Name: multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Ringraziamo la d. ssa Mikhail Shapiro e Nikita Reznik per discussioni fruttuose. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di Start-up da Western University of Health Sciences e NIH concedere R21NS101384.

1. crescita delle cellule su acusticamente trasparente pellicola di poliestere
<ol><li>Praticare una dimensione del foro di 12 mm nella parte inferiore di una piastra di coltura standard da 35 mm con un trapano verticale a stampa. Spostare lentamente il trapano e indossare occhiali di protezione. Rimuovere i pezzi di plastica attaccato al fondo del piatto con una lama per creare una superficie liscia sul lato esterno (Figura 2).</li>
	<li>Applicare un sottile strato di resina epossidica ma...

<ol>
	<li>Elhelf, I. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+intensity+focused+ultrasound:+The+fundamentals,+clinical+applications+and+research+trends.">High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends.</a> Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).</li><li>Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , (2018).</li><li>Duck, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+and+non-medical+protection+standards+for+ultrasound+and+infrasound.">Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).</li><li>Legon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+focused+ultrasound+modulates+the+activity+of+primary+somatosensory+cortex+in+humans.">Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).</li><li>Tyler, W. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+excitation+of+neuronal+circuits+using+low-intensity,+low-frequency+ultrasound.">Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound.</a> PloS One. 3 (10), e3511 (2008).</li><li>Suarez Castellanos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+ultrasound+stimulation+of+secretory+events+from+pancreatic+beta+cells.">Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells.</a> Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).</li><li>Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+Stimulation+of+Insulin+Release+from+Pancreatic+Beta+Cells+as+a+Potential+Novel+Treatment+for+Type+2+Diabetes.">Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).</li><li>Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonogenetics+is+a+non-invasive+approach+to+activating+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 6, 8264 (2015).</li><li>Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Piezo1+but+Not+NaV1.2+Channels+by+Ultrasound+at+43+MHz.">Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).</li><li>Kubanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+modulates+ion+channel+currents.">Ultrasound modulates ion channel currents.</a> Scientific Reports. 6, 24170 (2016).</li><li>Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+response+of+model+lipid+membranes+to+ultrasonic+radiation+force.">Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force.</a> PloS One. 8 (10), e77115 (2013).</li><li>Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic+Neuromodulation+Causes+Widespread+Cortical+Activation+via+an+Indirect+Auditory+Mechanism.">Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism.</a> Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).</li><li>O'Brien, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-biophysics+mechanisms.">Ultrasound-biophysics mechanisms.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corrigendum:+Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 8, 16148 (2017).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 3, 736 (2012).</li><li>Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+mechanisms+of+millimeter+wave+stimulation+of+excitable+cells.">Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells.</a> Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).</li><li>Hwang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+contactless+high+frequency+ultrasound+microbeam+stimulation+for+determination+of+invasion+potential+of+breast+cancer+cells.">Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).</li><li>Nakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+ratiometric+fluorescent+thermometer+with+wide+range+and+rapid+response.">Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response.</a> PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).</li><li>Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+intracellular+temperature+using+green+fluorescent+protein.">Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein.</a> Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).</li></ol>

Un vantaggio principale di ultrasuoni focalizzati è la sua capacità di non invadente erogare energia meccanica e/o termica a campioni biologici con alta precisione spazio-temporale. Altre tecniche destinate a stimolare meccanicamente cellule solitamente impiegano sonde fisico invasivo (ad es., cella-frugando) o richiede l'interazione di raggi laser ad alta energia con corpi estranei (ad es., pinzette ottiche). Riscaldamento magnetico può riscaldare specifiche posizioni spaziali all'interno di campion...

