggning omfattar giftfria föreningar som redan används i levande organismer och att funktionaliseringen av ytan förblir möjlig. Denna funktionalisering är viktig för att införliva molekylära sensorer för måligenkänning och växlar för drug cargo release. Polycationbeläggningar ökar signifikant cellulära upptaget av inkapslade DNA origami strukturer, så denna metod kan öppna dörren för tillämpningar av DNA origamis i diagnostik och therapeutics.Det cellulära upptaget krävs också för potentiella genleveranstillämpningar av DNA-nanotekniken. Jag anser att metoden är ganska okomplicerad och lätt kan behärskas. Till att börja, mäta koncentrationen av renad DNA origami.Använd två mikroliter tb-buffert som tom för att kalibrera ultraviolett spektrofotometer. Och sedan mäta DNA origami koncentration vid 260 nanometer. Beräkna sedan mängderna av fosfater i den renade DNA origami-lösningen, med hjälp av formel två, som beskrivs i manuskript.Förbered 15 mikroliter av DNA origami strukturen genom att inkludera en nanomol av fosfat, med hjälp av TB buffert för utspädning. Lägg till 13,2 mikroliter till TB till 1,8 mikroliter av chitosan. Och lägg till 15 mikroliter av chitosanlösningen till 15 mikroliter av DNA-origami för att utveckla en DNA-origami chitosan polyplex med ett N/P-förhållande på åtta.Fortsätt att förbereda polyplexer av olika N/P-förhållanden, med hjälp av beräkningar som beskrivs i manuskriptet. Förbered 80 millimeters ett rör för 2%agarosgel. Tillsätt 352 mikroliter av 2,5 molar magnesiumklorid och sedan pre-fläcken det med 10 mikroliter av DNA gel fläck.Häll gellösningen i en torr geldosa. Sätt i en gelelektroforeskam och låt den stelna vid rumstemperatur i 15 till 30 minuter. Under tiden komplettera den rinnande bufferten med 11 millimolar magnesiumklorid.Blanda 10 till 20 mikroliter av varje prov med 20%av 6X lastning buffert. Ladda proverna i agarosgelns brunnar, inklusive en naken DNA origami som kontroll. Kör gelen i 70 volt i rumstemperatur i två och en halv till tre timmar.Använd sedan en UV-skanner för att visualisera gelen. För att utföra en DNase I-skyddsanalys, tillsätt fyra mikroliter av varje polyplex jämfört med olika N/P-förhållanden, 1,5 mikroliter av 10X DNase I-buffert, 8 mikroliter tb och 1,5 mikroliter av DNase I till ett separat 2 milliliter PCR-rör. Sedan inkubera samma vid 37 grader celsius i en thermocycler i 24 timmar.För att smälta DNase I, tillsätt två mikroliter på 20 milligram per milliliter proteinas K och inkubera i 30 minuter vid 37 grader celsius i en thermocycler. Sedan, att riva upp kärnan DNA nanostrukturer lägga 3,6 mikroliter av 50 milligram per milliliter 40 kilodalton dextran sulfat. Använd sedan dessa prover och färsk DNA origami som kontroll för att utföra agarosgelelektrofores som tidigare beskrivits.Punktskatt bandet motsvarar laddade prover från gelen. För att extrahera DNA origami, använd en squeeze frysa extraktion kolumn och följ tillverkarens instruktioner och fortsätta med negativa fläcken överföring elektronmikroskopi avbildning som beskrivs i manuskriptet. Blanda 6,5 mikroliter av renad 36 nanomolar HRP-NR med 6,5 mikroliter av polykationer av varierande koncentrationer.För att förbereda en polyplex vid N/P-förhållanden på en, två, fyra, 10 och 20, förbereda en tom grupp genom att blanda 6,5 mikroliter av destillerat vatten med 6,5 mikroliter polyliter av olika koncentrationer som motsvarar N / P-talen på en, två, fyra, 10 och 20. Tillsätt sedan 12,5 mikroliter av var och en av dessa beredda lösningar till en separat brunn av en 96 brunnsplatta. Tillsätt sedan 72,5 mikroliter av HEPES buffert till varje brunn och blanda.Tillsätt 10 mikroliter på 15 millimolar ABTS och sedan 5 mikroliter av en 12 millimolar väteperoxid till varje brunn och blanda genom pipettering upp och ner. Slutligen, använd en multimode platta läsare för att mäta absorbans vid 421 nanometer över fyra timmar. Efter att ha analyserat polyplexer med hjälp av en gel retardation assay, det fanns en förskjutning i den nakna nanostrukturen mot katoden, förmodligen på grund av motvikt av den negativa laddningen av fosfat grupper på bindning till polycations, och storleken ökningen av komplexet.När en extra mängd polyanioner, såsom dextran sulfat, lades till, polyplex bildning återfördes. Dextran sulfat av högre molekylvikt visade sig vara effektivare jämfört med lägre molekylvikt. Efter att ha analyserat polyplexes med hjälp av negativa fläcken överföring elektronmikroskopi, visade micrographs nakna DNA origami nanostrukturer, linjär polyetylenimine polyplexes efter halshuggning, chitosan polyplexes, bilder av nakna och skyddade DNA utsätts för magnesium utarmning, enzymatisk nedbrytning och serum matsmältningen.I närvaro av DNase I, efter två timmar, nakna nanostrukturer var helt rötas, medan den linjära polyetylenimine polyplexes av chitosan inkapslade DNA origami stannade intakt i närvaro av 10 enheter per milliliter DNase I.Linear polyetylenimine polyplexes skydda DNA nanostrukturerna mer effektivt jämfört med chitosan. När N/P-förhållandet för polyplex ökas, dna-matsmältningen var lägre. Efter beläggning enzym, eller efter mer funktionaliserad DNA origami, med linjär polyetylenimine polyplexes och chitosan vid variant N/P nyckeltal, observerades inga anmärkningsvärda interferens med enzymatisk verksamhet.Å andra sidan, den kinetiska hrp-enzym dramatiskt förändrats efter bindning till DNA origami. Det är viktigt att börja med väl renas, DNA origami strukturer. Det finns en stabilare sträng som också kan binda till polykationer.De är svåra att skiljas från DNA origami polyplexes. Våra beläggningsmolekyler används också i genterapiapplikationer. Detta innebär att DNA-nanostrukturerna kan användas i framtiden för att förändra arvsmassan hos levande organismer.För agaros gelfärgning används vanligtvis molekyler som intercalate DNA och är potentiellt mutagena. Var vänlig följ säkerhetsanvisningarna från ditt laboratorium vid infärgning av DNA.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

