Name: multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Wij danken Drs. Mikhail Shapiro en Nikita Reznik voor vruchtbare discussies. Dit werk werd gesteund door start-up fondsen van Western University of Health Sciences en NIH grant R21NS101384.

1. groeiende cellen op akoestisch transparant Polyester Film
<ol><li>De grootte van een 12 mm gat aan de onderkant van een standaard 35 mm cultuur schotel met behulp van een verticale pers-boor boor. De boor langzaam en Oogbescherming dragen. Verwijderen van stukken van plastiek gekoppeld aan de onderkant van de schotel een mes gebruiken voor het maken van een glad oppervlak aan de externe zijde (Figuur 2).</li>
	<li>Breng een dunne laag van de marine-grade epoxy of lijm aan de oppervlakte...

<ol>
	<li>Elhelf, I. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+intensity+focused+ultrasound:+The+fundamentals,+clinical+applications+and+research+trends.">High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends.</a> Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).</li><li>Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , (2018).</li><li>Duck, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+and+non-medical+protection+standards+for+ultrasound+and+infrasound.">Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).</li><li>Legon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+focused+ultrasound+modulates+the+activity+of+primary+somatosensory+cortex+in+humans.">Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).</li><li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanobiology+of+brain+function.">The mechanobiology of brain function.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).</li><li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+neuromodulation+with+ultrasound?+A+continuum+mechanics+hypothesis.">Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis.</a> Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).</li><li>Tufail, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+pulsed+ultrasound+stimulates+intact+brain+circuits.">Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits.</a> Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).</li><li>Tyler, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+excitation+of+neuronal+circuits+using+low-intensity,+low-frequency+ultrasound.">Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound.</a> PloS One. 3 (10), e3511 (2008).</li><li>Suarez Castellanos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+ultrasound+stimulation+of+secretory+events+from+pancreatic+beta+cells.">Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells.</a> Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).</li><li>Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+Stimulation+of+Insulin+Release+from+Pancreatic+Beta+Cells+as+a+Potential+Novel+Treatment+for+Type+2+Diabetes.">Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).</li><li>Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonogenetics+is+a+non-invasive+approach+to+activating+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 6, 8264 (2015).</li><li>Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Piezo1+but+Not+NaV1.2+Channels+by+Ultrasound+at+43+MHz.">Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).</li><li>Kubanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+modulates+ion+channel+currents.">Ultrasound modulates ion channel currents.</a> Scientific Reports. 6, 24170 (2016).</li><li>Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+response+of+model+lipid+membranes+to+ultrasonic+radiation+force.">Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force.</a> PloS One. 8 (10), e77115 (2013).</li><li>Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic+Neuromodulation+Causes+Widespread+Cortical+Activation+via+an+Indirect+Auditory+Mechanism.">Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism.</a> Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).</li><li>O'Brien, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-biophysics+mechanisms.">Ultrasound-biophysics mechanisms.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corrigendum:+Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 8, 16148 (2017).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 3, 736 (2012).</li><li>Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+mechanisms+of+millimeter+wave+stimulation+of+excitable+cells.">Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells.</a> Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).</li><li>Hwang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+contactless+high+frequency+ultrasound+microbeam+stimulation+for+determination+of+invasion+potential+of+breast+cancer+cells.">Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).</li><li>Nakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+ratiometric+fluorescent+thermometer+with+wide+range+and+rapid+response.">Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response.</a> PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).</li><li>Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+intracellular+temperature+using+green+fluorescent+protein.">Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein.</a> Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).</li></ol>

Een grote voordeel van geconcentreerd ultrageluid is haar vermogen om te leveren niet-gebeurt mechanisch en/of thermische energie aan biologische monsters met een hoge spatio-temporele precisie. Andere technieken die mechanisch stimuleren cellen meestal dienst invasieve fysische sondes (bijvoorbeeld cel-prikken) of de interactie van energierijke laserstralen met vreemde voorwerpen (bijvoorbeeld optisch pincet) vereist. Magnetische verwarming kan verhitten specifieke ruimtelijke locaties binnen biologisc...

