Name: multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Vi takker Drs. Mikhail Shapiro og Nikita Reznik for frugtbare drøftelser. Dette arbejde blev støttet af start-up midler fra Western University of Health Sciences og NIH give R21NS101384.

1. voksende celler på akustisk Transparent Polyester Film
<ol><li>Bore et 12 mm hul størrelse nederst på en standard 35 mm kultur parabol ved hjælp af en lodret tryk-boremaskine. Flytte boret langsomt og bære øjenbeskyttelse. Fjerne stykker plastik knyttet til bunden af skålen med en kniv til at skabe en glat overflade på den eksterne side (figur 2).</li>
	<li>Påfør et tyndt lag af marine-grade epoxy eller lim på eksterne bunden overfladen af fadet.</li>
	<li>Placer en folie af ...

<ol>
	<li>Elhelf, I. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+intensity+focused+ultrasound:+The+fundamentals,+clinical+applications+and+research+trends.">High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends.</a> Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).</li><li>Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , (2018).</li><li>Duck, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+and+non-medical+protection+standards+for+ultrasound+and+infrasound.">Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).</li><li>Legon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+focused+ultrasound+modulates+the+activity+of+primary+somatosensory+cortex+in+humans.">Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).</li><li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanobiology+of+brain+function.">The mechanobiology of brain function.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).</li><li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+neuromodulation+with+ultrasound?+A+continuum+mechanics+hypothesis.">Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis.</a> Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).</li><li>Tufail, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+pulsed+ultrasound+stimulates+intact+brain+circuits.">Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits.</a> Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).</li><li>Tyler, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+excitation+of+neuronal+circuits+using+low-intensity,+low-frequency+ultrasound.">Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound.</a> PloS One. 3 (10), e3511 (2008).</li><li>Suarez Castellanos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+ultrasound+stimulation+of+secretory+events+from+pancreatic+beta+cells.">Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells.</a> Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).</li><li>Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+Stimulation+of+Insulin+Release+from+Pancreatic+Beta+Cells+as+a+Potential+Novel+Treatment+for+Type+2+Diabetes.">Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).</li><li>Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonogenetics+is+a+non-invasive+approach+to+activating+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 6, 8264 (2015).</li><li>Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Piezo1+but+Not+NaV1.2+Channels+by+Ultrasound+at+43+MHz.">Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).</li><li>Kubanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+modulates+ion+channel+currents.">Ultrasound modulates ion channel currents.</a> Scientific Reports. 6, 24170 (2016).</li><li>Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+response+of+model+lipid+membranes+to+ultrasonic+radiation+force.">Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force.</a> PloS One. 8 (10), e77115 (2013).</li><li>Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic+Neuromodulation+Causes+Widespread+Cortical+Activation+via+an+Indirect+Auditory+Mechanism.">Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism.</a> Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).</li><li>O'Brien, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-biophysics+mechanisms.">Ultrasound-biophysics mechanisms.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corrigendum:+Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 8, 16148 (2017).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 3, 736 (2012).</li><li>Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+mechanisms+of+millimeter+wave+stimulation+of+excitable+cells.">Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells.</a> Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).</li><li>Hwang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+contactless+high+frequency+ultrasound+microbeam+stimulation+for+determination+of+invasion+potential+of+breast+cancer+cells.">Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).</li><li>Nakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+ratiometric+fluorescent+thermometer+with+wide+range+and+rapid+response.">Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response.</a> PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).</li><li>Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+intracellular+temperature+using+green+fluorescent+protein.">Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein.</a> Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).</li></ol>

Hovedfordelen ved fokuseret ultralyd er dens evne til at levere ikke-invasivt mekaniske og/eller termisk energi til biologiske prøver med høje spatio-temporale præcision. Andre teknikker til fremme af mekanisk celler normalt beskæftiger invasive fysiske sonder (f.eks. celle-Rode) eller kræver et samspil mellem høj energi laser bjælker med fremmedlegemer (fx Optisk pincet). Opvarmning kan varme specifikke geografiske steder inde i biologiske prøver men kræver tilstedeværelse af udenlandske magn...

