Name: multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Wir danken Dr. Mikhail Shapiro und Nikita Reznik für fruchtbare Diskussionen. Diese Arbeit wurde unterstützt von Startkapital von Western University of Health Sciences und NIH gewähren R21NS101384.

1. wachsende Zellen auf akustisch transparente Polyesterfolie
<ol><li>Bohren Sie ein 12 mm Lochgröße am unteren Rand ein standard 35 mm Kulturschale mit einem vertikalen Presse-Bohrer. Bewegen Sie den Bohrer langsam und tragen Sie Augenschutz. Entfernen Sie Stücke aus Kunststoff an der Unterseite der Schale mit einer Klinge erstelle ich eine glatte Oberfläche auf der externen Seite (Abbildung 2) befestigt.</li>
	<li>Der Marine-Grad Epoxy oder Klebstoff an der äußeren Boden Oberfläch...

<ol>
	<li>Elhelf, I. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+intensity+focused+ultrasound:+The+fundamentals,+clinical+applications+and+research+trends.">High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends.</a> Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).</li><li>Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , (2018).</li><li>Duck, F. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+excitation+of+neuronal+circuits+using+low-intensity,+low-frequency+ultrasound.">Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound.</a> PloS One. 3 (10), e3511 (2008).</li><li>Suarez Castellanos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+ultrasound+stimulation+of+secretory+events+from+pancreatic+beta+cells.">Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells.</a> Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).</li><li>Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+Stimulation+of+Insulin+Release+from+Pancreatic+Beta+Cells+as+a+Potential+Novel+Treatment+for+Type+2+Diabetes.">Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).</li><li>Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonogenetics+is+a+non-invasive+approach+to+activating+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 6, 8264 (2015).</li><li>Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Piezo1+but+Not+NaV1.2+Channels+by+Ultrasound+at+43+MHz.">Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).</li><li>Kubanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+modulates+ion+channel+currents.">Ultrasound modulates ion channel currents.</a> Scientific Reports. 6, 24170 (2016).</li><li>Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+response+of+model+lipid+membranes+to+ultrasonic+radiation+force.">Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force.</a> PloS One. 8 (10), e77115 (2013).</li><li>Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic+Neuromodulation+Causes+Widespread+Cortical+Activation+via+an+Indirect+Auditory+Mechanism.">Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism.</a> Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).</li><li>O'Brien, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-biophysics+mechanisms.">Ultrasound-biophysics mechanisms.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corrigendum:+Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 8, 16148 (2017).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 3, 736 (2012).</li><li>Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+mechanisms+of+millimeter+wave+stimulation+of+excitable+cells.">Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells.</a> Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).</li><li>Hwang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+contactless+high+frequency+ultrasound+microbeam+stimulation+for+determination+of+invasion+potential+of+breast+cancer+cells.">Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).</li><li>Nakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+ratiometric+fluorescent+thermometer+with+wide+range+and+rapid+response.">Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response.</a> PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).</li><li>Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+intracellular+temperature+using+green+fluorescent+protein.">Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein.</a> Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).</li></ol>

Ein Hauptvorteil des fokussierten Ultraschalls ist seine Fähigkeit, nicht-invasiv mechanischer und/oder thermischer Energie an biologischen Proben mit hoher räumlich-zeitliche Präzision zu liefern. Andere Techniken zur mechanisch anregen Zellen in der Regel beschäftigen invasive körperliche Sonden (z. B. Zelle stossen) oder erfordert das Zusammenspiel von hochenergetischen Laserstrahlen mit Fremdkörpern (z. B. optische Pinzette). Magnetische Heizung kann Heizen spezifischen räumliche Positionen i...

