Name: multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Vi takker Dr. Mikhail Shapiro og Nikita Reznik for fruktbart diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av oppstart midler fra Western University of Health Sciences og NIH gi R21NS101384.

1. voksende celler på akustisk gjennomsiktig Polyester Film
<ol><li>Bore en 12 mm hull størrelse på bunnen av en målestokk 35 mm kultur parabol med en loddrett trykk-drill. Flytt bore sakte og bære vernebriller. Fjerne biter av plast festet til bunnen av parabolen med et blad for å lage en glatt overflate på den eksterne siden (figur 2).</li>
	<li>Påfør et tynt lag av marine-grade epoxy eller lim på at eksterne undersiden av retten.</li>
	<li>Sett en film av polyester (2,5 µm ty...

<ol>
	<li>Elhelf, I. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+intensity+focused+ultrasound:+The+fundamentals,+clinical+applications+and+research+trends.">High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends.</a> Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).</li><li>Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , (2018).</li><li>Duck, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+and+non-medical+protection+standards+for+ultrasound+and+infrasound.">Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).</li><li>Legon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+focused+ultrasound+modulates+the+activity+of+primary+somatosensory+cortex+in+humans.">Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).</li><li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanobiology+of+brain+function.">The mechanobiology of brain function.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).</li><li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+neuromodulation+with+ultrasound?+A+continuum+mechanics+hypothesis.">Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis.</a> Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).</li><li>Tufail, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+pulsed+ultrasound+stimulates+intact+brain+circuits.">Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits.</a> Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).</li><li>Tyler, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+excitation+of+neuronal+circuits+using+low-intensity,+low-frequency+ultrasound.">Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound.</a> PloS One. 3 (10), e3511 (2008).</li><li>Suarez Castellanos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+ultrasound+stimulation+of+secretory+events+from+pancreatic+beta+cells.">Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells.</a> Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).</li><li>Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+Stimulation+of+Insulin+Release+from+Pancreatic+Beta+Cells+as+a+Potential+Novel+Treatment+for+Type+2+Diabetes.">Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).</li><li>Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonogenetics+is+a+non-invasive+approach+to+activating+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 6, 8264 (2015).</li><li>Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Piezo1+but+Not+NaV1.2+Channels+by+Ultrasound+at+43+MHz.">Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).</li><li>Kubanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+modulates+ion+channel+currents.">Ultrasound modulates ion channel currents.</a> Scientific Reports. 6, 24170 (2016).</li><li>Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+response+of+model+lipid+membranes+to+ultrasonic+radiation+force.">Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force.</a> PloS One. 8 (10), e77115 (2013).</li><li>Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic+Neuromodulation+Causes+Widespread+Cortical+Activation+via+an+Indirect+Auditory+Mechanism.">Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism.</a> Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).</li><li>O'Brien, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-biophysics+mechanisms.">Ultrasound-biophysics mechanisms.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corrigendum:+Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 8, 16148 (2017).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 3, 736 (2012).</li><li>Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+mechanisms+of+millimeter+wave+stimulation+of+excitable+cells.">Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells.</a> Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).</li><li>Hwang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+contactless+high+frequency+ultrasound+microbeam+stimulation+for+determination+of+invasion+potential+of+breast+cancer+cells.">Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).</li><li>Nakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+ratiometric+fluorescent+thermometer+with+wide+range+and+rapid+response.">Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response.</a> PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).</li><li>Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+intracellular+temperature+using+green+fluorescent+protein.">Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein.</a> Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).</li></ol>

Hovedfordelen av fokusert ultralyd er dens evne til å levere ikke-invasively mekanisk og/eller termisk energi til biologiske prøver med høy spatio-temporale presisjon. Andre teknikker skal mekanisk stimulere cellene vanligvis ansette invasiv fysiske sonder (f.eks celle-poking) eller krever samspillet av høy energi laserstråler med uvedkommende gjenstander (f.eks optisk pinsett). Magnetisk oppvarming kan varme bestemte romlige steder inne biologiske prøver men tilstedeværelsen av utenlandske magne...