Molte malattie richiedono una qualche forma di intervento medico invasivo. Queste procedure sono spesso costosi, rischioso, richiedono periodi di recupero e quindi aggiungere un peso ai sistemi sanitari. Modalità terapeutiche non invasivi hanno il potenziale per fornire alternative più sicure ed economiche per procedure chirurgiche convenzionali. Tuttavia, approcci attuali non invasiva come farmacoterapia o transcranial stimolazione magnetica sono spesso limitati di trade-off tra penetrazione tissutale, risoluzione spazio-temporale ed effetti indesiderati fuori bersaglio. In questo contesto, un ultrasuono messo a fuoco costituisce una promettente tecnologia non invasiva con il potenziale per manipolare le funzioni biologiche profonde all'interno dei tessuti con alta esattezza spatiotemporal ed effetti limitati fuori bersaglio.
Ultrasuono messo a fuoco la stimolazione consiste di erogare energia acustica in posizioni precise profondo all'interno di organismi viventi. A seconda dei parametri di impulso acustico, questa energia può avere una varietà di usi medici. Per esempio, la Food and Drug Administration ha approvato l'uso di ultrasuoni focalizzati ad alta intensità (HiFU) per termoablazione di tumori della prostata, regioni del cervello che causano tremore, fibromi uterini e terminazioni nervose causando dolore metastasi ossee1 . HiFu-mediata microbolle cavitazione è utilizzato anche per aprire transitoriamente la barriera emato - encefalica per la somministrazione mirata di somministrazione sistemica terapeutica2. L'intensità di impulso-media spaziale-picco (misppa) e spaziali-picco temporale-media intensità (mispta) utilizzato per HiFU applicazioni sono in genere sopra parecchi kW cm-2 e producono pressione di impulso di diverse decine di MPa. Questi valori di intensità sono molto di sopra della FDA ha approvatosppa e mispta limiti per diagnostico ad ultrasuoni, 190 W cm-2 e 720 mW cm-2, rispettivamente3. Al contrario, recenti studi hanno dimostrato che la stimolazione non distruttivi ad ultrasuoni pulsata che sono all'interno o nei pressi dei limiti di intensità di diagnostica ad ultrasuoni (LIPUS) può essere efficace in remoto e in modo sicuro manipolare neurale di cottura4, 5,6,7,8, secrezione ormonale9,10 e Bioingegneria cellule11. Ancora, i meccanismi cellulari e molecolari mediante il quale le cellule percepiscono e rispondere ai ultrasuono rimangono poco chiari, precludendo traslazione clinica LIPUS. Quindi, negli ultimi anni, studi di membrane artificiali, cellule coltivate e animali stimolati con ultrasuoni hanno acquisito slancio per rivelare biofisiche e processi fisiologici modulata da LIPUS12,13, 14,15.
Suono è costituito da una vibrazione di moltiplicazione attraverso un supporto fisico. L'ecografia è un suono con una frequenza di sopra della gamma udibile umana (cioè, sopra i 20 kHz). In un ambiente di laboratorio, gli ultrasuoni sono generalmente prodotti da trasduttori piezoelettrici che contengono un materiale che vibra in risposta a un campo elettrico oscillante in una specifica larghezza di banda ad alta frequenza. Esistono due tipi di trasduttori: singolo elemento trasduttori e matrici di trasduttore. Trasduttori a singolo elemento piezoelettrico possiedono una superficie curva che agisce come una lente di focalizzazione e quindi si concentra energia acustica in una regione definita chiamata la zona focale. Trasduttori a singolo elemento sono molto più economico e più facile da gestire rispetto alle matrici di trasduttore. Questo articolo si concentrerà sui trasduttori a singolo elemento.
La dimensione della zona focale di un trasduttore a singolo elemento dipende dalla proprietà geometriche della lente acustica e la sua frequenza acustica. Per raggiungere una zona focale di millimetro-dimensione con un trasduttore a singolo elemento, ultrasuoni frequenze nella gamma MHz sono generalmente richieste. Purtroppo, onde acustiche a tale frequenza vengono attenuate molto rapidamente quando si propaga in un mezzo tenue come l'aria. Pertanto, onde ad ultrasuoni MHz necessario essere generato e propagato al campione in un materiale più denso come l'acqua. Ciò costituisce la prima sfida di integrare modalità LIPUS ad un microscopio.
Una seconda sfida è di minimizzare le interfacce fisiche tra materiali con diverse impedenze acustiche (che è un prodotto della densità del materiale e la velocità acustica) lungo il sentiero acustico. Queste interfacce possono riflettere, rifrangere, dispersione e assorbire le onde acustiche, che lo rende difficile quantificare la quantità di energia acustica efficacemente consegnato ad un campione. Possono inoltre creare manufatti meccanici indesiderati. Per esempio, riflessioni mancata corrispondenza perpendicolare all'acustica prodotta impedenza interfacce creano onde backpropagating che interferiscono con quelli di propagazione in avanti. Lungo il percorso di interferenza, le onde annullano a vicenda alle regioni fisse degli spazi chiamati nodi e riassumere a alternata regioni chiamate anti-nodi, creando le cosiddette onde stazionarie (Figura 1). È importante per lo sperimentalista essere in grado di controllare o eliminare queste interfacce sperimentali in vitro , come non possono esistere in vivo.
Misura di fluorescenza del reporter ottico è un noto metodo per interrogare i campioni biologici trasparenti in tempo reale e con nessun disturbo fisico. Questo approccio è quindi ideale per gli studi LIPUS come eventuali sonde fisici presente nella zona lisati mediante introdurrà manufatti meccanici. Questo protocollo descrive l'attuazione e il funzionamento del LIPUS ad un microscopio a epifluorescenza commerciale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CERNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>SliceScope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optomechanical components</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HFO series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>DSOX2004A (4-channels 70MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>function generator</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>33500B (20MHz single-channel)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronic Navigation Industries (ENI)</td>
			<td rowspan="2">325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronics &#38; Innovation (E&#38;I)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>focused immersion transdcuers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Benthowave Instrument</td>
			<td>HiFu transducer BII-76 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>Piezo-ceramic or HiFu transducers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Ultrasonic-S-lab</td>
			<td>HiFu transducers made to order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-density Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>VWR 80094-330</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar film 2.5 microns</td>
			<td>Chemplex</td>
			<td>CAT.NO:107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy

Mettendo a fuoco gli impulsi di ultrasuoni a bassa intensità che penetrano i tessuti molli, LIPUS rappresenta una promettente tecnologia biomedica in remoto e in modo sicuro manipolare infornamento neurale, secrezione ormonale e cellule geneticamente riprogrammate. Tuttavia, la traduzione di questa tecnologia per applicazioni mediche attualmente è ostacolata da una mancanza di meccanismi biofisici che mirate senso tessuti e rispondere a LIPUS. Un approccio adatto per identificare questi meccanismi sarebbe utilizzare biosensori ottici in combinazione con LIPUS per determinare sottostanti vie di segnalazione. Tuttavia, l'implementazione LIPUS al microscopio a fluorescenza possono introdurre artefatti indesiderati meccaniche dovuta alla presenza di interfacce fisiche che riflettono, assorbono e rifrangere le onde acustiche. Questo articolo presenta una procedura dettagliata per incorporare LIPUS reperibile in posizione verticale epi-fluorescenza microscopi, riducendo al minimo l'influenza delle interfacce fisiche lungo il percorso acustico. Una procedura semplice è descritta per operare un trasduttore ad ultrasuoni elemento singolo e per portare la zona focale del trasduttore nel punto focale obiettivo. L'utilizzo di LIPUS è illustrato con un esempio dei transienti di calcio LIPUS-indotta in cellule di glioblastoma umano colto misurate usando la formazione immagine del calcio.

Figura 5 è un esempio di esperimento LIPUS multiplexata con formazione immagine del calcio. Le cellule di glioblastoma (A-172) sono state coltivate su pellicola di poliestere EMPM rivestito in terreno di coltura standard (supplementato con 10% siero e 1% antibiotici) e incubate con il reporter fluorescente sensibili del calcio Fluo-4 AM. Le cellule erano imaged utilizzando un obiettivo 10x immersione e illuminata con una sorgente di luce bianca LED e luce di...

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Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy

Bassa intensità ha pulsato ultrasuono stimolazione (LIPUS) è una modalità per stimolazione meccanica non invasiva delle cellule endogene o ingegnerizzate con elevata risoluzione spaziale e temporale. Questo articolo viene descritto come implementare LIPUS ad un microscopio a epifluorescenza e come ridurre al minimo disadattamento di impedenza acustica lungo il percorso di ultrasuono per evitare indesiderati artefatti meccanici.