Mange sygdomme kræver en form for invasive indgreb. Disse procedurer er ofte dyre, risikabelt, kræver fredninger og dermed tilføje en byrde på sundhedssystemerne. Non-invasiv terapeutiske metoder har potentiale til at skabe sikrere og billigere alternativer til konventionelle kirurgiske procedurer. Nuværende ikke-invasive metoder såsom Farmakoterapi eller transkranial magnetisk stimulation er dog ofte begrænset af afvejninger mellem væv penetration, spatiotemporelle opløsning og uønskede virkninger, off-målet. I denne sammenhæng en fokuseret ultralyd udgør en lovende non-invasiv teknologi med potentiale til at manipulere biologiske funktioner dybt inde i væv med stor spatiotemporelle nøjagtighed og begrænset ud-target effekter.
Fokuseret ultralyd stimulering består af levere akustisk energi på præcise steder dybt inde i levende organismer. Afhængigt af akustiske puls parametre, kan denne energi har en bred vifte af medicinske anvendelser. For eksempel, har Food and Drug Administration godkendt brugen af høj intensitet fokuseret ultralyd (HiFU) for termisk ablation af prostata tumorer, tremor-forårsager hjerneregioner, uterine fibromer og smerte-fremkaldende nerveender i knoglemetastaser1 . HiFu-medieret microbubble kavitation bruges også til forbigående åbne blod - hjerne barrieren for målrettet levering af systemisk administreres therapeutics2. Rumlige-peak pulse-gennemsnitlig intensitet (jegsppa) og rumlige-peak tidsmæssige-gennemsnitlig intensitet (jegspta) anvendes til HiFU applikationer er typisk over flere kW cm-2 og producere puls pres af flere snese MPa. Disse intensitetsværdierne er langt over den FDA-godkendt Isppa og jegspta grænser for diagnostisk ultralyd, 190 W cm-2 og 720 mW cm-2, henholdsvis3. Derimod har nylige undersøgelser vist, at ikke-destruktiv pulserende ultralyd stimulation, der er inden for eller i nærheden af rækken af diagnostisk ultralyd intensitet grænser (LIPUS) kan være effektiv til at fjernstyre og sikkert manipulere neurale fyring4, 5,6,7,8, hormonal sekretion9,10 og bioengineered celler11. Men, af cellulære og molekylære mekanismer som celler fornemme og reagere på ultralyd forbliver uklart, udelukker kliniske oversættelse af LIPUS. Derfor, i de seneste år, undersøgelser af kunstige membraner, dyrkede celler og dyr stimuleret med ultralyd har opnået momentum til at afsløre biofysiske og fysiologiske processer moduleres af LIPUS12,13, 14,15.
Lyd består af en vibration formerings gennem et fysisk medie. Ultralyd er en lyd med frekvenser over det menneskelige hørbare område (dvs. over 20 kHz). I et laboratorium indstilling fremstilles ultralyd bølger generelt af piezoelektriske transducere, der indeholder et materiale, der vibrerer som svar på et elektrisk felt oscillerende i en specifik højfrekvente båndbredde. Der findes to typer af transducere: enkelt element transducere og transducer arrays. Enkelt element piezoelektriske transducere besidder en buet overflade, der fungerer som et fokus linse og derfor koncentrerer akustisk energi i et defineret område kaldet zonen omdrejningspunkt. Enkelt element transducere er meget billigere og nemmere at betjene end transducer arrays. Denne artikel vil fokusere på enkelt element transducere.
Størrelsen af den fokale zone af en fokuseret enkelt element transducer afhænger af de geometriske egenskaber af den akustiske linse og sin akustiske frekvens. For at opnå en millimeter-størrelse fokale zone med et enkelt element transducer, er ultralyd frekvenser i området MHz generelt kræves. Akustiske bølger på sådan hyppighed er desværre meget hurtigt svækket når formeret i en svag medium som luft. Således skal MHz ultralyd bølger genereret og overføres til prøven i et mere fintmasket materiale såsom vand. Dette er den første udfordring i at integrere LIPUS modalitet til et mikroskop.
En anden udfordring er at minimere fysiske grænseflader mellem materialer med forskellige akustiske impedances, (som er et produkt af materielle tæthed og den akustiske hastighed) langs stien akustisk. Disse grænseflader kan afspejle, bryder, scatter og absorbere akustiske bølger, hvilket gør det vanskeligt at kvantificere mængden af akustisk energi effektivt leveret til en prøve. De kan også oprette uønsket mekaniske artefakter. For eksempel, skabe refleksioner producerede vinkelret på akustiske uoverensstemmelse impedans grænseflader backpropagating bølger, der interfererer med fremad-formerings ones. Langs stien indblanding annullere bølgerne hinanden på faste områder af rum kaldet noder og summen op på skiftevis regioner kaldet anti-noder, oprettelse af såkaldte stående bølger (figur 1). Det er vigtigt for experimentalist at kontrollere eller fjerne disse eksperimentelle grænseflader in vitro , som de ikke måske eksisterer in vivo.
Fluorescens målingen af optiske journalister er en velkendt metode til at afhøre gennemsigtig biologiske prøver i realtid og med ingen fysiske forstyrrelser. Denne tilgang er dermed ideel til LIPUS undersøgelser som enhver fysisk sonder til stede i området sonicated vil indføre mekanisk artefakter. Denne protokol beskriver gennemførelsen og driften af LIPUS til en kommerciel epi-fluorescens mikroskop.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CERNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>SliceScope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optomechanical components</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HFO series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>DSOX2004A (4-channels 70MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>function generator</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>33500B (20MHz single-channel)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronic Navigation Industries (ENI)</td>
			<td rowspan="2">325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronics &#38; Innovation (E&#38;I)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>focused immersion transdcuers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Benthowave Instrument</td>
			<td>HiFu transducer BII-76 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>Piezo-ceramic or HiFu transducers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Ultrasonic-S-lab</td>
			<td>HiFu transducers made to order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-density Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>VWR 80094-330</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar film 2.5 microns</td>
			<td>Chemplex</td>
			<td>CAT.NO:107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy

Ved at fokusere lavintensive ultralyd pulser, at trænge ind i bløde væv, repræsenterer LIPUS en lovende biomedicinsk teknologi til at fjernstyre og sikkert manipulere neurale fyring, hormonal sekretion og genetisk omprogrammerede celler. Imidlertid er oversættelse af denne teknologi til medicinske applikationer i øjeblikket hæmmet af en mangel på biofysiske mekanismer som målrettet væv følelse og reagere på LIPUS. En egnet metode til at identificere disse mekanismer ville være at bruge optisk biosensorer i kombination med LIPUS til at bestemme underliggende signaling veje. Imidlertid kan gennemføre LIPUS til et fluorescens mikroskop indføre uønsket mekaniske artefakter på grund af tilstedeværelsen af fysiske grænseflader, der afspejler, absorbere og bryder akustiske bølger. Denne artikel præsenterer en trinvis procedure for at indarbejde LIPUS til kommercielt tilgængelige oprejst epi-fluorescens mikroskoper og minimere påvirkning af fysiske grænseflader langs stien akustisk. En simpel procedure er beskrevet til at operere et enkelt element ultralyd transducer og at bringe den centrale zone af transduceren i den objektive omdrejningspunkt. Brugen af LIPUS er illustreret med et eksempel på LIPUS-induceret calcium transienter i kulturperler menneskelige glioblastom celler målt ved hjælp af calcium billeddannelse.

Figur 5 er et eksempel på LIPUS eksperiment multipleksede med calcium billeddannelse. Glioblastom celler (A-172) blev dyrket på EMPM belagt polyester film i standard næringssubstratet (suppleret med 10% serum og 1% antibiotika) og inkuberes med calcium-følsomme fluorescerende reporter Fluo-4 AM. Celler var afbildet ved hjælp af en 10 X fordybelse linse og belyst med en hvid LED lyskilde og fluorescens lys blev indsamlet ved hjælp af en standard normal g...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy

Lav intensitet pulserende ultralyd Stimulation (LIPUS) er en modalitet for non-invasiv mekaniske stimulation af endogene eller manipulerede celler med høj rumlige og tidsmæssige opløsning. Denne artikel beskriver, hvordan man gennemfører LIPUS til en epi-fluorescens mikroskop og hvor hen til bagatellisere akustisk impedans uoverensstemmelse langs stien ultralyd til at forhindre uønsket mekaniske artefakter.