Origami inspirerade självorganisering av Mönstrade och omkonfigurerbara partiklar

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Gyroid Nickel Nanostructures from Diblock Copolymer Supramolecules

Gyroid Nickel nanostrukturer från disegmentsampolymer Supramolecules

Nanoporous metal foams possess a unique combination of properties - they are catalytically active, thermally and electrically conductive, and furthermore, ...

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Vikning och karakterisering av en Bio-lyhörd robot från DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Själv montering av komplexa Tvådimensionella former från Single DNA Tiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

Framställning av Mica och kiselsubstrat för DNA Origami analys och Experiment

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Bio-inspired Polydopamine Surface Modification of Nanodiamonds and Its Reduction of Silver Nanoparticles

Bio-inspirerade Polydopamine yta ändring av Nanodiamonds och dess förminskning av Silvernanopartiklar

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a ...

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

Stabil DNA motiv, 1D och 2D nanostrukturer tillverkad av små cirkulära DNA-molekyler

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Assembly of Gold Nanorods into Chiral Plasmonic Metamolecules Using DNA Origami Templates

Montering av guld nanorör till kirala plasmoniska Metamolecules använda DNA-Origami mallar

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic ...

DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

DNA origami-medierad substrat Nanopatterning av oorganiska strukturer för avkänning av applikationer

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA ...

Single-Molecule SERS Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas

Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas

Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas (Video) | JoVE 

Enmolekylära ytförstärkta Raman-spridningsmätningar möjliggjorda av plasmoniska DNA-origami nanoantenner

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) has the capability to detect single molecules for which high field enhancement is required. Single-molecule (SM) ...