Multiplexing focalizzato ad ultrasuoni stimolazione con microscopia di fluorescenza

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in meccanobiologia, come il modo in cui i campioni biologici rispondono alle forze meccaniche prodotte dalla stimolazione ecografica a bassa intensità. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette a uno sperimentalista di applicare in modo non invasivo forze meccaniche a un campione e misurare vari perimetri biologici in tempo reale. Per iniziare, praticare lentamente un foro di 12 millimetri nella parte inferiore di un piatto di coltura standard da 35 millimetri utilizzando un trapano a pressione verticale.Una volta forato, rimuovere pezzi di plastica attaccati al fondo del piatto utilizzando una lama, per creare una superficie liscia sul lato esterno. Quindi, applicare un sottile strato di epossidico di grado marino o colla sulla superficie inferiore esterna del piatto. Sopra l'adesivo, posizionare un film di poliestere spesso due punti e cinque micron, premendo saldamente per assicurarsi che l'adesivo si diffonda uniformemente tra il film e la spessa superficie plastica.Tirare delicatamente il film in modo centrifugo con le dita, per creare una superficie piana. Una volta asciugato l'adesivo, sciacquare brevemente il piatto inferiore in poliestere con il 95% di etanolo. Quindi, i raggi UV sterilizzano il piatto posizionandolo sotto una forte sorgente di eccitazione UV da 254 nanometri.Regolare la durata e l'intensità per fornire una dose UV di circa 330 millijoule per centimetro quadrato. Successivamente, diluire una miscela proteica a matrice extracellulare disponibile in commercio con il mezzo di coltura desiderato con un rapporto da uno a 100. Lavorare sul ghiaccio per prevenire la polimerizzazione della matrice e applicare rapidamente 100 microlitri della miscela media sulla pellicola di poliestere.Riposizionare il coperchio sul piatto per mantenere la sterilità. Una volta coperto, incubare le stoviglie di fondo in poliestere rivestite a matrice in una coltura cellulare, incubatore tamponato di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per sei-12 ore. Dopo l'incubazione, aspirare il mezzo in eccesso e seminare direttamente la superficie con le cellule alla densità desiderata.Posizionare un serbatoio dell'acqua sotto l'obiettivo di un microscopio verticale. Quindi, utilizzando componenti optomeccanici disponibili in commercio, posizionare il supporto del campione tra l'obiettivo e il trasduttore. Assicurarsi che le parti mobili e gli attuatori delle fasi di traslazione siano all'esterno del serbatoio o sopra la linea dell'acqua per evitare danni causati dall'acqua.Quindi, riempire il serbatoio con acqua deionizzata e degassata fino al piano orizzontale del portacampioni, prima di utilizzare il trasduttore ad immersione. Utilizzando componenti optomeccanici non canonici disponibili in commercio, assicurarsi che il trasduttore in posizione obliqua rispetto al percorso ottico. Ciò garantirà che tutte le onde riflesse vengano allontanate dal campione.Regolare la frequenza del generatore di funzioni alla frequenza di picco nominale del trasduttore. Quindi, creare un impulso di tensione sinusoidale della durata desiderata e della frequenza di ripetizione, utilizzando la modalità burst del generatore di funzioni. Quindi, regolare la tensione da picco a picco in base al valore desiderato.Assicurarsi che la durata dell'impulso sia inferiore al tempo trascorso tra due impulsi consecutivi. Collegare l'output del generatore di funzioni all'ingresso di un oscilloscopio. Utilizzare l'oscilloscopio per confermare che la forma d'onda corrisponde al segnale desiderato.Quindi, collegare l'uscita del generatore di funzioni all'ingresso di una potenza di un amplificatore RF di dimensioni corretta. Utilizzando una sonda idrofonica che funziona con un intervallo di frequenza e un'intensità acustica compatibili con quella del trasduttore ad ultrasuoni, mettere accuratamente a fuoco la punta della sonda all'interno del campo visivo dell'obiettivo nella posizione del campione. Assicurarsi che sia la sonda che il trasduttore siano immersi nel bagno d'acqua ed eseguire un grossolano pre-allineamento del trasduttore posizionando visivamente il suo asse acustico verso la sonda idrofona.Assicurarsi che la distanza tra i due corrisponda alla lunghezza focale del trasduttore. Non urtare la punta dell'idrofono con nessun oggetto fisico diverso dall'acqua, in quanto ciò altererà il suo rivestimento e influenzerà la misurazione. Quindi, collegare l'uscita dell'idrofono a uno degli ingressi del segnale dell'oscilloscopio.Quindi, collegare il trigger di sincronizzazione dal generatore di funzioni a un altro ingresso oscilloscopio. Visualizzare entrambi i segnali contemporaneamente sull'oscilloscopio. Successivamente, guidare il trasduttore con pochi cicli ad ultrasuoni a basso ciclo di servizio e bassa ampiezza per evitare di danneggiare la sonda.Verificare con il produttore dell'idrofono condizioni di funzionamento sicure per evitare di danneggiare la punta dell'idrofono. Regolare la manopola della divisione S in base al tempo di percorsa dell'ecografia dalla superficie del trasduttore all'idrofono. Cercare un segnale idrofono sull'oscilloscopio dopo il trigger di sincronizzazione.Successivamente, azionare lentamente il trasduttore utilizzando uno stadio XYZ motorizzato o manuale. Posizionare il trasduttore nella posizione correlata al segnale idrofono massimo. Con il fascio ora allineato, misurare l'ampiezza da picco a picco dell'uscita dell'idrofono all'oscilloscopio per varie tensioni che guidano il trasduttore.Assicurarsi di non superare il limite di pressione dell'idrofono. Sostituire il mezzo di coltura della cellula con il tampone di imaging desiderato contenente cinque micromolari di un colorante sensibile al calcio permeante alla cellula, come Fluo-4 AM. Quindi, incubare il piatto di coltura in un incubatore tamponato di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo l'incubazione, lavare accuratamente le cellule con lo stesso tampone privo di colorante.Quindi, posizionare il piatto nel portacampioni. Eccitare le cellule usando l'illuminazione a luce blu a 490 nanometri. Regolare l'intensità di eccitazione e l'esposizione della fotocamera per evitare un eccessivo sbiancamento o saturazione dei pixel.Eseguire l'imaging time-lapse utilizzando un obiettivo di immersione con una lunga distanza di lavoro per una migliore qualità dell'immagine e per ridurre i riflessi indesiderati. Qui, le cellule di glioblastoma sono mostrate su pellicola di poliestere rivestita di matrice extracellulare in un mezzo di coltura standard. Queste cellule sono state incubate con un reporter fluorescente sensibile al calcio.In questa immagine, i punti rossi rappresentano singole celle fluorescenti, identificate utilizzando un software di elaborazione delle immagini. Dopo la stimolazione per 10 secondi con ultrasuoni, sono state visualizzate robuste elevazioni di calcio in molte regioni di interesse. Il numero di regioni di interesse attivate viene mostrato qui nel tempo.A seguito dell'attivazione di 10 secondi con ultrasuoni, circa il 70% delle regioni è stato trovato al di sopra dei valori soglia definiti dall'utente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di allineare il fascio ultrasonico prima di eseguire la misurazione della fluorescenza.