Multiplexing fokuseret ultralyd Stimulation med Fluorescens mikroskopi

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i mekanobiologi, såsom hvordan biologiske prøver reagerer på mekaniske kræfter produceret af lav intensitet ultralydstimulation. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver en experimentalist til noninvasively anvende mekaniske kræfter til en prøve og måle forskellige biologiske omkreds i realtime. Til at begynde, langsomt bore en 12 millimeter hul i bunden af en standard 35 millimeter kultur parabol ved hjælp af en lodret tryk boremaskine.Når boret, fjerne stykker af plast fastgjort til bunden af skålen ved hjælp af en klinge, for at skabe en glat overflade på den ydre side. Dernæst anvende et tyndt lag af marine-grade epoxy eller lim på den udvendige bundoverflade af skålen. På toppen af limen, placere en to-punkts-fem-mikron tyk film af polyester, trykke fast for at sikre limen spreder jævnt mellem filmen og den tykke plastoverflade.Træk forsigtigt filmen i en centrifugal måde med fingrene, for at skabe en flad overflade. Når limen er tørret, skylles polyesterbundskålen kortvarigt med 95% ethanol. Derefter, UV sterilisere skålen ved at placere den under en stærk 254 nanometer UV excitation kilde.Juster varighed og intensitet for at levere en UV-dosis på ca. 330 millijoule pr. kvadratcentimeter. Dernæst fortyndes en kommercielt tilgængelig ekstracellulær matrix protein blanding med det ønskede kultur medium i et forhold på en til 100. Arbejde på is for at forhindre matrix polymerisering, og hurtigt anvende 100 mikroliter af medium blandingen på polyester film.Læg låget tilbage på skålen for at bevare steriliteten. Når dækket, inkubere matrix-belagt, polyester bund retter i en celle kultur, kuldioxid-buffered inkubator ved 37 grader Celsius i seks til 12 timer. Efter inkubation, aspirere det overskydende medium og direkte frø overfladen med celler på den ønskede tæthed.Placer en vandtank under målet om et opretstående mikroskop. Ved hjælp af kommercielt tilgængelige optomekaniske komponenter skal prøveholderen derefter placeres mellem målet og transduceren. Sørg for, at de bevægelige dele og aktuatorerne i oversættelsesfasen er enten uden for tanken eller over vandledningen for at undgå vandskader.Derefter fyldes tanken med deioniseret og afgasset vand op til prøveholderens vandrette plan, før prøven anvendes, før nedsænkningstransduceren udnyttes. Ved hjælp af ikke-korrektive, kommercielt tilgængelige optomekaniske komponenter skal du sørge for, at transduceren er i en skrå position med hensyn til den optiske bane. Dette vil sikre, at eventuelle reflekterede bølger vil blive dirigeret væk fra prøven.Juster frekvensen af funktionsgeneratoren til transducerens nominelle topfrekvens. Derefter oprette en sinusformet spænding puls af den ønskede varighed og gentagelse frekvens, ved hjælp af burst mode af funktionen generator. Juster derefter top-til-top spænding til en ønsket værdi.Sørg for, at pulsens varighed er kortere end den forløbne tid mellem to på hinanden følgende impulser. Tilslut funktionsgeneratorens udgang til input fra et oscilloskop. Brug oscilloskopet til at bekræfte, at bølgeformen svarer til det ønskede signal.Tilslut derefter funktionsgeneratorens udgang til indgangen af en effekt af en RF-forstærker i korrekt størrelse. Ved hjælp af en hydrofonsonde, der fungerer med et frekvensområde og akustisk intensitet, der er kompatibelt med ultralydstransducerens, skal sondens spids forsigtigt bringes i fokus inden for målets synsfelt ved prøvens placering. Sørg for, at både sonde og transducer er nedsænket i vandbadet og udføre en grov forjustering af transduceren ved visuelt at placere sin akustiske akse mod hydrofonsonden.Sørg for, at afstanden mellem de to svarer til transducerens brændvidde. Du må ikke støde spidsen af hydrofonen med andre fysiske genstande end vand, da dette vil ændre belægningen og påvirke målingen. Tilslut derefter hydrofonudgangen til en af oscilloskopets signalindgang.Tilslut derefter synkroniseringsudløseren fra funktionsgeneratoren til en anden oscilloskopindgang. Visualiser begge signaler samtidigt på oscilloskopet. Kør derefter transduceren med få ultralydscyklusser ved en lav arbejdscyklus og lav amplitude for at undgå at beskadige sonden.Kontroller hydrofonens producent sikre driftsforhold for at undgå at beskadige hydrofonspidsen. Juster S-divisionen i henhold til ultralydens rejsetid fra transducerens overflade til hydrofonen. Kig efter et hydrofonsignal på svingilloskopet efter synkroniseringsudløseren.Dernæst langsomt aktivere transduceren ved hjælp af en motoriseret eller manuel XYZ fase. Anbring transduceren i den position, der korrelerer med det maksimale hydrofonsignal. Med strålen nu justeret, måle peak-to-peak amplitude af hydrofon output ved oscilloskopet for forskellige spændinger, der driver transduceren.Sørg for ikke at overskride trykgrænsen for hydrofonen. Udskift cellens kulturmedium med den ønskede billedbuffer, der indeholder fem mikromolar af et cellepermeant, calciumfølsomt farvestof, såsom Fluo-4 AM. Derefter inkuberes kulturskålen i en co2-buffered inkubator ved 37 grader Celsius i en time. Efter inkubation, omhyggeligt vaske celler med samme buffer fri for farvestof.Sæt derefter skålen i prøveholderen. Lyndring cellerne ved hjælp af blåt lys belysning på 490 nanometer. Juster excitationsintensiteten og kameraets eksponering for at undgå overdreven blegning eller pixelmætning.Udfør time-lapse-billedbehandling ved hjælp af en nedsænkningsmål med en lang arbejdsafstand for bedre billedkvalitet og for at reducere uønskede refleksioner. Her vises glioblastomaceller på ekstracellulær matrixbelagt polyesterfilm i standardkulturmedium. Disse celler er blevet inkuberet med en calcium-følsomme fluorescerende reporter.I dette billede repræsenterer de røde prikker individuelle lysstofrør, der er identificeret ved hjælp af en billedbehandlingssoftware. Ved stimulering i 10 sekunder med ultralyd blev robuste calciumhøjder visualiseret i mange områder af interesse. Antallet af aktiverede områder af interesse vises her over tid.Efter 10-sekunders aktivering med ultralyd, ca 70% af regionerne blev anset for at være over brugerdefinerede tærskelværdier. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at tilpasse ultralydstrålen, før du laver fluorescensmåling.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Engineering