Viele Krankheiten erfordern eine Form der invasiven medizinischen Eingriff. Diese Verfahren sind oft teuer, riskant, Erholungsphasen erfordern und so eine Belastung zu Gesundheitssystemen hinzufügen. Nicht-invasive therapeutische Modalitäten haben das Potenzial, sicherere und billigere Alternativen zu herkömmlichen chirurgischen Eingriffen bieten. Aktuelle nicht-invasive Ansätze wie Pharmakotherapie oder transkranielle Magnetstimulation sind jedoch oft durch Trade-Offs zwischen Gewebe eindringen, räumlich-zeitliche Auflösung und Ziel Nebenwirkungen begrenzt. In diesem Zusammenhang eine Ultraschall stellt eine viel versprechende nicht-invasive Technologie das Potenzial zur biologische Funktionen manipulieren tief in Gewebe mit hoher räumlich-zeitliche Genauigkeit und begrenzte off-Target-Wirkung.
Ultraschall-Stimulation besteht aus Schallenergie an genauen Standorte liefern tief in lebenden Organismen. Je nach akustischen Pulsparameter kann diese Energie eine Vielzahl von medizinischen Anwendungen haben. Zum Beispiel, der Food and Drug Administration genehmigt die Verwendung von hochintensivem fokussierten Ultraschall (HiFU) für thermische Ablation von Prostatatumoren, Tremor verursachen Hirnregionen, Myome und Schmerz verursachende Nervenenden in Knochenmetastasen1 . HiFu-vermittelten Mikroblasen Kavitation dient auch vorübergehend die Blut - Hirn-Schranke für die gezielte Bereitstellung von systemisch verabreicht Therapeutika2öffnen. Die räumliche Peak-Puls-Durchschnitt-Intensität (ichSppa) und räumliche Peak zeitlichen Durchschnitt-Intensität (ichBÜPF) verwendet für HiFU-Anwendungen sind in der Regel über mehrere kW cm-2 und Pulsdruck von mehreren zehntausend MPa zu produzieren. Diese Intensitätswerte sind weit über die FDA-Zulassung ichSppa und ichSpta Grenzwerte für diagnostischen Ultraschall, 190 W cm-2 und 720 mW cm-2, bzw.3. Im Gegensatz dazu, haben neuere Studien gezeigt, dass zerstörungsfreie gepulster Ultraschall-Stimulation, die innerhalb oder in der Nähe das Spektrum der diagnostischen Ultraschall Intensität Grenzen (LIPUŠ) effektiv, sicher und aus der Ferne neuronale manipulieren4ausgelöst werden kann, 5,6,7,8, hormonellen Sekretion9,10 und biotechnologisch Zellen11. Und doch bleiben die zellulären und molekularen Mechanismen, durch die Zellen spüren und reagieren auf Ultraschall, unklar, klinische Übersetzung der LIPUŠ entgegensteht. Daher in den letzten Jahren Studien von künstlichen Membranen, kultivierten Zellen und Tieren mit Ultraschall angeregt haben zugenommen, biophysikalische offenbaren und physiologische Prozesse moduliert durch LIPUŠ12,13, 14,15.
Ton besteht aus einer Schwingung durch ein physikalisches Medium. Eine Ultraschalluntersuchung ist ein Ton mit einer Frequenz oberhalb der menschlichen Hörbereich (d. h. über 20 kHz). In einer Laborumgebung entstehen Ultraschallwellen in der Regel durch piezoelektrische Sensoren, die ein Material enthalten, das als Reaktion auf ein elektrisches Feld in eine bestimmte Bandbreite von Hochfrequenz-oszillierende schwingt. Es gibt zwei Arten von Sensoren: single Element Sensoren und Wandler-Arrays. Einzelelement piezoelektrische Sensoren besitzen eine gekrümmte Oberfläche wirkt wie eine Linse und damit akustische Energie in einer definierten Region namens der Fokuszone konzentriert. Einzelnes Element Wandler sind viel billiger und einfacher zu bedienen als Wandler-Arrays. Dieser Artikel konzentriert sich auf einzelnes Element Wandler.
Die Größe der Fokuszone einen fokussierten Einzelelement-Wandler richtet sich auf die geometrischen Eigenschaften der akustischen Linse und auf seine akustische Frequenz. Um einen Millimeter Größe Fokuszone mit ein einzelnes Element Wandler zu erreichen, sind Ultraschall-Frequenzen im MHz-Bereich in der Regel erforderlich. Akustische Wellen bei dieser Frequenz werden leider sehr schnell abgeschwächt, in einem dünn Mittel wie Luft weitergegeben. Daher müssen MHz Ultraschall-Wellen generiert und an die Probe in ein dichteres Material wie Wasser weitergegeben werden. Dies ist die erste Herausforderung bei der Integration von LIPUŠ Modalität an ein Mikroskop.
Eine zweite Herausforderung ist es, physikalische Schnittstellen zwischen Materialien mit unterschiedlichen akustischen Impedanzen (das ist ein Produkt der Materialdichte und der Schallgeschwindigkeit) den akustischen Weg zu minimieren. Diese Schnittstellen können reflektieren, brechen Sie, zerstreuen und absorbieren Sie akustische Wellen, so dass es schwer zu quantifizieren, die Höhe der akustischen Energie effektiv zu einer Probe geliefert. Sie können ebenfalls unerwünschte mechanische Artefakte erstellen. Zum Beispiel erzeugen Reflexionen produzierten senkrecht zur akustischen Fehlanpassung Impedanz Schnittstellen Backpropagating Wellen, die vorwärts-Vermehrung zu stören. Des Weges der Störungen abbrechen die Wellen gegenseitig bei festen Regionen von Räumen, die als Knoten und fassen an wechselnden Regionen Anti-Knoten genannt, erstellen sogenannte stehende Wellen (Abbildung 1). Es ist wichtig für den Experimentator in der Lage zu kontrollieren oder diese experimentellen Interfaces in Vitro zu beseitigen, da sie möglicherweise nicht in Vivovorhanden sein.
Fluoreszenzmessung der optischen Reporter ist eine bekannte Methode, transparente biologischen Proben in Echtzeit und mit keinen körperlichen Störung zu befragen. Dieser Ansatz ist somit ideal für LIPUŠ Studien wie jede physikalische Sonden in das beschallte Gebiet mechanische Artefakte einführen werden. Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung und den Betrieb von LIPUŠ zu einem kommerziellen Epi-Fluoreszenz-Mikroskop.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CERNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>SliceScope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optomechanical components</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HFO series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>DSOX2004A (4-channels 70MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>function generator</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>33500B (20MHz single-channel)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronic Navigation Industries (ENI)</td>
			<td rowspan="2">325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronics &#38; Innovation (E&#38;I)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>focused immersion transdcuers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Benthowave Instrument</td>
			<td>HiFu transducer BII-76 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>Piezo-ceramic or HiFu transducers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Ultrasonic-S-lab</td>
			<td>HiFu transducers made to order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-density Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>VWR 80094-330</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar film 2.5 microns</td>
			<td>Chemplex</td>
			<td>CAT.NO:107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy

Durch die Konzentration geringer Intensität Ultraschall-Impulse, die weiche Gewebe eindringen, stellt LIPUŠ eine viel versprechende Biomedizinische Technologie, aus der Ferne und sicher neuronale feuern, hormonellen Sekretion und genetisch umprogrammiert Zellen zu manipulieren. Allerdings ist die Übersetzung dieser Technologie für medizinische Anwendungen derzeit durch behindert, mangelnder biophysikalischen Mechanismen mit denen gezielt Gewebe Sinn und reagieren auf LIPUŠ. Ein geeigneter Ansatz, diese Mechanismen zu identifizieren wäre, optische Biosensoren in Kombination mit LIPUŠ verwenden, um die zugrunde liegenden Signalwege zu bestimmen. Umsetzung LIPUŠ zu einem Fluoreszenzmikroskop kann jedoch unerwünschte mechanische Artefakte aufgrund des Vorhandenseins von physikalischen Schnittstellen einführen, die reflektieren, absorbieren und akustische Wellen brechen. Dieser Artikel stellt eine Schrittanleitung um LIPUŠ zu handelsüblichen aufrecht Epi-Fluoreszenz Mikroskope zu integrieren, bei gleichzeitiger Minimierung des Einfluss der physikalischen Schnittstellen den akustischen Weg. Ein einfaches Verfahren bezeichnet man einen Single-Element-Ultraschall-Wandler zu betreiben und der Fokuszone des Wandlers in den objektiven Brennpunkt bringen. Die Verwendung von LIPUŠ wird anhand eines Beispiels der LIPUŠ-induzierte Kalzium Transienten in kultivierten menschlichen Glioblastom-Zellen mit Kalzium Bildgebung gemessen dargestellt.

