Name: multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Nous remercions les Drs Mikhail Shapiro et Nikita Reznik de discussions fructueuses. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de la Western University of Health Sciences et NIH grant R21NS101384.

1. croissance des cellules sur Film Polyester acoustiquement Transparent
<ol><li>Percer une taille de trou de 12 mm au fond d’une boîte de Petri standard de 35 mm à l’aide d’un foret de presse vertical. Déplacez la perceuse lentement et porter une protection oculaire. Retirez les morceaux de plastique attachés au fond du plat à l’aide d’une lame pour créer une surface lisse sur la face externe (Figure 2).</li>
	<li>Appliquer une fine couche d’époxy de qualité marine ou ...

<ol>
	<li>Elhelf, I. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+intensity+focused+ultrasound:+The+fundamentals,+clinical+applications+and+research+trends.">High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends.</a> Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).</li><li>Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , (2018).</li><li>Duck, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+and+non-medical+protection+standards+for+ultrasound+and+infrasound.">Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).</li><li>Legon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+focused+ultrasound+modulates+the+activity+of+primary+somatosensory+cortex+in+humans.">Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).</li><li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanobiology+of+brain+function.">The mechanobiology of brain function.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).</li><li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+neuromodulation+with+ultrasound?+A+continuum+mechanics+hypothesis.">Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis.</a> Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).</li><li>Tufail, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+pulsed+ultrasound+stimulates+intact+brain+circuits.">Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits.</a> Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).</li><li>Tyler, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+excitation+of+neuronal+circuits+using+low-intensity,+low-frequency+ultrasound.">Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound.</a> PloS One. 3 (10), e3511 (2008).</li><li>Suarez Castellanos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+ultrasound+stimulation+of+secretory+events+from+pancreatic+beta+cells.">Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells.</a> Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).</li><li>Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+Stimulation+of+Insulin+Release+from+Pancreatic+Beta+Cells+as+a+Potential+Novel+Treatment+for+Type+2+Diabetes.">Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).</li><li>Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonogenetics+is+a+non-invasive+approach+to+activating+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 6, 8264 (2015).</li><li>Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Piezo1+but+Not+NaV1.2+Channels+by+Ultrasound+at+43+MHz.">Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).</li><li>Kubanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+modulates+ion+channel+currents.">Ultrasound modulates ion channel currents.</a> Scientific Reports. 6, 24170 (2016).</li><li>Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+response+of+model+lipid+membranes+to+ultrasonic+radiation+force.">Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force.</a> PloS One. 8 (10), e77115 (2013).</li><li>Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic+Neuromodulation+Causes+Widespread+Cortical+Activation+via+an+Indirect+Auditory+Mechanism.">Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism.</a> Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).</li><li>O'Brien, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-biophysics+mechanisms.">Ultrasound-biophysics mechanisms.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corrigendum:+Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 8, 16148 (2017).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 3, 736 (2012).</li><li>Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+mechanisms+of+millimeter+wave+stimulation+of+excitable+cells.">Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells.</a> Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).</li><li>Hwang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+contactless+high+frequency+ultrasound+microbeam+stimulation+for+determination+of+invasion+potential+of+breast+cancer+cells.">Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).</li><li>Nakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+ratiometric+fluorescent+thermometer+with+wide+range+and+rapid+response.">Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response.</a> PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).</li><li>Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+intracellular+temperature+using+green+fluorescent+protein.">Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein.</a> Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).</li></ol>

Un avantage principal des ultrasons focalisés est sa capacité à livrer non invasive énergie mécanique ou thermique d’échantillons biologiques avec une grande précision temporelle. Autres techniques destinés à stimuler mécaniquement des cellules habituellement employer envahissantes sondes physiques (p. ex., cellule-piquer) ou requiert l’interaction des faisceaux lasers de haute énergie avec des objets étrangers (p. ex., les pinces optiques). Chauffage magnétique peut chauffer les emplac...