Veel ziekten vereist enige vorm van invasieve medische interventie. Deze procedures zijn vaak duur en riskant en vereisen herstel periodes dus het toevoegen van een last aan stelsels voor gezondheidszorg. Niet-invasieve therapeutische modaliteiten hebben het potentieel om veiligere en goedkopere alternatieven voor conventionele chirurgische ingrepen. Huidige niet-invasieve benaderingen zoals farmacotherapie of Transcraniële magnetische stimulatie zijn echter vaak beperkt door afwegingen tussen weefsel penetratie, Spatio resolutie en ongewenste effecten van de af-target. In dit verband vormt een gerichte echografie een veelbelovende niet-invasieve technologie met het potentieel om te manipuleren van de biologische functies diep in de weefsels met hoge Spatio nauwkeurigheid en beperkte af-target effecten.
Gerichte echografie stimulatie bestaat uit het leveren van akoestische energie op exacte locaties diep in levende organismen. Afhankelijk van de akoestische pulse parameters, kan deze energie hebben een verscheidenheid van medische toepassingen. Bijvoorbeeld, heeft de Food and Drug Administration het gebruik van High-intensity geconcentreerd ultrageluid (HiFU) goedgekeurd voor thermische ablatie van tumoren van de prostaat, tremor-veroorzakende hersengebieden, uteriene vleesbomen en zenuwuiteinden pijn veroorzaakt in de botmetastasen1 . HiFu-gemedieerde microbubble cavitatie wordt ook gebruikt voor Transient openen de bloed - hersen barrière voor de beoogde levering van systemisch bestuurde therapeutics2. De ruimtelijke-piek pulse-gemiddelde intensiteit (Isppa) en de ruimtelijke-piek temporele-gemiddelde intensiteit (iknieuwsagentschap) gebruikt voor HiFU toepassingen zijn meestal boven verschillende kW cm-2 en produceren pulse druk van enkele tientallen MPa. Deze intensiteitswaarden zijn ver boven de FDA-goedgekeurde iksppa en iknieuwsagentschap limieten voor diagnostische echografie, 190 W cm-2 en 720 mW cm-2, respectievelijk3. In tegenstelling, hebben recente studies aangetoond dat niet-destructieve gepulseerde echografie stimulatie die binnen of in de buurt van het bereik van de plafonds voor de intensiteit diagnostische echografie (LIPUS) kan worden effectief te ver en veilig manipuleren neurale afvuren4, 5,6,7,8, hormonale secretie9,10 en bioengineered cellen11. Toch zijn de cellulaire en moleculaire mechanismen waarmee cellen voelen en reageren op echografie nog steeds onduidelijk, uitschakeling van klinische vertaling van LIPUS. Vandaar, in de afgelopen jaren onderzoek naar kunstmatige membranen, gekweekte cellen en dieren gestimuleerd met echografie hebben een stroomversnelling te onthullen biofysische en fysiologische processen gemoduleerd door LIPUS12,13, 14,,15.
Geluid bestaat uit een trilling teeltmateriaal via een fysiek medium. Een echografie is een geluid met een frequentie hoger dan de mens hoorbare bereik (i.e., boven 20 kHz). In de omgeving van een laboratorium, zijn ultrasone golven over het algemeen geproduceerd door piëzo-elektrische omvormers die bevatten een materiaal dat naar aanleiding van een elektrisch veld oscillerende in een specifieke bandbreedte van hoge-frequentie trilt. Er bestaan twee soorten omvormers: één element transducers en transducer matrices. Piëzo-elektrische omvormers van één element bezitten een gebogen oppervlak dat fungeert als een focus lens en vandaar concentreert akoestische energie in een bepaald gebied genaamd de focale zone. Enkel element omvormers zijn veel goedkoper en gemakkelijker te bedienen dan transducer matrices. Dit artikel zal zich richten op één element omvormers.
De grootte van de focale zone van een gerichte enkel element transducer hangt af van de geometrische eigenschappen van de akoestische lens en de akoestische frequentie. Om te bereiken een focale millimeter-grootte-zone met een enkel element transducer, zijn ultrasone frequenties in het bereik MHz in het algemeen vereist. Akoestische golven op deze frequentie zijn helaas zeer snel verzwakt wanneer doorgegeven in een ijle medium zoals lucht. Aldus, moeten MHz ultrasone golven worden gegenereerd en doorgegeven aan het monster in een dichtere materiaal zoals water. Dit is de eerste uitdaging bij de integratie van de LIPUS modaliteit aan een microscoop.
Een tweede uitdaging is om te minimaliseren van de fysieke interfaces tussen materialen met verschillende akoestische impedances (dat is een product van materiële dichtheid en de akoestische snelheid) langs het akoestische pad. Deze interfaces kunnen reflecteren, breken, scatter en absorberen van akoestische golven, waardoor het moeilijk te kwantificeren van het bedrag van akoestische energie effectief geleverd aan een monster. Ze kunnen ook ongewenste mechanische artefacten maken. Bijvoorbeeld, maken reflecties geproduceerde loodrecht op akoestische mismatch impedantie interfaces backpropagating golven die met vooruit-teeltmateriaal ones interfereren. De storing weg annuleren de golven elkaar op vaste regio's van ruimten genaamd knooppunten en samengevat op afwisselende regio's anti-knooppunten, creëren van zogenaamde staande golven (Figuur 1). Het is belangrijk voor de Vejle te kunnen beheren of elimineren van deze experimentele interfaces in vitro als ze niet in vivo bestaat.
Meting van de fluorescentie van optische verslaggevers is een bekende methode om te ondervragen transparante biologische monsters in real-time en met geen fysieke storingen. Deze aanpak is dus ideaal voor LIPUS studies zoals elke fysieke sondes aanwezig in het sonicated gebied mechanische artefacten introduceren zal. Dit protocol beschrijft de uitvoering en de werking van LIPUS naar een commerciële epi-fluorescentie Microscoop.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CERNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>SliceScope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optomechanical components</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HFO series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>DSOX2004A (4-channels 70MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>function generator</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>33500B (20MHz single-channel)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronic Navigation Industries (ENI)</td>
			<td rowspan="2">325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronics &#38; Innovation (E&#38;I)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>focused immersion transdcuers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Benthowave Instrument</td>
			<td>HiFu transducer BII-76 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>Piezo-ceramic or HiFu transducers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Ultrasonic-S-lab</td>
			<td>HiFu transducers made to order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-density Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>VWR 80094-330</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar film 2.5 microns</td>
			<td>Chemplex</td>
			<td>CAT.NO:107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy

Door zich te concentreren in lage-intensiteit ultrageluid pulsen die doordringen van de zachte weefsels, vertegenwoordigt LIPUS een veelbelovende biomedische technologie voor het op afstand en veilig manipuleren neurale afvuren, hormonale secretie en genetisch geherprogrammeerd cellen. Echter wordt de vertaling van deze technologie voor medische toepassingen momenteel gehinderd door een gebrek aan biofysische mechanismen waarmee gericht weefsels gevoel en te reageren op LIPUS. Een geschikte benadering voor het identificeren van deze mechanismen zou moeten gebruiken van optische biosensoren in combinatie met LIPUS om te bepalen onderliggende signaalroutes. Echter, de LIPUS tot en met een fluorescentie Microscoop kan leiden tot ongewenste mechanische artefacten als gevolg van de aanwezigheid van fysieke interfaces die weerspiegelen, absorberen en akoestische golven breken. Dit artikel bevat een stapsgewijze procedure om op te nemen LIPUS aan verkrijgbare rechtop epi-fluorescentie microscopen terwijl het minimaliseren van de invloed van fysieke interfaces de akoestische weg. Een eenvoudige procedure is beschreven te bedienen een transducer één element echografie en voldoen aan de focale zone van de transducer brengen het objectieve focal point. Het gebruik van LIPUS is geïllustreerd met een voorbeeld van LIPUS-geïnduceerde calcium transiënten in gekweekte menselijke glioblastoma cellen gemeten met behulp van calcium imaging.