Mange sykdommer krever noen form for invasiv medisinsk intervensjon. Disse prosedyrene er ofte dyre, risikabelt, krever utvinning perioder og dermed legge en byrde til helsevesen. Ikke-invasive terapeutiske modaliteter har potensial til å gi tryggere og billigere alternativer til konvensjonelle kirurgiske prosedyrer. Men er nåværende ikke-invasiv tilnærminger som farmakoterapi eller Transkraniell magnetisk stimulering ofte begrenset av avveininger mellom vev penetrasjon, spatiotemporal oppløsning og uønskede off-målet effekter. I denne sammenheng en fokusert ultralyd utgjør en lovende ikke-invasiv teknologi med potensial til å manipulere biologiske funksjoner dypt inne vev med høy spatiotemporal nøyaktighet og begrenset off-målet effekter.
Fokusert ultralyd stimulering består av levere akustisk energi på nøyaktige dypt inne levende organismer. Avhengig av akustisk puls parametere, kan denne energien har en rekke medisinske bruksområder. For eksempel, har Food and Drug Administration godkjent bruk av høy intensitet fokusert ultralyd (HiFU) for termisk ablasjon prostatakreft, tremor-forårsaker områder av hjernen, livmor fibroids og smerte-forårsaker nerveender i benmetastaser1 . HiFu-mediert microbubble kavitasjon brukes også transiently åpne blod - hjerne barrieren for målrettet levering av systemisk-administrert therapeutics2. Romlig-peak puls-gjennomsnittlig intensiteten (jegsppa) og romlig-peak timelige gjennomsnittet intensitet (jegspta) brukes for HiFU programmer er vanligvis over flere kW cm-2 og produsere pulstrykk på flere titalls MPa. Disse intensitetsverdiene er langt over FDA-godkjent jegsppa og jegfikk også spta grenser for diagnostiske ultralyd 190 W cm-2 og 720 mW cm-2, henholdsvis3. I kontrast, har nyere studier vist at ikke-destruktiv pulserende ultralyd stimulering som er i eller i nærheten av en rekke diagnostiske ultralyd intensitet grenser (LIPUS) kan være effektive eksternt og sikkert manipulere nevrale avfyring4, 5,6,7,8, hormonelle sekret9,10 og bioengineered celler11. Likevel, mobilnettet og molekylære mekanismer som cellene forstand og svare på ultralyd forblir uklart, utelukker klinisk oversettelse av LIPUS. Derfor i de siste årene, studier av kunstige membraner, kultivert celler og dyr stimulert med ultralyd har steget å avsløre Biofysiske og fysiologiske prosesser modulert av LIPUS12,13, 14,15.
Lyd består av en vibrasjon overføres via et fysisk medium. Ultralyd er en lyd med en frekvens over menneskelige hørbare området (dvs. over 20 kHz). I en laboratorium, er ultralyd bølger vanligvis produsert av Piezoelektriske transdusere som inneholder et materiale som vibrerer som svar på en elektrisk felt svingte i en bestemt høyfrekvente båndbredde. To typer transdusere finnes: elementet transdusere og transducer arrays. Enkeltelement Piezoelektriske transdusere har en buet overflate som fungerer som en fokus linse og dermed konsentrater akustiske energien i et definert område kalt fokus sonen. Enkeltelement transdusere er mye billigere og enklere å betjene enn transducer arrays. Denne artikkelen vil fokusere på ett element transdusere.
Størrelsen på fokus sonen for en fokusert enkeltelement svinger avhenger av geometriske egenskapene for akustisk linsen og dens akustisk frekvens. For å oppnå en millimeter størrelse fokal sone med et enkeltelement svinger, er ultralyd frekvenser i MHz-området generelt. Dessverre, akustiske bølger på slike frekvenser er svært raskt svekket når overføres i en spinkel medium som luft. Dermed må MHz ultralyd bølger genereres og overført til prøven i tettere materialer som vann. Dette utgjør den første utfordringen integrere LIPUS modalitet til et mikroskop.
En annen utfordring er å redusere fysisk grensesnitt mellom materialer med ulike akustisk impedances (som er et produkt av stofftetthet og akustisk hastigheten) langs akustisk banen. Disse grensesnittene kan gjenspeile, refract, scatter og absorbere akustiske bølger, gjør det vanskelig å kvantifisere mengden akustisk energi effektivt levert et utvalg. De kan også opprette uønsket mekaniske gjenstander. For eksempel skape refleksjoner produsert vinkelrett akustisk mismatch impedans grensesnitt backpropagating bølger som forstyrrer fremover-spre seg. Langs forstyrrelser banen avbryte bølgene hverandre fast regioner av områder kalt noder og oppsummere på vekslende regioner kalt anti-noder, opprette såkalte stående bølger (figur 1). Det er viktig for experimentalist å kontrollere eller eliminere disse eksperimentelle grensesnitt i vitro som de ikke kanskje eksisterer i vivo.
Fluorescens måling av optisk journalister er en velkjent metode å forhøre gjennomsiktig biologiske prøver i sanntid og med ingen fysisk forstyrrelser. Denne tilnærmingen er dermed ideelt for LIPUS studier som noen fysiske sonder i sonicated området vil introdusere mekaniske gjenstander. Denne protokollen beskriver implementering og drift av LIPUS til kommersielle epi-fluorescens mikroskop.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CERNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>SliceScope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optomechanical components</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HFO series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>DSOX2004A (4-channels 70MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>function generator</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>33500B (20MHz single-channel)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronic Navigation Industries (ENI)</td>
			<td rowspan="2">325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronics &#38; Innovation (E&#38;I)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>focused immersion transdcuers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Benthowave Instrument</td>
			<td>HiFu transducer BII-76 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>Piezo-ceramic or HiFu transducers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Ultrasonic-S-lab</td>
			<td>HiFu transducers made to order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-density Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>VWR 80094-330</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar film 2.5 microns</td>
			<td>Chemplex</td>
			<td>CAT.NO:107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy

Ved å fokusere lav intensitet ultralyd pulser som trenge myke vev, representerer LIPUS en lovende biomedisinsk teknologi eksternt og sikkert manipulere nevrale avfyring, hormonelle sekret og genetisk omprogrammeres celler. Imidlertid er oversettelsen av denne teknologien for medisinske anvendelser er hemmet av mangel Biofysiske mekanismer som målrettet vev følelse og svare på LIPUS. En passende tilnærming til å identifisere disse mekanismene vil være å bruke optisk biosensors sammen med LIPUS til å angi underliggende signalveier. Men kan implementere LIPUS til fluorescens mikroskop introdusere uønsket mekaniske gjenstander av fysiske grensesnitt som gjenspeiler, absorbere og refract akustiske bølger. Denne artikkelen presenterer en fremgangsmåte for å bygge LIPUS til kommersielt tilgjengelig oppreist epi-fluorescens mikroskop samtidig minimere påvirkning av fysiske grensesnitt langs akustisk banen. En enkel prosedyre er beskrevet å operere en ett element ultralyd svinger og få fokus sonen svingeren i objektive fokuspunkt. Bruk av LIPUS er illustrert med et eksempel på LIPUS-indusert kalsium transienter i kultivert menneskelig glioblastom celler målt med kalsium imaging.

Figur 5 er et eksempel på LIPUS eksperiment multiplekset med kalsium imaging. Glioblastom celler (A-172) ble dyrket på EMPM belagt polyester film i standard kultur medium (supplert med 10% serum og 1% antibiotika), og inkubert med kalsium-sensitive fluorescerende reporter Fluo-4 AM. Cellene ble fotografert med en 10 X nedsenking linsen og opplyst med en hvit LED-lyskilde og fluorescens lys ble samlet inn med en standard GFP filter. LIPUS ble brukt av manuel...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy

Lav intensitet pulserende ultralyd stimulering (LIPUS) er en modalitet for ikke-invasiv mekanisk stimulering av endogene eller utviklet celler med høy romlig og tidsmessige oppløsning. Denne artikkelen beskriver hvordan å implementere LIPUS til en epi-fluorescens mikroskop og minimere akustisk impedans mismatch langs stien ultralyd for å hindre uønsket mekaniske gjenstander.