De nombreuses maladies nécessitent une forme quelconque d’intervention médicale invasive. Ces procédures sont souvent coûteux, risqué, exigent des périodes de récupération et donc ajouter un fardeau aux systèmes de soins de santé. Modalités thérapeutiques non invasifs sont susceptibles de fournir des solutions de rechange sûres et peu coûteuse pour des procédures chirurgicales conventionnelles. Toutefois, les approches actuelles non invasives telles que la stimulation magnétique transcrânienne ou de pharmacothérapie sont souvent limités par des compromis entre la pénétration tissulaire, résolution spatio-temporelle et des effets indésirables hors cible. Dans ce contexte, un ultrasons focalisés constituent une technologie non invasive prometteuse avec la possibilité de manipuler les fonctions biologiques profondément à l’intérieur des tissus avec haute précision spatio-temporelle et limité les effets hors cible.
Ultrasons focalisés stimulation consiste en délivrant une énergie acoustique à des emplacements précis profondément à l’intérieur des organismes vivants. En fonction des paramètres d’impulsions acoustiques, cette énergie peut avoir une variété d’utilisations médicales. Par exemple, la Food and Drug Administration a approuvé l’utilisation d’ultrasons de concentré de haute intensité (HiFU) pour ablation thermique de tumeurs prostatiques, causant des tremblements des régions du cerveau, les fibromes utérins et causant douleur de terminaisons nerveuses dans les métastases osseuses1 . Cavitation induite par HiFu microbulles est également utilisée pour ouvrir transitoirement la barrière hémato - encéphalique pour l’administration ciblée de produits thérapeutiques administrés par voie générale2. L’intensité moyenne des impulsions spatiale de pointe (j’aiLECL) et spatial-pic d’intensité moyenne temporelle (j’aispta) utilisé pour HiFU applications sont généralement au-dessus de plusieurs kW cm-2 et produisent la pression différentielle de plusieurs dizaines de MPa. Ces valeurs sont bien au-dessus de la FDA a approuvé ILECL et j’aispta limites d’échographie diagnostique, de 190 W cm-2 et de 720 mW cm-2, respectivement3. En revanche, les études récentes ont montré que la stimulation non destructifs ultrasons pulsés qui sont dans ou près de la plage des limites d’intensité de diagnostic par ultrasons (LIPUS) peut être efficace pour manipuler les neurones à distance et en toute sécurité de tir4, 5,6,7,8, sécrétion hormonale9,10 et génie génétique des cellules11. Pourtant, les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels cellules détecter et répondent aux ultrasons restent floues, excluant la traduction clinique de LIPUS. Donc, dans quelques années, des études des membranes artificielles, des cellules cultivées et des animaux stimulés par des ultrasons ont pris de l’ampleur pour révéler biophysiques et processus physiologiques modulées par LIPUS12,13, 14,15.
Les sons composés d’une vibration se propageant à travers un support physique. Un ultrason est un son avec une fréquence supérieure à la gamme audible humaine (c'est-à-dire supérieures à 20 kHz). Dans un environnement de laboratoire, des ondes ultrasoniques sont généralement fabriqués par des transducteurs piézoélectriques qui contiennent un matériau qui vibre en réponse à un champ électrique oscillant dans une largeur de bande haute fréquence spécifique. Il existe deux types de transducteurs : simple monoéléments et transducteurs. Piézoélectrique monoéléments possèdent une surface courbée qui agit comme une lentille de focalisation et donc se concentre une énergie acoustique dans une région donnée, appelée la zone focale. Monoéléments sont beaucoup moins cher et plus facile à exploiter que les transducteurs. Cet article se concentrera sur monoéléments.
La taille de la zone focale d’un transducteur unique élément dépend des propriétés géométriques de la lentille acoustique et sa fréquence acoustique. Pour atteindre une zone focale millimètre-taille avec un monoélément, fréquences d’ultrasons dans la gamme MHz sont généralement nécessaires. Malheureusement, les ondes acoustiques à une fréquence sont atténués très rapidement lorsque se propageant dans un milieu fragile tel que l’air. Ainsi, des ondes ultrasoniques MHz doivent être générés et propagées à l’échantillon dans un matériau plus dense comme l’eau. Ceci constitue le premier défi en intégrant la modalité LIPUS à un microscope.
Un deuxième défi est de réduire au minimum les interfaces physiques entre les matériaux avec différentes impédances acoustiques (qui est un produit de masse volumique et la vitesse acoustique) le long de la trajectoire acoustique. Ces interfaces peuvent refléter, réfraction, dispersion et absorbent les ondes acoustiques, rendant difficile de quantifier la quantité d’énergie acoustique effectivement livrée à un échantillon. Ils peuvent également créer des objets mécaniques non désirés. Par exemple, les réflexions incompatibilité perpendiculaire à acoustique produit impédance interfaces créent des ondes de backpropagating qui interfèrent avec ceux de multiplication avant. Sur le chemin de l’interférence, les ondes s’annulent mutuellement à des régions fixes des espaces appelés nœuds et résumer en alternant zones appelées anti-noeuds, créant ce que l'on appelle ondes stationnaires (Figure 1). Il est important pour l’expérimentateur d’être en mesure de contrôler ou éliminer ces interfaces expérimentales in vitro comme ils peuvent ne pas exister in vivo.
Mesure de la fluorescence de reporters optiques est une méthode bien connue d’interroger des échantillons biologiques transparents en temps réel et avec aucune perturbation physique. Cette approche est donc idéale pour les études LIPUS car les sondes physiques présents dans la région aux ultrasons présentera des objets mécaniques. Ce protocole décrit la mise en œuvre et le fonctionnement du LIPUS à un microscope épifluorescente commerciale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CERNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>SliceScope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optomechanical components</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HFO series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>DSOX2004A (4-channels 70MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>function generator</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>33500B (20MHz single-channel)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronic Navigation Industries (ENI)</td>
			<td rowspan="2">325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronics &#38; Innovation (E&#38;I)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>focused immersion transdcuers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Benthowave Instrument</td>
			<td>HiFu transducer BII-76 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>Piezo-ceramic or HiFu transducers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Ultrasonic-S-lab</td>
			<td>HiFu transducers made to order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-density Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>VWR 80094-330</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar film 2.5 microns</td>
			<td>Chemplex</td>
			<td>CAT.NO:107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy

En se concentrant des pulsations d’ultrasons de basse intensité qui pénètrent dans les tissus mous, LIPUS représente une technologie biomédicale prometteuse à distance et en toute sécurité manipuler tir neuronaux, sécrétion hormonale et cellules reprogrammées génétiquement. Cependant, la traduction de cette technologie pour des applications médicales est actuellement entravée par un manque de mécanismes biophysiques qui ciblés sens de tissus et de répondre aux LIPUS. Une méthode adaptée pour identifier ces mécanismes serait d’utiliser des biocapteurs optiques en combinaison avec LIPUS pour déterminer qui sous-tendent les voies de signalisation. Toutefois, appliquer LIPUS à un microscope à fluorescence peut introduire des objets mécaniques indésirables en raison de la présence d’interfaces physiques qui reflètent, d’absorber et de réfraction des ondes acoustiques. Cet article présente une procédure pas à pas pour se lient LIPUS microscopes épifluorescente verticale disponible dans le commerce tout en minimisant l’influence des interfaces physiques le long de la trajectoire acoustique. On décrit une méthode simple pour l’exploitation d’un seul élément transducteur et à intégrer la zone focale du capteur de point focal objectif. L’utilisation de LIPUS est illustrée par un exemple de calcium induite par LIPUS transitoires dans les cellules de glioblastome humain cultivées mesurées à l’aide d’imagerie calcique.

La figure 5 est un exemple d’expérience LIPUS multiplexé avec imagerie calcique. Cellules de glioblastome (A-172) ont été cultivées sur film polyester EMPM enduit dans le milieu de culture standard (additionné de 10 % de sérum et de 1 % des antibiotiques) et incubés avec le journaliste fluorescent sensible au calcium Fluo-4 AM. Cellules ont été photographiés à l’aide d’un objectif d’immersion X 10 et éclairé par une source de lumière LE...

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Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy

Stimulation d’ultrasons pulsés faible intensité (LIPUS) est une modalité pour une stimulation mécanique non invasif des cellules endogènes ou machinés avec une haute résolution spatiale et temporelle. Cet article explique comment implémenter LIPUS à un microscope épifluorescente et comment minimiser les différences d’impédance acoustique sur le chemin de l’échographie pour empêcher des objets mécaniques non désirés.