Figuur 5 is een voorbeeld van LIPUS experiment multiplexed met calcium beeldvorming. Glioblastoma cellen (A-172) werden geteeld op EMPM gecoat polyester film in standaard kweekmedium (aangevuld met 10% serum en 1% antibiotica) en geïncubeerd met de calcium-gevoelige fluorescerende verslaggever Fluo-4 AM. Cellen werden beeld met behulp van een 10 X onderdompeling lens en verlicht met een witte LED lichtbron en fluorescentie licht werd verzameld met behulp van...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy

Low-Intensity Pulsed echografie stimulatie (LIPUS) is een modaliteit voor niet-invasieve mechanische stimulatie van endogene of gemanipuleerde cellen met hoge ruimtelijke en temporele resolutie. In dit artikel wordt beschreven hoe implementeren van LIPUS om een epi-fluorescentie Microscoop en minimaliseren van akoestische impedantie mismatch langs het pad van de echografie om te voorkomen dat ongewenste mechanische artefacten.

Multiplexing gericht echografie stimulatie met fluorescentie microscopie

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de mechanobiologie, zoals hoe biologische monsters reageren op mechanische krachten geproduceerd door lage intensiteit echografie stimulatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een experimentalist in staat stelt om niet-invasief mechanische krachten toe te passen op een monster en verschillende biologische omtrek in realtime te meten. Om te beginnen, langzaam boren een 12 millimeter gat aan de onderkant van een standaard 35 millimeter cultuur schotel met behulp van een verticale pers boor.Eenmaal geboord, verwijder stukken plastic bevestigd aan de onderkant van de schotel met behulp van een mes, om een glad oppervlak aan de externe kant te creëren. Breng vervolgens een dunne laag van mariene kwaliteit epoxy of lijm aan op het externe onderste oppervlak van de schotel. Op de top van de lijm, plaats een twee-punt-vijf-micron dikke film van polyester, stevig te drukken om ervoor te zorgen dat de lijm gelijkmatig verspreidt tussen de film en het dikke plastic oppervlak.Trek de film voorzichtig op een centrifugale manier met vingers, om een plat oppervlak te creëren. Zodra de lijm is gedroogd, kort spoelen van de polyester bodem schotel met 95%ethanol. Vervolgens steriliseren UV de schotel door deze onder een sterke 254 nanometer UV-excitatiebron te plaatsen.Pas de duur en intensiteit aan om een UV-dosis van ongeveer 330 millijoule per vierkante centimeter te leveren. Verdun vervolgens een commercieel verkrijgbaar extracellulair matrix-eiwitmengsel met het gewenste kweekmedium met een verhouding van één tot 100. Werk aan ijs om matrixpolymerisatie te voorkomen en breng snel 100 microliter van het mediummengsel aan op de polyesterfolie.Plaats het deksel terug op de schotel om steriliteit te behouden. Eenmaal bedekt, incubeer de matrix-gecoate, polyester bodem schotels in een cel cultuur, kooldioxide-gebufferde incubator op 37 graden Celsius voor zes tot 12 uur. Na incubatie, aspirate het overtollige medium en direct zaad van het oppervlak met cellen op de gewenste dichtheid.Plaats een watertank onder het doel van een rechtopstaande microscoop. Positioneer vervolgens, met behulp van commercieel verkrijgbaar optomechanische componenten, de monsterhouder tussen de doelstelling en de transducer. Zorg ervoor dat de bewegende delen en de actuatoren van de vertaalfases zich buiten de tank of boven de waterleiding bevinden om waterschade te voorkomen.Vul vervolgens de tank met gedeïoniseerd en ontgast water tot aan het horizontale vlak van de monsterhouder, voordat u de onderdompelingstransducer gebruikt. Met behulp van niet-corrosieve, commercieel verkrijgbare optomechanische componenten, zorg ervoor dat de transducer in een schuine positie ten opzichte van het optische pad. Dit zal ervoor zorgen dat alle gereflecteerde golven zal worden weggeleid van het monster.Pas de frequentie van de functiegenerator aan op de nominale piekfrequentie van de transducer. Maak vervolgens een sinusoïdale spanningspuls van de gewenste duur en