Multiplexing fokusert ultralyd stimulering med fluorescens mikroskopi

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i mekanobiologi, for eksempel hvordan biologiske prøver reagerer på mekaniske krefter produsert av ultralydstimulering med lav intensitet. Den største fordelen med denne teknikken er at det tillater en eksperimentalist å ikkeinvasivt bruke mekaniske krefter på en prøve og måle ulike biologiske omkretser i sanntid. For å begynne, sakte bore en 12 millimeter hull på bunnen av en standard 35 millimeter kultur parabolen ved hjelp av en vertikal trykk drill.Når boret, fjern biter av plast festet til bunnen av parabolen ved hjelp av et blad, for å skape en jevn overflate på den ytre siden. Deretter påfør et tynt lag av marine-grade epoxy eller lim på den ytre bunnen av parabolen. På toppen av limet, plasser en to-punkts-fem-mikron tykk film av polyester, trykke fast for å sikre at limet sprer seg jevnt mellom filmen og den tykke plastoverflaten.Trekk forsiktig filmen på en sentrifugal måte med fingrene, for å skape en flat overflate. Når limet har tørket, skyll kort polyesterbunnsfatet med 95% etanol. Deretter steriliserer UV parabolen ved å plassere den under en sterk 254 nanometer UV-eksitasjonskilde.Juster varighet og intensitet for å levere en UV-dose på ca. 330 millijouler per kvadratcentimeter. Deretter fortynner du en kommersielt tilgjengelig ekstracellulær matriseproteinblanding med ønsket kulturmedium i forholdet mellom en og 100. Arbeid på is for å hindre matrisepolymerisering, og bruk raskt 100 mikroliter av den mellomstore blandingen på polyesterfilmen.Sett lokket tilbake på fatet for å opprettholde steriliteten. Når den er dekket, inkuberer du de matrisebelagte polyesterbunnsrettene i en cellekultur, karbondioksidbufret inkubator ved 37 grader Celsius i seks til 12 timer. Etter inkubasjon, aspirer overflødig medium og frø overflaten direkte med celler med ønsket tetthet.Plasser en vanntank under målet om et oppreist mikroskop. Deretter, ved hjelp av kommersielt tilgjengelige optometriske komponenter, plasser prøveholderen mellom målet og svingeren. Pass på at de bevegelige delene og aktuatorene i oversettelsesfasene enten er utenfor tanken eller over vannledningen for å unngå vannskader.Fyll deretter tanken med deionisert og avgasset vann opp til prøveholderens horisontale plan, før du bruker nedsenkingstransduseren. Bruk ikke-korrosive, kommersielt tilgjengelige optomekaniske komponenter, sørg for at svingeren i skrå stilling med hensyn til den optiske banen. Dette vil sikre at eventuelle reflekterte bølger vil bli rettet bort fra prøven.Juster frekvensen til funksjonsgeneratoren til svingerens nominelle toppfrekvens. Deretter oppretter du en sinusformet spenningspuls av ønsket varighet og repetisjonsfrekvens, ved hjelp av burst-modusen til funksjonsgeneratoren. Deretter justerer du topp-til-topp-spenning til ønsket verdi.Kontroller at pulsvarigheten er kortere enn forløpt tid mellom to påfølgende pulser. Koble utgangen på funksjonsgeneratoren til inngangen til et oscilloskop. Bruk oscilloskopet til å bekrefte at bølgeformen tilsvarer ønsket signal.Deretter kobler du utgangen på funksjonsgeneratoren til inngangen til en effekt av en RF-forsterker i riktig størrelse. Bruk en hydrofonsonde som opererer med et frekvensområde og akustisk intensitet som er kompatibel med ultralydtransduseren, og ta forsiktig sondens spiss i fokus innenfor målets synsfelt på prøvens posisjon. Kontroller at både sonde og transduser er nedsenket i vannbadet og utfør en brutto forjustering av svingeren ved å visuelt plassere sin akustiske akse mot hydrofonproben.Pass på at avstanden mellom de to stemmer overens med svingerens brennvidde. Ikke bump spissen av hydrofonen med noen fysisk gjenstand annet enn vann, da dette vil endre belegget og påvirke målingen. Deretter kobler du hydrofonutgangen til en av oscilloskopets signalinngang.Deretter kobler du synkroniseringsutløseren fra funksjonsgeneratoren til en annen oscilloskopinngang. Visualiser begge signalene samtidig på oscilloskopet. Deretter kjører du svingeren med få ultralydsykluser ved en lav driftssyklus og lav amplitude for å unngå å skade sonden.Sjekk med hydrofonprodusentens sikre driftsforhold for å unngå å skade hydrofonspissen. Juster S-divisjonsknappen i henhold til ultralydets reisetid fra transduserens overflate til hydrofonen. Se etter et hydrofonsignal på oscilloskopet etter synkroniseringsutløseren.Deretter aktiverer du svingeren langsomt ved hjelp av et motorisert eller manuelt XYZ-stadium. Plasser svingeren i den posisjonen som korrelerer med det maksimale hydrofonsignalet. Med strålen nå justert, måle topp-til-topp amplitude av hydrofonutgangen på oscilloskopet for ulike spenninger som driver svingeren.Pass på at du ikke overskrider trykkgrensen på hydrofonen. Erstatt cellens kulturmedium med ønsket bildebuffer som inneholder fem mikromos av et cellepermeant, kalsiumfølsomt fargestoff, for eksempel Fluo-4 AM. Deretter inkubere kulturretten i en karbondioksidbufret inkubator ved 37 grader Celsius i en time. Etter inkubasjon vasker du forsiktig celler med samme buffer uten fargestoff.Deretter plasserer du parabolen i prøveholderen. Opphisse cellene ved hjelp av blått lys belysning på 490 nanometer. Juster eksitasjonsintensiteten og kameraeksponeringen for å unngå overdreven bleking eller pikselmetning.Utfør bildebehandling med tidsforløp ved hjelp av et nedsenkingsmål med lang arbeidsavstand for bedre bildekvalitet, og for å redusere uønskede refleksjoner. Her er glioblastomceller vist på ekstracellulær matrisebelagt polyesterfilm i standard kulturmedium. Disse cellene har blitt inkubert med en kalsiumsensitiv fluorescerende reporter.I dette bildet representerer de røde prikkene individuelle fluorescerende celler, identifisert ved hjelp av en bildebehandlingsprogramvare. Ved stimulering i 10 sekunder med ultralyd ble robuste kalsiumøkninger visualisert i mange områder av interesse. Antall aktiverte interesseområder vises her over tid.Etter 10-sekunders aktivering med ultralyd, ble ca 70% av regionene funnet å være over brukerdefinerte terskelverdier. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å justere ultralydstrålen før du gjør fluorescensmåling.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Engineering

