Name: multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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我们感谢米哈伊尔·夏皮罗博士和尼基塔·雷兹尼克博士进行了富有成果的讨论。这项工作得到了西方卫生科学大学启动资金和国家卫生研究院 r21ns101384 赠款的支持。

1. 透明透明聚酯薄膜上的生长细胞
<ol><li>使用垂直压钻在标准35毫米培养盘底部钻12毫米孔大小。慢慢移动钻头, 并戴上护目镜。使用刀片取出连接在盘子底部的塑料碎片, 在侧面形成光滑的表面 (图 2)。</li>
	<li>在菜品的外底面涂上一层薄薄的海洋级环氧树脂或胶水。</li>
	<li>将聚酯薄膜 (2.5 微米厚) 放在盘子的外底面上, 并用力按压, 以确保环氧胶在薄膜和厚塑料表面之间均...

<ol>
	<li>Elhelf, I. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+intensity+focused+ultrasound:+The+fundamentals,+clinical+applications+and+research+trends.">High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends.</a> Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).</li><li>Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , (2018).</li><li>Duck, F. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanobiology+of+brain+function.">The mechanobiology of brain function.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).</li><li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+neuromodulation+with+ultrasound?+A+continuum+mechanics+hypothesis.">Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis.</a> Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).</li><li>Tufail, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+pulsed+ultrasound+stimulates+intact+brain+circuits.">Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits.</a> Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).</li><li>Tyler, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+excitation+of+neuronal+circuits+using+low-intensity,+low-frequency+ultrasound.">Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound.</a> PloS One. 3 (10), e3511 (2008).</li><li>Suarez Castellanos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+ultrasound+stimulation+of+secretory+events+from+pancreatic+beta+cells.">Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells.</a> Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).</li><li>Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+Stimulation+of+Insulin+Release+from+Pancreatic+Beta+Cells+as+a+Potential+Novel+Treatment+for+Type+2+Diabetes.">Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).</li><li>Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonogenetics+is+a+non-invasive+approach+to+activating+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 6, 8264 (2015).</li><li>Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Piezo1+but+Not+NaV1.2+Channels+by+Ultrasound+at+43+MHz.">Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).</li><li>Kubanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+modulates+ion+channel+currents.">Ultrasound modulates ion channel currents.</a> Scientific Reports. 6, 24170 (2016).</li><li>Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+response+of+model+lipid+membranes+to+ultrasonic+radiation+force.">Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force.</a> PloS One. 8 (10), e77115 (2013).</li><li>Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic+Neuromodulation+Causes+Widespread+Cortical+Activation+via+an+Indirect+Auditory+Mechanism.">Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism.</a> Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).</li><li>O'Brien, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-biophysics+mechanisms.">Ultrasound-biophysics mechanisms.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corrigendum:+Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 8, 16148 (2017).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 3, 736 (2012).</li><li>Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+mechanisms+of+millimeter+wave+stimulation+of+excitable+cells.">Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells.</a> Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).</li><li>Hwang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+contactless+high+frequency+ultrasound+microbeam+stimulation+for+determination+of+invasion+potential+of+breast+cancer+cells.">Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).</li><li>Nakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+ratiometric+fluorescent+thermometer+with+wide+range+and+rapid+response.">Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response.</a> PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).</li><li>Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+intracellular+temperature+using+green+fluorescent+protein.">Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein.</a> Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).</li></ol>

聚焦超声的一个主要优点是能够以高时空精度向生物样品非侵入性地传递机械和热能或热能。其他旨在机械刺激细胞的技术通常采用侵入性物理探针 (如细胞戳), 或需要高能激光束与异物 (如光推子) 相互作用。磁加热可以加热生物样品中的特定空间位置, 但需要存在外来磁性纳米粒子。另一方面, 使用红外或微波激发17、18、19可以?...