Abbildung 5 ist ein Beispiel für LIPUŠ Experiment mit Kalzium Imaging gemultiplext. Glioblastom-Zellen (A-172) wurden auf EMPM beschichtete Polyesterfolie in standard Kulturmedium (ergänzt mit 10 % Serum und 1 % Antibiotika) angebaut und inkubiert mit dem Calcium-Sensitive fluoreszierende Reporter Fluo-4 Uhr. Zellen wurden abgebildet, mit einem 10 X eintauchen Objektiv und mit einer weißen LED-Lichtquelle beleuchtet und Fluoreszenzlicht wurde mit einem St...

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Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy

Niedrige Intensität pulsierte Ultraschall Stimulation (LIPUŠ) ist eine Modalität für nicht-invasive mechanische Stimulation der endogenen oder veränderter Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Dieser Artikel beschreibt wie LIPUŠ zu einem Epi-Fluoreszenz-Mikroskop zu implementieren und akustische Impedanzfehlanpassung auf dem Ultraschall Weg zu verhindern, dass unerwünschte mechanische Artefakte zu minimieren.

Multiplexen fokussiert Ultraschall-Stimulation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der Mechanobiologie zu beantworten, wie z. B. wie biologische Proben auf mechanische Kräfte reagieren, die durch Ultraschallstimulation mit geringer Intensität erzeugt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es einem Experimentalisten ermöglicht, keine invasiven mechanischen Kräfte auf eine Probe anzuwenden und verschiedene biologische Perimeter in Echtzeit zu messen. Zunächst bohren Sie langsam ein 12-Millimeter-Loch an der Unterseite einer 35-Millimeter-Standard-Kulturschale mit einem vertikalen Pressbohrer.Nach dem Bohren entfernen Sie Kunststoffstücke, die mit einer Klinge an der Unterseite der Schale befestigt sind, um eine glatte Oberfläche auf der Außenseite zu schaffen. Als nächstes, wenden Sie eine dünne Schicht von marinen Qualität Epoxid oder Kleber an der äußeren unteren Oberfläche der Schale. Legen Sie auf den Klebstoff einen zwei Punkt-fünf-Mikron dicken Polyesterfilm, der fest presst, um sicherzustellen, dass sich der Klebstoff gleichmäßig zwischen der Folie und der dicken Kunststoffoberfläche ausbreitet.Ziehen Sie den Film vorsichtig zentrifugal mit den Fingern, um eine flache Oberfläche zu schaffen. Sobald der Klebstoff getrocknet ist, spülen Sie die Polyester-Bodenschale kurz mit 95% Ethanol ab. Anschließend sterilisiert UV die Schale, indem sie sie unter eine starke UV-Anregungsquelle von 254 Nanometern stellt.Passen Sie Dauer und Intensität an, um eine UV-Dosis von etwa 330 Millijoule pro Quadratzentimeter zu liefern. Als nächstes verdünnen Sie eine handelsübliche extrazelluläre Matrixproteinmischung mit dem gewünschten Kulturmedium im Verhältnis eins zu 100. Arbeiten Sie auf Eis, um eine Matrixpolymerisation zu verhindern, und tragen Sie schnell 100 Mikroliter der Mediummischung auf die Polyesterfolie auf.Legen Sie den Deckel wieder auf die Schale, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Einmal abgedeckt, inkubieren Sie die matrixbeschichteten, Polyester-Bodenschalen in einer Zellkultur, einem mit Kohlendioxid gepufferten Inkubator bei 37 Grad Celsius für sechs bis zwölf Stunden. Nach der Inkubation das überschüssige Medium ansaugen und die Oberfläche direkt mit Zellen bei der gewünschten Dichte säen.Legen Sie einen Wassertank unter das Ziel eines aufrechten Mikroskops. Positionieren Sie dann mit handelsüblichen optomechanischen Komponenten den Probenhalter zwischen Dem Objektiv und dem Messumformer. Stellen Sie sicher, dass sich die beweglichen Teile und die Aktuatoren der Übersetzungsstufen entweder außerhalb des Tanks oder oberhalb der Wasserleitung befinden, um Wasserschäden zu vermeiden.Dann füllen Sie den Tank mit entionisiertem und entgastem Wasser bis zur horizontalen Ebene des Probenhalters, bevor Sie den Tauchaufnehmer verwenden. Mit nicht korrosiven, kommerziell erhältlichen optomechanischen Komponenten stellen Sie sicher, dass der Messumformer in einer schrägen Position in Bezug auf den optischen Pfad ist. Dadurch wird sichergestellt, dass alle reflektierten Wellen von der Probe weggelenkt werden.Stellen Sie die Frequenz des Funktionsgenerators an die nenne Spitzenfrequenz des Messumformers ein. Erstellen Sie dann einen sinusförmigen Spannungsimpuls