Name: multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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우리 박사 미하일 샤 피로 니키타 Reznik 유익한 토론에 대 한 감사. 이 작품은 웨스턴 대학 보건 과학에서 시작 자금에 의해 지원 되었다 고 NIH R21NS101384를 부여 합니다.

1. 성장 어쿠스틱 투명 한 폴리에스터 필름에 셀
<ol><li>수직 프레스-드릴을 사용 하 여 표준 35mm 문화 접시의 하단에 12 m m 구멍 크기를 드릴. 드릴을 천천히 이동 하 고 눈 보호를 착용. (그림 2) 외부 면에 매끄러운 표면을 만들려고 블레이드를 사용 하 여 접시의 바닥에 연결 된 플라스틱의 조각을 제거 합니다.</li>
	<li>해양 학년 에폭시 또는 접시의 외부 바닥 표면에 접착제?...

<ol>
	<li>Elhelf, I. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+intensity+focused+ultrasound:+The+fundamentals,+clinical+applications+and+research+trends.">High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends.</a> Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).</li><li>Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , (2018).</li><li>Duck, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+and+non-medical+protection+standards+for+ultrasound+and+infrasound.">Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).</li><li>Legon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+focused+ultrasound+modulates+the+activity+of+primary+somatosensory+cortex+in+humans.">Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).</li><li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanobiology+of+brain+function.">The mechanobiology of brain function.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).</li><li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+neuromodulation+with+ultrasound?+A+continuum+mechanics+hypothesis.">Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis.</a> Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).</li><li>Tufail, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+pulsed+ultrasound+stimulates+intact+brain+circuits.">Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits.</a> Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).</li><li>Tyler, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+excitation+of+neuronal+circuits+using+low-intensity,+low-frequency+ultrasound.">Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound.</a> PloS One. 3 (10), e3511 (2008).</li><li>Suarez Castellanos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+ultrasound+stimulation+of+secretory+events+from+pancreatic+beta+cells.">Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells.</a> Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).</li><li>Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+Stimulation+of+Insulin+Release+from+Pancreatic+Beta+Cells+as+a+Potential+Novel+Treatment+for+Type+2+Diabetes.">Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).</li><li>Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonogenetics+is+a+non-invasive+approach+to+activating+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 6, 8264 (2015).</li><li>Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Piezo1+but+Not+NaV1.2+Channels+by+Ultrasound+at+43+MHz.">Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).</li><li>Kubanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+modulates+ion+channel+currents.">Ultrasound modulates ion channel currents.</a> Scientific Reports. 6, 24170 (2016).</li><li>Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+response+of+model+lipid+membranes+to+ultrasonic+radiation+force.">Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force.</a> PloS One. 8 (10), e77115 (2013).</li><li>Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic+Neuromodulation+Causes+Widespread+Cortical+Activation+via+an+Indirect+Auditory+Mechanism.">Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism.</a> Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).</li><li>O'Brien, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-biophysics+mechanisms.">Ultrasound-biophysics mechanisms.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corrigendum:+Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 8, 16148 (2017).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 3, 736 (2012).</li><li>Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+mechanisms+of+millimeter+wave+stimulation+of+excitable+cells.">Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells.</a> Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).</li><li>Hwang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+contactless+high+frequency+ultrasound+microbeam+stimulation+for+determination+of+invasion+potential+of+breast+cancer+cells.">Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).</li><li>Nakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+ratiometric+fluorescent+thermometer+with+wide+range+and+rapid+response.">Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response.</a> PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).</li><li>Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+intracellular+temperature+using+green+fluorescent+protein.">Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein.</a> Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).</li></ol>

집중 된 초음파의 주요 장점은 비 접촉 spatio 시간적 고정밀 생물학 견본에 기계적 또는 열 에너지를 전달 하는 기능입니다. 기계적으로 자극 하기 위한 다른 기술을 일반적으로 고용 침략 물리적 프로브 (예를 들어, 셀 파고) 세포 또는 외국 개체 (예: 광학 족집게)와 높은 에너지 레이저 광선의 상호 작용을 요구 한다. 마그네틱 난방 생물 학적 샘플 내부 특정 공간 위치를 열 수 있습?...