Unit 1

Sound

SCIENTISTS IN ACTION

Synthesis of Phase-shift Nanoemulsions with Narrow Size Distributions for Acoustic Droplet Vaporization and Bubble-enhanced Ultrasound-mediated Ablation

Syntese av fase-shift nanoemulsions med smale størrelse Distribusjoner for Acoustic Droplet Fordamping og Bubble-forbedret ultralyd-mediert Ablasjon

High-intensity  focused ultrasound (HIFU) is used clinically to thermally ablate tumors. To  enhance localized heating and improve thermal ablation in ...

Time Multiplexing Super Resolving Technique for Imaging from a Moving Platform

Tid Multiplexing Super Løse Teknikk for Imaging fra en bevegelig plattform

We propose a method for increasing the resolution of an object and overcoming the diffraction limit of an optical system installed on top of a moving ...

Fabrication of Gate-tunable Graphene Devices for Scanning Tunneling Microscopy Studies with Coulomb Impurities

Fabrikasjon av Gate-tunbare Graphene enheter for scanning tunneling mikroskopi Studier med Coulomb Urenheter

Owing to its relativistic low-energy charge carriers, the interaction between graphene and various impurities leads to a wealth of new physics and degrees ...

Ohmic Contact Fabrication Using a Focused-ion Beam Technique and Electrical Characterization for Layer Semiconductor Nanostructures

Ohmsk Kontakt Fabrication Ved hjelp av en Focused-ion Beam Teknikk og elektrisk karakterisering for Layer Semiconductor nanostrukturer

Layer semiconductors with easily processed two-dimensional (2D) structures exhibit indirect-to-direct bandgap transitions and superior transistor ...

In Depth Analyses of LEDs by a Combination of X-ray Computed Tomography (CT) and Light Microscopy (LM) Correlated with Scanning Electron Microscopy (SEM)

In Depth Analyses of LEDs by a Combination of X-ray Computed Tomography CT and Light Microscopy LM Correlated with Scanning Electron Microscopy SEM

I Dybde Analyser av lysdioder ved en kombinasjon av X-ray computertomografi (CT) og lysmikroskopi (LM) korrelert med Scanning elektronmikroskopi (SEM)

In failure analysis, device characterization and reverse engineering of light emitting diodes (LEDs), and similar electronic components of ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Sub-nanometer Resolution Imaging med Amplitude-modulasjon Atomic Force Microscopy i væske

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Focused Ion Beam Fabrication of LiPON-based Solid-state Lithium-ion Nanobatteries for In Situ Testing

Focused Ion Beam Fabrication of LiPON-based Solid-state Lithium-ion Nanobatteries for In Situ Testing

Fokusert Ion strålen fabrikasjon av LiPON-baserte SSD litium-ion Nanobatteries for In Situ Testing

Solid-state electrolytes are a promising replacement for current organic liquid electrolytes, enabling higher energy densities and improved safety of ...

Three-Dimensional Ultrasonic Needle Tip Tracking with a Fiber-Optic Ultrasound Receiver

Tredimensjonale ultralyd nål tips sporing med fiberoptisk ultralyd mottaker

Ultrasound is frequently used for guiding minimally invasive procedures, but visualizing medical devices is often challenging with this imaging modality. ...

Controllable Nucleation of Cavitation from Plasmonic Gold Nanoparticles for Enhancing High Intensity Focused Ultrasound Applications

Kontrollerbar Nucleation av kavitasjon fra Plasmonic gull nanopartikler for forbedring av høy intensitet fokusert ultralyd programmer

In this study, plasmonic gold nanoparticles were simultaneously exposed to pulsed near-infrared laser light and high intensity focused ultrasound (HIFU) ...