许多疾病需要某种形式的侵入性医疗干预。这些程序往往费用高昂, 风险大, 需要恢复期, 从而给保健系统增加负担。非侵入性治疗方式有可能为传统外科手术提供更安全、更便宜的替代品。然而, 目前的非侵入性方法, 如药物治疗或经颅磁刺激往往受到组织渗透、时空分辨率和不必要的非目标效应之间权衡的限制。在这方面, 聚焦超声是一种很有希望的非侵入性技术, 有可能操纵组织内部深处的生物功能, 具有较高的时空准确性和有限的非目标效应。
聚焦超声刺激包括在生物体深处的精确位置提供声学能量。根据声学脉冲参数, 这种能量可以有多种医学用途。例如, 食品药品监督管理局已批准使用高强度聚焦超声 (hifu) 对前列腺肿瘤、引起震颤的大脑区域、子宫肌瘤和导致疼痛的神经端进行热消融1.hif 介导的微泡空化也被用来短暂地打开血脑屏障, 以便有针对性地提供系统管理的治疗方法2。用于 hfu 应用的空间峰值脉冲平均强度 (isppa) 和空间峰值时间平均强度 (ispta) 通常在几个 kw cm-2 以上, 并产生几十兆帕的脉冲压力。这些强度值远远高于 fda 批准的 isppa和 isppa限制的诊断超声, 190 w 厘米-2和 720 mw 厘米-2, 分别为3。相反, 最近的研究表明, 在诊断超声强度限制 (lipus) 范围内或接近范围内的非破坏性脉冲超声刺激可以有效地远程和安全地操纵神经射击4, 5,6,7,8, 激素分泌9,10和生物工程细胞11。然而, 细胞感知和对超声反应的细胞和分子机制仍不清楚, 排除了 lipus 的临床翻译。因此, 在过去几年中, 超声刺激的人造膜、培养细胞和动物的研究获得了揭示 lipus12,13 调节的生物物理和生理过程的势头. 14,15。
声音是由通过物理介质传播的振动组成的。超声波是一种频率高于人类听觉范围 (即超过20千赫) 的声音。在实验室环境中, 超声波通常由压电传感器产生, 这些传感器包含一种材料, 该材料在特定高频带宽中振荡的电场时振动。有两种类型的传感器: 单元件传感器和传感器阵列。单元件压电换能器具有一个曲面, 作为一个聚焦透镜, 因此将声能集中到一个被称为焦点区的定义区域。单元件传感器比传感器阵列更便宜、更易于操作。本文将重点介绍单元素传感器。
聚焦单元件传感器的焦距大小取决于声学透镜的几何特性及其声学频率。为了使用单个元件传感器实现毫米大小的焦距, 通常需要 mhz 范围内的超声波频率。不幸的是, 在空气等稀薄介质中传播时, 这样频率的声波会非常迅速地衰减。因此, 需要在更密集的材料 (如水) 中生成和传播到样品中的 mhz 超声波。这是将 lipus 模式集成到显微镜中的第一个挑战。
第二个挑战是沿着声路最大限度地减少具有不同声阻抗 (材料密度和声速的乘积) 的材料之间的物理接口。这些接口可以反射、折射、散射和吸收声波, 因此很难量化有效传递到样品的声能量量。它们还可能产生不需要的机械制品。例如, 反射产生的垂直于声学不匹配阻抗接口会产生反向传播波, 从而干扰向前传播的波。沿着干涉路径, 波在称为节点的空间的固定区域相互抵消, 并在称为反节点的交替区域进行求和, 从而产生所谓的驻波 (图 1)。实验者必须能够在体外控制或消除这些实验接口, 因为它们可能在体内不存在。
光学记者荧光测量是一种众所周知的实时询问透明生物样品的方法, 没有物理干扰。因此, 这种方法是 lipus 研究的理想选择, 因为在声纳区域存在的任何物理探针都会引入机械人工制品。该协议描述了 lipus 在商业荧光显微镜上的实现和操作。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CERNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>SliceScope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optomechanical components</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HFO series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>DSOX2004A (4-channels 70MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>function generator</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>33500B (20MHz single-channel)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronic Navigation Industries (ENI)</td>
			<td rowspan="2">325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronics &#38; Innovation (E&#38;I)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>focused immersion transdcuers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Benthowave Instrument</td>
			<td>HiFu transducer BII-76 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>Piezo-ceramic or HiFu transducers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Ultrasonic-S-lab</td>
			<td>HiFu transducers made to order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-density Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>VWR 80094-330</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar film 2.5 microns</td>
			<td>Chemplex</td>
			<td>CAT.NO:107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy

通过聚焦穿透软组织的低强度超声脉冲, lipus 代表了一种很有前途的生物医学技术, 可以远程和安全地操作神经发射、激素分泌和基因重新编程的细胞。然而, 由于缺乏生物物理机制, 目标组织能够感知和响应 lipus, 这一技术在医疗应用中的翻译工作目前受到阻碍。识别这些机制的一个适当方法是使用光学生物传感器与 lipus 相结合, 以确定潜在的信号通路。然而, 将 lipus 应用于荧光显微镜可能会引入不需要的机械人工制品, 因为存在反射、吸收和折射声波的物理界面。本文介绍了一个循序渐进的过程, 将 lipus 集成到商业上可用的直立荧光显微镜上, 同时最大限度地减少沿声学路径的物理界面的影响。描述了一个简单的程序来操作单元超声传感器, 并将传感器的焦点带入目标焦点。利用钙成像技术测量的人胶质母细胞瘤细胞中, 通过 lips 诱导的钙瞬变技术说明了 lipus 的应用。

图 5是使用钙成像多路复用的 lipus 实验的一个例子。在标准培养基中 (辅以10% 血清和1% 抗生素) 的 empm 涂层聚酯薄膜上培养胶质母细胞瘤细胞 (a-172), 并以钙敏感荧光记者氟-4 am 孵育。使用10倍浸入透镜对细胞进行成像, 并使用白色 led 光源进行照明, 并使用标准 gfp 滤光片集收集荧光灯。lipus 是通过手动驱动脉冲波形为 158 v 峰值振幅、0.1 ms 脉冲持续时?...