der gewünschten Dauer und Wiederholungsfrequenz, indem Sie den Burst-Modus des Funktionsgenerators verwenden. Passen Sie als Nächstes die Spitzenspannung auf einen gewünschten Wert an.Stellen Sie sicher, dass die Pulsdauer kürzer ist als die verstrichene Zeit zwischen zwei aufeinanderfolgenden Impulsen. Schließen Sie den Ausgang des Funktionsgenerators an den Eingang eines Oszilloskops an. Verwenden Sie das Oszilloskop, um zu bestätigen, dass die Wellenform dem gewünschten Signal entspricht.Schließen Sie dann den Ausgang des Funktionsgenerators an den Eingang einer Leistung eines hf-Verstärkers in richtiger Größe an. Mit einer Hydrophonsonde, die mit einem Frequenzbereich und einer mit der des Ultraschallwandlers kompatiblen Akustischen Intensität arbeitet, bringen Sie die Spitze der Sonde vorsichtig in den Fokus innerhalb des Sichtfeldes des Objektivs an der Position der Probe. Stellen Sie sicher, dass sowohl Sonde als auch Messumformer in das Wasserbad eingetaucht sind und führen Sie eine grobe Vorausrichtung des Messumformers durch, indem Sie seine akustische Achse visuell zur Hydrophonsonde positionieren.Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen den beiden der Brennweite des Messumformers entspricht. Stoßen Sie die Spitze des Hydrophons nicht mit einem anderen physikalischen Objekt als Wasser, da dies seine Beschichtung verändern und die Messung beeinflussen wird. Schließen Sie als Nächstes den Hydrophone-Ausgang an einen der Signaleingänge des Oszilloskops an.Verbinden Sie dann den Synchronisationstrigger des Funktionsgenerators mit einem anderen Oszilloskop-Eingang. Visualisieren Sie beide Signale gleichzeitig auf dem Oszilloskop. Als nächstes fahren Sie den Messumformer mit wenigen Ultraschallzyklen bei einem niedrigen Zyklus und geringer Amplitude, um eine Beschädigung der Sonde zu vermeiden.Erkundigieren Sie sich bei den sicheren Betriebsbedingungen des Herstellers des Hydrophons, um eine Beschädigung der Hydrophonspitze zu vermeiden. Passen Sie den S-Division-Regler entsprechend der Fahrzeit des Ultraschalls von der Oberfläche des Messumformers auf das Hydrophon an. Suchen Sie nach einem Hydrophone-Signal auf dem Oszilloskop nach dem Synchronisationsauslöser.Als nächstes betätigen Sie den Messumformer langsam mit einer motorisierten oder manuellen XYZ-Stufe. Positionieren Sie den Messumformer in der Position, die mit dem maximalen Hydrophonsignal korreliert. Wenn der Strahl nun ausgerichtet ist, messen Sie die Peak-to-Peak-Amplitude des Hydrophonausgangs am Oszilloskop für verschiedene Spannungen, die den Messumformer antreiben.Achten Sie darauf, die Druckgrenze des Hydrophons nicht zu überschreiten. Ersetzen Sie das Kulturmedium der Zelle durch den gewünschten Bildgebungspuffer, der fünf Mikromolar eines zellpermeant, kalziumempfindlichen Farbstoffs wie Fluo-4 AM enthält. Dann die Kulturschale in einem kohlendioxidgepufferten Inkubator bei 37 Grad Celsius für eine Stunde inkubieren. Nach der Inkubation zellen mit demselben Farbpuffer sorgfältig waschen.Dann legen Sie die Schale in den Probenhalter. Erregen Sie die Zellen mit Blaulichtbeleuchtung bei 490 Nanometern. Passen Sie die Anregungsintensität und die Kamerabelichtung an, um übermäßiges Bleichen oder Pixelsättigung zu vermeiden.Führen Sie Zeitraffer-Bildgebung mit einem Tauchobjektiv mit einem langen Arbeitsabstand für eine bessere Bildqualität und zur Reduzierung unerwünschter Reflexionen durch. Hier werden Glioblastomzellen auf extrazellulärer Matrix-beschichteter Polyesterfolie im Standardkulturmedium gezeigt. Diese Zellen wurden mit einem kalziumempfindlichen Fluoreszenzreporter inkubiert.In diesem Bild stellen die roten Punkte einzelne fluoreszierende Zellen dar, die mit einer Bildverarbeitungssoftware identifiziert werden. Bei der Stimulation für 10 Sekunden mit Ultraschall wurden robuste Kalziumhöhen in vielen Bereichen von Interesse visualisiert. Die Anzahl der aktivierten Regionen von Interesse wird hier im Laufe der Zeit angezeigt.Nach der 10-Sekunden-Aktivierung mit Ultraschall lagen etwa 70 % der Regionen über den benutzerdefinierten Schwellenwerten. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, den Ultraschallstrahl auszurichten, bevor Sie Fluoreszenzmessungen durchführen.