많은 질병 침략 적 의료 개입의 일종이 필요합니다. 이 절차는 자주 비싼, 위험, 회복 기간을 필요로 하 고 따라서 의료 시스템에 부담을 추가 합니다. 비-침략 적 치료 modalities 기존의 수술을 안전 하 고 더 싼 대안을 제공 하 가능성이 있다. 그러나, 현재 비-침략 적 접근 pharmacotherapy 또는 transcranial 자석 자극 등 종종 조직 침투, spatiotemporal 해상도 및 원치 않는 오프 대상 효과 간에 의해 제한 됩니다. 이러한 맥락에서 집중 된 초음파 구성 하는 생물 학적 기능을 조작 하는 잠재력을 가진 유망한 비-침략 적 기술 제한 대상에서 효과 높은 spatiotemporal 정확도와 조직 깊숙한.
집중 된 초음파 자극 정확한 위치에서 음향 에너지를 제공 구성 생물 깊숙한. 음향 펄스 매개 변수에 따라이 에너지는 다양 한 의료 사용을 할 수 있습니다. 예를 들어, 식품 및 의약품 안전 청은의 사용을 승인 고 강도 집중 초음파 (장내) 전립선 종양, 뇌 영역 떨림 발생, 자 궁 fibroids 및 통증을 일으키는 뼈 전이1 신경 엔딩의 열 제거에 대 한 . 장내 중재 microbubble 현상 또한 체계적으로 관리 치료2의 대상된 배달에 대 한 혈액-뇌 장벽 정도 여는 데 사용 됩니다. 공간-피크 펄스 평균 강도 (내가sppa)와 공간-피크 시간 평균 강도 (내가spta) 장내 응용 프로그램은 일반적으로 몇 kW cm-2 위 및 펄스 압력 MPa의 몇몇 10의 생산에 사용. 이러한 강도 값은 멀리 위에 FDA 승인 난sppa 고spta 진단 초음파, 190 W c m-2 720 mW cm-2,3각각에 대 한 제한. 반면, 최근 연구 또는 진단 초음파 강도 한계 (LIPUS)의 범위에 가까운 수 수 효과적으로 그리고 안전 하 게 원격으로 조작 신경 발사4는 그 비 파괴적인 펄스 초음파 자극 5,6,7,8, 호르몬 분 비9,10 및 bioengineered 세포11. 그러나, 세포질이 고 분자 기계 장치는 셀 감지 및 초음파에 응답 유지 불분명, LIPUS의 임상 번역 제외. 따라서, 지난 몇 년 동안, 인공 막, 배양된 세포 및 동물 초음파 자극된의 연구 생물을 기세를 얻고 있다 및 생리 적 프로세스 LIPUS12,13, 변조 , 1415.
물리적 매체를 통해 전파 진동 소리에 의하여 이루어져 있다. 초음파는 이상 인간의 가청 범위 (즉, 20 k h z) 주파수를 가진 소리 이다. 실험실 환경에서 초음파 파도 일반적으로 특정 높은 주파수 대역폭에서 진동 전기 필드에 대 한 응답에서 진동 하는 물자를 포함 하는 압 전 트랜스듀서에 의해 생산 됩니다. 변환기의 두 가지 유형의 존재: 요소 변환기 및 변환기 배열. 단일 요소 압 전 트랜스듀서는 초점 렌즈 역할을 하며 따라서 음향 에너지를 집중 하 고 초점 영역 이라고 정의 된 지역으로 곡선된 표면 소유. 단일 요소 변환기는 훨씬 저렴 하 고 변환기 배열 보다 운영 하기가 있습니다. 이 문서는 단일 요소 변환기에 집중할 것 이다.
집중 된 단일 요소 변환기의 초점 영역의 크기에는 음향 주파수와 음향 렌즈의 기하학적 속성에 따라 달라 집니다. 단일 요소 변환기와 밀리미터 크기 초점 영역을 달성 하기 위해 초음파 주파수 MHz 범위에는 일반적으로 필요 합니다. 불행 하 게도, 같은 주파수에서 청각 파 공기 같은 얇은 매체에 전파 될 때 감쇠 매우 빠르게 있습니다. 따라서, MHz 초음파 파도 생성 하 고 물과 같은 농도 자료 샘플을 전파 해야 합니다. 이 구성 LIPUS 적임 현미경에 통합에 첫 도전 합니다.
두 번째 도전은 다른 음향 임피던스 (재료 밀도 및 음향 속도의 제품에는) 음향 경로 재료 사이의 물리적 인터페이스를 최소화 하는 것 이다. 이러한 인터페이스 수 반영, 굴절, 분산 하 고 샘플을 효과적으로 전달 하는 음향 에너지의 양을 계량 하 고 어려운 청각 파 흡수. 그들은 또한 원치 않는 기계 공예품을 만들 수 있습니다. 예를 들어, 반사 생산된 음향에 수직 불일치 임피던스 인터페이스는 backpropagating 파도 앞으로 전파 하는 것을 방해 하는 만듭니다. 간섭 경로 따라 파도 취소 서로 노드 및 안티 노드, 지역 교류에서 합계 라는 공간의 고정된 지역에서 소위 서 파도 (그림 1)를 만들어. 그것을 제어 하거나 이러한 실험적인 인터페이스 시험관 에 비보없을 수 있습니다 제거 수 experimentalist에 대 한 중요 하다.
형광 측정 광 기자 들의 투명 한 생물 학적 샘플 없이 실제 소요와 실시간으로 잘 알려진 방법입니다. 이 접근은 따라서 어떤 물리적 프로브 sonicated 지역에 기계적 유물 소개로 LIPUS 연구에 이상적입니다. 이 프로토콜 구현 및 상업 epi-형광 현미경 LIPUS의 운영에 설명합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CERNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>SliceScope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optomechanical components</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HFO series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>DSOX2004A (4-channels 70MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>function generator</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>33500B (20MHz single-channel)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronic Navigation Industries (ENI)</td>
			<td rowspan="2">325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronics &#38; Innovation (E&#38;I)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>focused immersion transdcuers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Benthowave Instrument</td>
			<td>HiFu transducer BII-76 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>Piezo-ceramic or HiFu transducers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Ultrasonic-S-lab</td>
			<td>HiFu transducers made to order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-density Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>VWR 80094-330</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar film 2.5 microns</td>
			<td>Chemplex</td>
			<td>CAT.NO:107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy

집중 함으로써 부드러운 조직에 침투 하는 저 강도 초음파 펄스, LIPUS 원격으로 그리고 안전 하 게 신경 발포, 호르몬 분 비 및 유전으로 재설정 셀을 조작 하는 유망한 생물 의학 기술을 나타냅니다. 그러나,에 의해 의료 응용 프로그램에 대 한이 기술의 번역 방해 현재는 생물 메커니즘의 부족 및 대상 조직 감각 LIPUS에 응답. 이러한 메커니즘을 식별 하는 적당 한 접근 LIPUS와 함께에서 광학 바이오 센서를 사용 하 여 기본 신호 경로 결정 하는 것입니다. 그러나, LIPUS를 구현 하는 형광 현미경에 물리적 인터페이스를 반영 하 고, 흡수 하 고 청각 파의 굴절의 존재로 인해 원치 않는 기계적 유물을 발생할 수 있습니다. 이 문서 음향 경로 따라 물리적 인터페이스의 영향을 최소화 하면서 상용 직 립 피 형광 현미경에 LIPUS를 통합 하는 단계별 절차를 제공 합니다. 단일 요소 초음파 트랜스듀서를 운영 하 고 객관적인 초점으로 변환기의 초점 영역을가지고 간단한 절차를 설명 합니다. LIPUS 사용 하 여 칼슘 이미징 사용 하 여 측정 하는 교양된 인간 세포종 세포에서 칼슘 LIPUS 유도 과도의 예를 보여 줍니다.

그림 5 LIPUS 실험 칼슘 영상과 다중화의 예입니다. 세포종 세포 (A-172) 했다 EMPM 코팅 폴리에스터 필름에 (10% 세럼과 1% 항생제로 보충) 표준 문화 매체에 성장과 칼슘-민감한 형광 기자 Fluo-4와 incubated 오전. 셀은 10 배 집중 렌즈를 사용 하 여 백색 LED 광원으로 조명 그리고 몇 군데와 형광 빛 표준 GFP 필터 세트를 사용 하 여 수집 되었다. LIPUS 158 V 피크 대...