Multiplexage axé Stimulation ultrason avec la microscopie en Fluorescence

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en mécanobiologie, telles que la façon dont les échantillons biologiques réagissent aux forces mécaniques produites par la stimulation ultrasonique de faible intensité. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet à un expérimentien d’appliquer des forces mécaniques non invasives à un échantillon et de mesurer différents périmètres biologiques en temps réel. Pour commencer, percez lentement un trou de 12 millimètres au fond d’un plat de culture standard de 35 millimètres à l’aide d’une perceuse à presse verticale.Une fois percé, retirer les morceaux de plastique fixés au fond du plat à l’aide d’une lame, pour créer une surface lisse sur le côté extérieur. Ensuite, appliquez une fine couche d’époxy ou de colle de qualité marine à la surface inférieure externe du plat. Sur le dessus de l’adhésif, placer un film de polyester de deux points cinq microns d’épaisseur, en appuyant fermement pour s’assurer que l’adhésif se propage uniformément entre le film et la surface en plastique épaisse.Tirez doucement le film d’une manière centrifuge avec les doigts, pour créer une surface plane. Une fois que l’adhésif a séché, rincer brièvement le plat de fond en polyester avec 95% d’éthanol. Ensuite, les UV stérilisent le plat en le plaçant sous une forte source d’excitation UV de 254 nanomètres.Ajustez la durée et l’intensité pour fournir une dose UV d’environ 330 millijoules par centimètre carré. Ensuite, diluer un mélange de protéines matricielles extracellulaires disponibles dans le commerce avec le milieu de culture désiré à un rapport de un à 100. Travaillez sur la glace pour prévenir la polymérisation matricielle et appliquez rapidement 100 microlitres du mélange moyen sur le film en polyester.Remettre le couvercle sur le plat pour maintenir la stérilité. Une fois couvert, incuber les plats de fond en polyester enduits de matrice dans une culture cellulaire, incubateur tamponné de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant six à 12 heures. Après l’incubation, aspirer l’excès moyen et ensemencer directement la surface avec des cellules à la densité désirée.Placez un réservoir d’eau sous l’objectif d’un microscope droit. Ensuite, à l’aide de composants optométriques disponibles dans le commerce, placez le porte-échantillon entre l’objectif et le transducteur. Assurez-vous que les pièces mobiles et les actionneurs des étapes de traduction se trouvent soit à l’extérieur du réservoir, soit au-dessus de la conduite d’eau pour éviter les dommages causés par l’eau.Ensuite, remplissez le réservoir d’eau déionisée et dégazée jusqu’au plan horizontal du porte-échantillon, avant d’utiliser le transducteur d’immersion. À l’aide de composants optométriques non corrosifs et disponibles dans le commerce, assurez-vous que le transducteur se positionnant dans une position oblique par rapport au chemin optique. Cela permettra de s’assurer que toutes les ondes réfléchies seront dirigées loin de l’échantillon.Ajuster la fréquence du générateur de fonction à la fréquence nominale de pointe du transducteur. Ensuite, créez une impulsion de tension sinusoïde de la durée désirée et de la fréquence de répétition, en utilisant le mode rafale du générateur de fonction. Ensuite, ajustez la tension de pointe à maximale à une valeur désirée.Assurez-vous que la durée de l’impulsion est plus courte que le temps écoulé entre deux impulsions consécutives. Connectez la sortie du générateur de fonction à l’entrée d’un oscilloscope. Utilisez l’oscilloscope pour confirmer que la forme d’onde correspond au signal désiré.Ensuite, connectez la sortie du générateur de fonction à l’entrée d’une puissance d’un amplificateur RF de bonne taille. À l’aide d’une sonde hydrophone qui fonctionne avec une plage de fréquences et une intensité acoustique compatibles avec celle du transducteur à ultrasons, mettre soigneusement l’extrémité de la sonde au point dans le champ de vision de l’objectif à la position de l’échantillon. Assurez-vous que la sonde et le transducteur sont immergés dans le bain d’eau et effectuez un pré-alignement brut du transducteur en positionnant visuellement son axe acoustique vers la sonde hydrophone.Assurez-vous que la distance entre les deux correspond à la longueur focale du transducteur. Ne cognez pas la pointe de l’hydrophone avec un objet physique autre que l’eau, car cela modifiera son revêtement et affectera la mesure. Ensuite, connectez la sortie de l’hydrophone à l’une des entrées de signal de l’oscilloscope.Ensuite, connectez la gâchette de synchronisation du générateur de fonction à une autre entrée oscilloscope. Visualisez les deux signaux simultanément sur l’oscilloscope. Ensuite, conduisez le transducteur avec peu de cycles ultrasoniques à un cycle de faible service et une faible amplitude pour éviter d’endommager la sonde.Vérifiez auprès du fabricant de l’hydrophone des conditions de fonctionnement sécuritaires pour éviter d’endommager la pointe de l’hydrophone. Réglez le bouton de la division S en fonction du temps de déplacement de l’échographie de la surface du transducteur à l’hydrophone. Recherchez un signal hydrophone sur l’oscilloscope après le déclencheur de synchronisation.Ensuite, actionner lentement le transducteur à l’aide d’un stade XYZ motorisé ou manuel. Placez le transducteur dans la position qui est corrélée avec le signal hydrophone maximal. Maintenant que le faisceau est aligné, mesurez l’amplitude de pointe à pointe de la sortie hydrophone à l’oscilloscope pour les différentes tensions qui conduisent le transducteur.Assurez-vous de ne pas dépasser la limite de pression de l’hydrophone. Remplacez le milieu de culture de la cellule par le tampon d’imagerie désiré contenant cinq micromolaires d’un colorant sensible au calcium perméant, comme fluo-4 AM. Ensuite, incubez le plat de culture dans un incubateur tamponné de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l’incubation, laver soigneusement les cellules avec le même tampon exempt de colorant.Ensuite, placez le plat dans le porte-échantillon. Exciter les cellules à l’aide de l’éclairage de la lumière bleue à 490 nanomètres. Ajustez l’intensité de l’excitation et l’exposition à la caméra pour éviter un blanchiment excessif ou une saturation des pixels.Effectuez l’imagerie en accéléré à l’aide d’un objectif d’immersion avec une longue distance de travail pour une meilleure qualité d’image, et pour réduire les réflexions non désirées. Ici, les cellules de glioblastome sont montrées sur le film extracellulaire de polyester matricielle-enduit dans le milieu standard de culture. Ces cellules ont été incubées avec un journaliste fluorescent sensible au calcium.Dans cette image, les points rouges représentent des cellules fluorescentes individuelles, identifiées à l’aide d’un logiciel de traitement d’image. Lors de la stimulation pendant 10 secondes avec ultrasons, des élévations robustes de calcium ont été visualisées dans beaucoup de régions d’intérêt. Le nombre de régions d’intérêt activées est indiqué ici au fil du temps.Après l’activation de 10 secondes par ultrasons, environ 70 % des régions se sont trouvées au-dessus des valeurs seuils définies par l’utilisateur. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’aligner le faisceau d’ultrasons avant de faire la mesure de fluorescence.