herhalingsfrequentie, met behulp van de burst-modus van de functiegenerator. Pas vervolgens piek-naar-piekspanning aan op een gewenste waarde.Zorg ervoor dat de pulsduur korter is dan de verstreken tijd tussen twee opeenvolgende pulsen. Sluit de output van de functiegenerator aan op de ingang van een oscilloscoop. Gebruik de oscilloscoop om te bevestigen dat de golfvorm overeenkomt met het gewenste signaal.Sluit vervolgens de output van de functiegenerator aan op de ingang van een vermogen van een goed formaat RF-versterker. Met behulp van een hydrofoonsonde die werkt met een frequentiebereik en akoestische intensiteit die compatibel zijn met die van de ultrasone transducer, breng de tip van de sonde voorzichtig in beeld binnen het gezichtsveld van de doelstelling op de positie van het monster. Zorg ervoor dat zowel de sonde als de transducer in het waterbad worden ondergedompeld en een grove vooruitlijning van de transducer uitvoeren door de akoestische as visueel in de richting van de hydrofoonsonde te positioneren.Zorg ervoor dat de afstand tussen de twee overeenkomt met de brandpuntsafstand van de transducer. Stoot de punt van de hydrofoon niet met een ander fysiek voorwerp dan water, omdat dit de coating zal veranderen en de meting zal beïnvloeden. Sluit vervolgens de hydrofoonuitgang aan op een signaalingang van de oscilloscoop.Sluit vervolgens de synchronisatietrigger van de functiegenerator aan op een andere oscilloscoopingang. Visualiseer beide signalen tegelijkertijd op de oscilloscoop. Vervolgens drijft u de transducer met weinig ultrasone cycli bij een lage cyclus en lage amplitude om beschadiging van de sonde te voorkomen.Neem contact op met de fabrikant van de hydrofoon veilige werking voorwaarden om te voorkomen dat beschadiging van de hydrofoon tip. Pas de S-divisieknop aan op basis van de reistijd van de echografie van het oppervlak van de transducer naar de hydrofoon. Zoek naar een hydrofoonsignaal op de oscilloscoop na de synchronisatietrigger.Vervolgens werkt u de transducer langzaam aan met behulp van een gemotoriseerde of handmatige XYZ-fase. Plaats de transducer in de positie die correleert met het maximale hydrofoonsignaal. Met de bundel nu uitgelijnd, meet de piek-tot-piek amplitude van de hydrofoon uitgang op de oscilloscoop voor verschillende spanningen rijden de transducer.Zorg ervoor dat u de druklimiet van de hydrofoon niet overschrijdt. Vervang het kweekmedium van de cel door de gewenste beeldvormingsbuffer met vijf micromolar van een cel-permeant, calciumgevoelige kleurstof, zoals Fluo-4 AM. Vervolgens, inculbateren de cultuur schotel in een kooldioxide-gebufferde incubator op 37 graden Celsius voor een uur. Na incubatie, zorgvuldig wassen cellen met dezelfde buffer vrij van kleurstof.Plaats vervolgens de schotel in de monsterhouder. Prikkel de cellen met behulp van blauw licht verlichting op 490 nanometer. Pas de excitatieintensiteit en camerablootstelling aan om overmatige bleeking of pixelverzadiging te voorkomen.Voer time-lapse imaging uit met behulp van een onderdompelingsdoelstelling met een lange werkafstand voor een betere beeldkwaliteit en om ongewenste reflecties te verminderen. Hier worden glioblastoomcellen getoond op extracellulaire polyesterfilm met matrixcoating in standaard kweekmedium. Deze cellen zijn geïncubeerd met een calciumgevoelige tl-verslaggever.In deze afbeelding vertegenwoordigen de rode stippen individuele fluorescerende cellen, geïdentificeerd met behulp van een beeldverwerkingssoftware. Na stimulatie gedurende 10 seconden met echografie, robuuste calcium verhogingen werden gevisualiseerd in vele regio's van belang. Het aantal geactiveerde regio's van belang worden hier in de loop van de tijd weergegeven.Na de activering van 10 seconden met echografie bleek ongeveer 70% van de regio's hoger te zijn dan door de gebruiker gedefinieerde drempelwaarden. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de ultrasone straal uit te lijnen voordat het doen van fluorescentie meting.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Engineering