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Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy

낮은-강도 펄스 초음파 자극 (LIPUS)은 높은 공간 및 시간적 해상도 생 또는 조작 셀의 비-침략 적 기계적 자극에 대 한 양식 적임 이다. 이 문서는 피 형광 현미경 LIPUS를 구현 하는 방법 및 원치 않는 기계적 유물을 방지 하기 위해 초음파 경로 따라 음향 임피던스 불일치를 최소화 하는 방법에 설명 합니다.

형광 현미경과 초음파 자극에 초점을 맞춘 멀티플렉싱

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely ...

이 방법은 생물학적 샘플이 저강도 초음파 자극에 의해 생성된 기계적 힘에 어떻게 반응하는지와 같은 메카노생물학의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 실험가가 비침습적으로 기계적 힘을 샘플에 적용하고 실시간으로 다양한 생물학적 경계를 측정할 수 있다는 것입니다. 먼저 수직 프레스 드릴을 사용하여 표준 35mm 배양 접시 바닥에 12mm 구멍을 천천히 드릴링합니다.일단 드릴링되면, 블레이드를 사용하여 접시 의 바닥에 부착 된 플라스틱 조각을 제거하고 외부 측에 매끄러운 표면을 만듭니다. 다음으로, 접시의 외부 바닥 표면에 해양 등급 에폭시 또는 접착제의 얇은 층을 적용합니다. 접착제 위에 폴리에스테르의 2점-5미크론 두께의 필름을 단단히 눌러 접착제가 필름과 두꺼운 플라스틱 표면 사이에 균등하게 퍼지도록 합니다.부드럽게 손가락으로 원심 방식으로 필름을 당겨 평평한 표면을 만듭니다. 접착제가 건조되면 폴리에스테르 바닥 접시를 95%에탄올로 간략하게 헹구습니다. 이어서, UV는 254나노미터 UV 흥분소기 공급원 아래에 배치하여 접시를 살균한다.지속 시간과 강도를 조정하여 평방 센티미터당 약 330 밀리줄의 UV 용량을 제공합니다. 다음으로, 1 대 100의 비율로 원하는 배양 배지와 시판적으로 이용 가능한 세포외 매트릭스 단백질 혼합물을 희석한다. 매트릭스 중합을 방지하기 위해 얼음에 작용하고, 신속하게 폴리 에스테르 필름에 중간 혼합물의 100 마이크로 리터를 적용합니다.뚜껑을 접시에 다시 놓아 멸균을 유지합니다. 일단 덮여, 세포 배양에서 매트릭스 코팅, 폴리 에스테르 바닥 접시를 인큐베이션, 이산화탄소 완충 인큐베이터는 6 ~ 12 시간 동안 섭씨 37도에서. 인큐베이션 후, 과잉 배지를 흡인하고 원하는 밀도로 세포로 표면을 직접 시드한다.수직 현미경의 목표 아래에 물 탱크를 놓습니다. 그런 다음, 시판적으로 이용 가능한 광구성 성분을 사용하여, 샘플 홀더를 목표와 트랜스듀서 사이에 배치한다. 이동 부품과 번역 단계의 액추에이터가 물 손상을 피하기 위해 탱크 외부 또는 물 선 위에 있는지 확인하십시오.그런 다음, 침수 변환기를 활용하기 전에, 샘플 홀더의 수평 평면까지 탈이온 화 및 탈기 물로 탱크를 채웁니다. 비부식성, 시판되는 광섬유 성분을 사용하여 광학 경로와 관련하여 경사 위치에 있는 트랜스듀서가 있는지 확인하십시오. 이렇게 하면 반사된 파도가 샘플에서 멀리 이동되도록 합니다.함수 생성기의 주파수를 트랜스듀서의 명목 피크 주파수로 조정합니다. 그런 다음 함수 발생기의 버스트 모드를 사용하여 원하는 지속 시간 및 반복 주파수의 부비동 전압 펄스를 만듭니다. 다음으로 피크-투-피크 전압을 원하는 값으로 조정합니다.