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En Profondeur Analyses de LED par une combinaison de tomodensitométrie à rayons X (CT) et Microscopie Light (LM) Corrélée avec microscopie électronique à balayage (MEB)

In failure analysis, device characterization and reverse engineering of light emitting diodes (LEDs), and similar electronic components of ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Imaging Résolution Sous-nanomètre avec modulation d&#39;amplitude en microscopie à force atomique en liquide

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Focused Ion Beam Fabrication of LiPON-based Solid-state Lithium-ion Nanobatteries for In Situ Testing

Focused Ion Beam Fabrication of LiPON-based Solid-state Lithium-ion Nanobatteries for In Situ Testing

Fabrication de faisceau ionique focalisé de Lithium-ion à l’état solide axée sur les LiPON micro-batterie pour In Situ essais

Solid-state electrolytes are a promising replacement for current organic liquid electrolytes, enabling higher energy densities and improved safety of ...

Three-Dimensional Ultrasonic Needle Tip Tracking with a Fiber-Optic Ultrasound Receiver

Aiguille à ultrasons tridimensionnel Tip suivi avec un récepteur à ultrasons de la fibre optique

Ultrasound is frequently used for guiding minimally invasive procedures, but visualizing medical devices is often challenging with this imaging modality. ...

Controllable Nucleation of Cavitation from Plasmonic Gold Nanoparticles for Enhancing High Intensity Focused Ultrasound Applications

Nucléation contrôlable de Cavitation de nanoparticules d’or plasmoniques pour renforcer la haute intensité porté Applications ultrasons

In this study, plasmonic gold nanoparticles were simultaneously exposed to pulsed near-infrared laser light and high intensity focused ultrasound (HIFU) ...