Unit 1

Sound

SCIENTISTS IN ACTION

Synthesis of Phase-shift Nanoemulsions with Narrow Size Distributions for Acoustic Droplet Vaporization and Bubble-enhanced Ultrasound-mediated Ablation

Synthese van Phase-shift Nanoemulsions met smalle Grootte Uitkeringen voor akoestische Droplet-verdamping en Bubble-enhanced Ultrasound-gemedieerde Ablation

High-intensity  focused ultrasound (HIFU) is used clinically to thermally ablate tumors. To  enhance localized heating and improve thermal ablation in ...

Time Multiplexing Super Resolving Technique for Imaging from a Moving Platform

Tijd Multiplexing Super oplossen Techniek for Imaging van een bewegend platform

We propose a method for increasing the resolution of an object and overcoming the diffraction limit of an optical system installed on top of a moving ...

Fabrication of Gate-tunable Graphene Devices for Scanning Tunneling Microscopy Studies with Coulomb Impurities

Fabricage van Gate-afstembare Grafeen Inrichtingen voor Scanning Tunneling Microscopy Studies met Coulomb Verontreinigingen

Owing to its relativistic low-energy charge carriers, the interaction between graphene and various impurities leads to a wealth of new physics and degrees ...

Ohmic Contact Fabrication Using a Focused-ion Beam Technique and Electrical Characterization for Layer Semiconductor Nanostructures

Ohmse Contact Fabrication Met behulp van een Focused-Ion Beam Techniek en elektrische karakterisatie voor Layer halfgeleider nanostructuren

Layer semiconductors with easily processed two-dimensional (2D) structures exhibit indirect-to-direct bandgap transitions and superior transistor ...

In Depth Analyses of LEDs by a Combination of X-ray Computed Tomography (CT) and Light Microscopy (LM) Correlated with Scanning Electron Microscopy (SEM)

In Depth Analyses of LEDs by a Combination of X-ray Computed Tomography CT and Light Microscopy LM Correlated with Scanning Electron Microscopy SEM

In detail Analyses LEDs door een combinatie van X-ray Computed Tomography (CT) en lichtmicroscopie (LM) gecorreleerd met Scanning Electron Microscopy (SEM)

In failure analysis, device characterization and reverse engineering of light emitting diodes (LEDs), and similar electronic components of ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Sub-nanometer Resolution Imaging met amplitude-modulatie Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Focused Ion Beam Fabrication of LiPON-based Solid-state Lithium-ion Nanobatteries for In Situ Testing

Focused Ion Beam Fabrication of LiPON-based Solid-state Lithium-ion Nanobatteries for In Situ Testing

Gerichte Ion Beam fabricage van LiPON gebaseerde Solid-state Lithium-ion Nanobatteries voor het testen van In Situ

Solid-state electrolytes are a promising replacement for current organic liquid electrolytes, enabling higher energy densities and improved safety of ...

Three-Dimensional Ultrasonic Needle Tip Tracking with a Fiber-Optic Ultrasound Receiver

Driedimensionale ultrasone naald Tip Tracking met een glasvezel echografie-ontvanger

Ultrasound is frequently used for guiding minimally invasive procedures, but visualizing medical devices is often challenging with this imaging modality. ...

Controllable Nucleation of Cavitation from Plasmonic Gold Nanoparticles for Enhancing High Intensity Focused Ultrasound Applications

Beheersbare nucleatie van cavitatie van Enterprise gouden nanodeeltjes voor het verbeteren van hoge intensiteit gericht echografie toepassingen

In this study, plasmonic gold nanoparticles were simultaneously exposed to pulsed near-infrared laser light and high intensity focused ultrasound (HIFU) ...