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Synthesis of Phase-shift Nanoemulsions with Narrow Size Distributions for Acoustic Droplet Vaporization and Bubble-enhanced Ultrasound-mediated Ablation

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High-intensity  focused ultrasound (HIFU) is used clinically to thermally ablate tumors. To  enhance localized heating and improve thermal ablation in ...

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Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Sub-nanometrica Resolution Imaging con modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Focused Ion Beam Fabrication of LiPON-based Solid-state Lithium-ion Nanobatteries for In Situ Testing

Focused Ion Beam Fabrication of LiPON-based Solid-state Lithium-ion Nanobatteries for In Situ Testing

Focused Ion Beam fabbricazione di Nanobatteries basati su LiPON litio allo stato solido per test In Situ

Solid-state electrolytes are a promising replacement for current organic liquid electrolytes, enabling higher energy densities and improved safety of ...

Three-Dimensional Ultrasonic Needle Tip Tracking with a Fiber-Optic Ultrasound Receiver

Tracking con un ricevitore di ultrasuono in fibra ottica a punta d'ago ad ultrasuoni tridimensionale

Ultrasound is frequently used for guiding minimally invasive procedures, but visualizing medical devices is often challenging with this imaging modality. ...

Controllable Nucleation of Cavitation from Plasmonic Gold Nanoparticles for Enhancing High Intensity Focused Ultrasound Applications

Nucleazione controllabile di cavitazione da nanoparticelle plasmoniche d'oro per l'aumento ad alta intensità focalizzato applicazioni ad ultrasuoni

In this study, plasmonic gold nanoparticles were simultaneously exposed to pulsed near-infrared laser light and high intensity focused ultrasound (HIFU) ...