펄스 지속 시간이 두 개의 연속 펄스 사이의 경과 시간보다 짧은지 확인합니다. 함수 생성기의 출력을 오실로스코프의 입력에 연결합니다. 오실로스코프를 사용하여 파형이 원하는 신호에 해당하는지 확인합니다.그런 다음, 제대로 크기의 RF 증폭기의 힘의 입력에 함수 생성기의 출력을 연결합니다. 초음파 트랜스듀서와 호환되는 주파수 범위와 음향 강도로 작동하는 하이드로폰 프로브를 사용하여 샘플 위치에서 목표 시야 내에서 프로브의 팁을 신중하게 집중시합니다. 프로브와 트랜스듀서가 수조에 침지되어 음향 축을 하이드로폰 프로브쪽으로 시각적으로 배치하여 트랜스듀서의 사전 정렬을 수행해야 합니다.둘 사이의 거리가 트랜스듀서의 초점 거리와 일치하는지 확인합니다. 이 코팅을 변경하고 측정에 영향을 미치기 때문에, 물 이외의 물리적 개체와 하이드로폰의 끝을 범프하지 마십시오. 다음으로, 수중기 출력을 오실로스코프의 신호 입력 중 하나에 연결합니다.그런 다음 함수 생성기에서 다른 오실로스코프 입력에 동기화 트리거를 연결합니다. 두 신호를 오실로스코프에서 동시에 시각화합니다. 다음으로, 프로브를 손상시키지 않도록 낮은 듀티 사이클과 낮은 진폭에서 초음파 사이클이 거의 없는 트랜스듀서를 운전합니다.하이드로폰 팁이 손상되지 않도록 하이드로폰 제조업체의 안전한 작동 조건을 확인하십시오. 트랜스듀서 의 표면에서 하이드로폰까지 초음파의 이동 시간에 따라 S 부문 노브를 조정합니다. 동기화 트리거 후 오실로스코프에서 수중전화 신호를 찾습니다.다음으로, 전동 또는 수동 XYZ 단계를 사용하여 트랜스듀서를 천천히 작동시합니다. 최대 수중전화 신호와 상관관계가 있는 위치에 트랜스듀서를 배치합니다. 빔이 정렬되면 오실로스코프에서 하이드로폰 출력의 피크-피크 진폭을 측정하여 트랜스듀서를 구동하는 다양한 전압을 측정합니다.하이드로폰의 압력 제한을 초과하지 않도록 하십시오. 세포의 배양 배지를 플루오-4 AM과 같은 세포 퍼미디드 칼슘 에 민감한 염료의 5마이크로몰라를 포함하는 원하는 이미징 버퍼로 대체한다. 그런 다음 이산화탄소 완충 인큐베이터에서 1시간 동안 섭씨 37도의 배양 접시를 배양합니다. 인큐베이션에 따라 염료가 없는 동일한 버퍼로 셀을 조심스럽게 씻으실 수 있습니다.그런 다음 접시를 샘플 홀더에 놓습니다. 490 나노미터에서 청색광 조명을 사용하여 세포를 흥분시킵니다. 과도한 표백이나 픽셀 채도를 피하기 위해 흥분 강도와 카메라 노출을 조정합니다.더 나은 이미지 품질을 위해 긴 작업 거리로 몰입 목표를 사용하여 시간 경과 이미징을 수행하고 원치 않는 반사를 줄입니다. 여기서, 교모세포종 세포는 표준 배양 배지에서 세포외 매트릭스 코팅 폴리에스테르 필름에 도시된다. 이 세포는 칼슘에 민감한 형광 기자와 함께 배양되었습니다.이 이미지에서 빨간색 점은 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 식별된 개별 형광 세포를 나타냅니다. 초음파로 10 초 동안 자극을 받으면 많은 관심 지역에서 강력한 칼슘 고도가 시각화되었습니다. 관심 있는 활성화된 영역의 수는 시간이 지남에 따라 여기에 표시됩니다.초음파를 가진 10 초 활성화에 따라, 지역의 대략 70%는 사용자 정의 임계값 이상인 것으로 나타났습니다. 이 절차를 시도하는 동안 형광 측정을하기 전에 초음파 빔을 정렬하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

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