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Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy

低强度脉冲超声刺激 (lipus) 是一种非侵入性机械刺激的方式内源性或工程细胞具有较高的空间和时间分辨率。本文介绍了如何将 lipus 应用于荧光显微镜, 以及如何最大限度地减少超声路径上的声阻抗不匹配, 以防止不需要的机械文物。

荧光显微镜对聚焦超声的刺激

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely ...

这种方法可以帮助回答机械生物学中的关键问题，例如生物样品如何对低强度超声波刺激产生的机械力作出反应。这项技术的主要优点是，它允许实验者将机械力无创地应用于样品，并实时测量各种生物周长。首先，使用垂直压钻在标准 35 毫米培养盘底部缓慢钻一个 12 毫米孔。钻孔后，用刀片取出贴在盘子底部的塑料片，在外侧形成光滑的表面。接下来，在盘子的外底面涂抹一层薄薄的海洋级环氧树脂或胶水。在粘合剂的顶部，放置一个2点5微米厚的聚酯薄膜，用力压紧，以确保胶粘剂均匀地在薄膜和厚塑料表面之间扩散。用手指以离心方式轻轻拉拉薄膜，形成平坦的表面。粘合剂干燥后，用95%乙醇短暂冲洗聚酯底盘。然后，紫外线消毒的菜，把它放在一个强大的254纳米紫外线激发源下。调整持续时间和强度，提供每平方厘米约330毫焦耳的紫外线剂量。接下来，用所需的培养基以1比100的比例稀释市售的细胞外基质蛋白混合物。在冰上工作，防止基质聚合，并迅速将100微升的介质混合物应用到聚酯薄膜上。将盖子放回盘子上，以保持无菌。一旦覆盖，孵育基质涂层，聚酯底部菜在细胞培养，二氧化碳缓冲孵化器在37摄氏度6至12小时。孵育后，吸进多余的介质，并在所需的密度下直接用细胞播种表面。将水箱放在直立显微镜的目标下方。然后，使用市售的视光机分量，将样品支架定位在目标和传感器之间。确保平移阶段的移动部件和执行器位于水箱外或水线上方，以避免水损坏。然后，在使用浸入式传感器之前，将浸气水加注到样品架的水平平面上。使用非腐蚀性、市售的视光剂元件，确保传感器在光学路径方面处于倾斜位置。这将确保任何反射波将定向远离样本。将功能发生器的频率调整为传感器的标称峰值频率。然后，使用功能发生器的突发模式，创建所需持续时间和重复频率的正弦电压脉冲。接下来，将峰值到峰值电压调整到所需的值。确保脉冲持续时间短于两个连续脉冲之间的经过时间。将功能发生器的输出连接到示波器的输入。使用示波器确认波形与所需信号相对应。然后，将功能发生器的输出连接到适当大小的射频放大器的功率输入。使用与超声波传感器兼容的频率范围和声学强度的液压听器探头，在样品位置的目标的视场内小心地将探针的尖端聚焦。确保探头和传感器都浸入水浴中，并直观地将其声轴定位到水听器探头，对传感器执行总预对齐。确保两者之间的距离对应于传感器的焦距。不要将水听器的尖端与水以外的任何物理物体碰撞，因为这将改变其涂层并影响测量。接下来，将水听器输出连接到示波器的信号输入之一。然后，将同步触发器从功能生成器连接到另一个示波器输入。在示波器上同时可视化两个信号。接下来，在低占空比和低振幅下驱动几个超声波循环的传感器，以避免损坏探头。请咨询水听器制造商的安全操作条件，以避免损坏水听器尖端。根据超声波从传感器表面到水听器的行驶时间调整 S 分旋旋钮。同步触发后，在示波器上查找水听器信号。接下来，使用电动或手动 XYZ 级缓慢启动传感器。将传感器定位到与最大水听器信号相关的位置。现在，当光束对齐时，测量示波器上水听器输出的峰峰值振幅，以处理驱动传感器的各种电压。确保不要超过水听器的压力限制。用含有5微摩尔的细胞渗透钙敏感染料（如氟-4 AM）所需的成像缓冲液替换细胞的培养基。然后，在37摄氏度的二氧化碳缓冲孵化器中孵育培养皿一小时。孵育后，用同样的无染料缓冲液小心清洗细胞。然后，将盘子放在样品架中。在 490 纳米的蓝光照明下激发细胞。调整激发强度和摄像机曝光，避免过度漂白或像素饱和。使用具有长工作距离的浸入式目标执行延时成像，提高图像质量，并减少不必要的反射。在这里，胶质母细胞在标准培养基的细胞外基质涂层聚酯薄膜上显示。这些细胞已经用钙敏荧光检测片孵育。在此图像中，红点表示使用图像处理软件识别的单个荧光细胞。在超声波刺激10秒后，在许多感兴趣的地区都显示强健的钙高程。随着时间的推移，此处显示了激活的感兴趣区域的数量。在超声波激活 10 秒后，发现大约 70% 的区域高于用户定义的阈值。在尝试此过程时，在进行荧光测量之前，必须记住对齐超声波束。

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