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Synthesis of Phase-shift Nanoemulsions with Narrow Size Distributions for Acoustic Droplet Vaporization and Bubble-enhanced Ultrasound-mediated Ablation

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Fabrication of Gate-tunable Graphene Devices for Scanning Tunneling Microscopy Studies with Coulomb Impurities

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Owing to its relativistic low-energy charge carriers, the interaction between graphene and various impurities leads to a wealth of new physics and degrees ...

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In Depth Analyses of LEDs by a Combination of X-ray Computed Tomography (CT) and Light Microscopy (LM) Correlated with Scanning Electron Microscopy (SEM)

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In Tiefenanalysen der LEDs durch eine Kombination von Röntgen Computertomographie (CT) und Lichtmikroskopie (LM) korrelierte mit Rasterelektronenmikroskopie (SEM)

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Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Sub-Nanometer Auflösung Belichtung mit Amplituden-Modulation der Rasterkraftmikroskopie in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Focused Ion Beam Fabrication of LiPON-based Solid-state Lithium-ion Nanobatteries for In Situ Testing

Focused Ion Beam Fabrication of LiPON-based Solid-state Lithium-ion Nanobatteries for In Situ Testing

Fokussierte Ion Beam Herstellung von LiPON-basierten Solid-State-Lithium-Ionen-Nanobatteries zu Testzwecken In Situ

Solid-state electrolytes are a promising replacement for current organic liquid electrolytes, enabling higher energy densities and improved safety of ...

Three-Dimensional Ultrasonic Needle Tip Tracking with a Fiber-Optic Ultrasound Receiver

Dreidimensionale Ultraschall Nadel Tipp Tracking mit einem Glasfaser-Ultraschall-Empfänger

Ultrasound is frequently used for guiding minimally invasive procedures, but visualizing medical devices is often challenging with this imaging modality. ...

Controllable Nucleation of Cavitation from Plasmonic Gold Nanoparticles for Enhancing High Intensity Focused Ultrasound Applications

Steuerbare Keimbildung der Kavitation von Plasmonische Gold-Nanopartikel für die Verbesserung der hohen Intensität konzentriert Ultraschallanwendungen

In this study, plasmonic gold nanoparticles were simultaneously exposed to pulsed near-infrared laser light and high intensity focused ultrasound (HIFU) ...