Unit 1

Sound

SCIENTISTS IN ACTION

Synthesis of Phase-shift Nanoemulsions with Narrow Size Distributions for Acoustic Droplet Vaporization and Bubble-enhanced Ultrasound-mediated Ablation

Syntese af Phase-shift nanoemulsions med smalle størrelse distributioner til Akustisk Droplet fordampning og Bubble-forstærket Ultralyd-medieret Ablation

High-intensity  focused ultrasound (HIFU) is used clinically to thermally ablate tumors. To  enhance localized heating and improve thermal ablation in ...

Time Multiplexing Super Resolving Technique for Imaging from a Moving Platform

Time Multiplexing Super Løsning Teknik for Imaging fra en kørende Platform

We propose a method for increasing the resolution of an object and overcoming the diffraction limit of an optical system installed on top of a moving ...

Fabrication of Gate-tunable Graphene Devices for Scanning Tunneling Microscopy Studies with Coulomb Impurities

Fremstilling af Gate-afstemmelige Graphene Devices for Scanning Tunneling Mikroskopi Undersøgelser med Coulomb urenheder

Owing to its relativistic low-energy charge carriers, the interaction between graphene and various impurities leads to a wealth of new physics and degrees ...

Ohmic Contact Fabrication Using a Focused-ion Beam Technique and Electrical Characterization for Layer Semiconductor Nanostructures

Ohmsk Kontakt Fabrication Ved hjælp af en Fokuseret-ion Beam Teknik og elektrisk karakterisering for Layer Semiconductor nanostrukturer

Layer semiconductors with easily processed two-dimensional (2D) structures exhibit indirect-to-direct bandgap transitions and superior transistor ...

In Depth Analyses of LEDs by a Combination of X-ray Computed Tomography (CT) and Light Microscopy (LM) Correlated with Scanning Electron Microscopy (SEM)

In Depth Analyses of LEDs by a Combination of X-ray Computed Tomography CT and Light Microscopy LM Correlated with Scanning Electron Microscopy SEM

I Dybde Analyser af lysdioder ved en kombination af X-ray Computed Tomography (CT) og Light Microscopy (LM) korreleret med Scanning Electron Microscopy (SEM)

In failure analysis, device characterization and reverse engineering of light emitting diodes (LEDs), and similar electronic components of ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Sub-nanometer Resolution Imaging med Amplitude-modulation Atomic force mikroskopi i Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Focused Ion Beam Fabrication of LiPON-based Solid-state Lithium-ion Nanobatteries for In Situ Testing

Focused Ion Beam Fabrication of LiPON-based Solid-state Lithium-ion Nanobatteries for In Situ Testing

Fokuseret Ion Beam fabrikation af LiPON-baseret Solid-state Lithium-ion Nanobatteries til In Situ test

Solid-state electrolytes are a promising replacement for current organic liquid electrolytes, enabling higher energy densities and improved safety of ...

Three-Dimensional Ultrasonic Needle Tip Tracking with a Fiber-Optic Ultrasound Receiver

Tre-dimensionelle ultralyd nål Tip sporing med en Fiber-optisk ultralyd modtager

Ultrasound is frequently used for guiding minimally invasive procedures, but visualizing medical devices is often challenging with this imaging modality. ...

Controllable Nucleation of Cavitation from Plasmonic Gold Nanoparticles for Enhancing High Intensity Focused Ultrasound Applications

Styrbar Nukleering af kavitation fra Plasmonic guld nanopartikler til forbedring af høj intensitet fokuseret ultralyd applikationer

In this study, plasmonic gold nanoparticles were simultaneously exposed to pulsed near-infrared laser light and high intensity focused ultrasound (HIFU) ...