Name: multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Agradecemos a los Drs. Mikhail Shapiro y Nikita Reznik discusiones fructíferas. Este trabajo fue apoyado por fondos de puesta en marcha de la Western University of Health Sciences y NIH grant R21NS101384.

1. cultivo de células de película de poliester transparente acústicamente
<ol><li>Un tamaño de orificio de 12 mm en la parte inferior de una placa de cultivo de 35 mm estándar utilizando un taladro de prensa vertical del taladro. El taladro se mueven lentamente y Protéjase los ojos. Retire las piezas de plástico en la parte inferior del plato con una hoja para crear una superficie lisa en el lado externo (figura 2).</li>
	<li>Aplique una capa delgada de resina epóxica grado marino ...

<ol>
	<li>Elhelf, I. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+intensity+focused+ultrasound:+The+fundamentals,+clinical+applications+and+research+trends.">High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends.</a> Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).</li><li>Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , (2018).</li><li>Duck, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+and+non-medical+protection+standards+for+ultrasound+and+infrasound.">Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).</li><li>Legon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+focused+ultrasound+modulates+the+activity+of+primary+somatosensory+cortex+in+humans.">Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).</li><li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanobiology+of+brain+function.">The mechanobiology of brain function.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).</li><li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+neuromodulation+with+ultrasound?+A+continuum+mechanics+hypothesis.">Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis.</a> Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).</li><li>Tufail, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+pulsed+ultrasound+stimulates+intact+brain+circuits.">Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits.</a> Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).</li><li>Tyler, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+excitation+of+neuronal+circuits+using+low-intensity,+low-frequency+ultrasound.">Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound.</a> PloS One. 3 (10), e3511 (2008).</li><li>Suarez Castellanos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+ultrasound+stimulation+of+secretory+events+from+pancreatic+beta+cells.">Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells.</a> Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).</li><li>Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+Stimulation+of+Insulin+Release+from+Pancreatic+Beta+Cells+as+a+Potential+Novel+Treatment+for+Type+2+Diabetes.">Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).</li><li>Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonogenetics+is+a+non-invasive+approach+to+activating+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 6, 8264 (2015).</li><li>Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Piezo1+but+Not+NaV1.2+Channels+by+Ultrasound+at+43+MHz.">Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).</li><li>Kubanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+modulates+ion+channel+currents.">Ultrasound modulates ion channel currents.</a> Scientific Reports. 6, 24170 (2016).</li><li>Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+response+of+model+lipid+membranes+to+ultrasonic+radiation+force.">Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force.</a> PloS One. 8 (10), e77115 (2013).</li><li>Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic+Neuromodulation+Causes+Widespread+Cortical+Activation+via+an+Indirect+Auditory+Mechanism.">Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism.</a> Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).</li><li>O'Brien, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-biophysics+mechanisms.">Ultrasound-biophysics mechanisms.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corrigendum:+Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 8, 16148 (2017).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 3, 736 (2012).</li><li>Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+mechanisms+of+millimeter+wave+stimulation+of+excitable+cells.">Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells.</a> Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).</li><li>Hwang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+contactless+high+frequency+ultrasound+microbeam+stimulation+for+determination+of+invasion+potential+of+breast+cancer+cells.">Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).</li><li>Nakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+ratiometric+fluorescent+thermometer+with+wide+range+and+rapid+response.">Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response.</a> PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).</li><li>Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+intracellular+temperature+using+green+fluorescent+protein.">Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein.</a> Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).</li></ol>

Una ventaja principal de ultrasonido focalizado es su capacidad para proporcionar de forma no invasiva energía mecánica o térmica a muestras biológicas con la alta precisión espacio-temporal. Otras técnicas pretende estimular mecánicamente las células generalmente emplean sondas física invasiva (por ejemplo, meter celular) o requiere la interacción de rayos láser de alta energía con objetos extraños (por ejemplo, pinzas ópticas). Calefacción magnético puede calentar ubicaciones espaciale...

Muchas enfermedades requieren de algún tipo de intervención médica invasiva. Estos procedimientos son a menudo costosas, riesgosas, requieren periodos de recuperación y así añadir una carga a los sistemas de salud. Modalidades terapéuticas no invasivas tienen el potencial para ofrecer alternativas más seguras y más baratas a los procedimientos quirúrgicos convencionales. Sin embargo, actuales no invasivos como la farmacoterapia o transcraneal de la estimulación magnética a menudo están limitados por las compensaciones entre la penetración del tejido, resolución espaciotemporal y efectos no deseados fuera del objetivo. En este contexto, un ultrasonido focalizado constituye una tecnología no invasiva prometedora con el potencial para manipular funciones biológicas en tejidos con alta precisión espacio-temporal y limitados efectos off-target.
Ultrasonido focalizado estimulación consiste en entregar energía acústica en lugares precisos dentro de los organismos vivos. Dependiendo de los parámetros de pulso acústico, esta energía puede tener una variedad de aplicaciones médicas. Por ejemplo, la Food and Drug Administration ha aprobado el uso de ultrasonidos focalizados de alta intensidad (HiFU) para la ablación térmica de tumores de próstata, regiones del cerebro que causa temblor, fibromas uterinos y las terminaciones nerviosas causando dolor en metástasis óseas1 . Cavitación HiFu-mediada microburbujas también se utiliza para abrir transitoriamente la barrera blood - brain para la entrega específica de terapéutica administrada sistémicamente2. La intensidad de pulso promedio pico espacial (Isppa) y pico espacial temporal media intensidad (spta) utilizado para HiFU aplicaciones suelen ser por encima de varios kW cm-2 y producen la presión de pulso de varias decenas de MPa. Estos valores de intensidad son muy por encima del aprobado por la FDA-sppa yspta límites de ultrasonido diagnóstico, 190 W cm-2 y 720 mW cm-2, respectivamente3. Por el contrario, estudios recientes han demostrado que el estímulo no destructivo ultrasonido pulsado que están dentro o cerca de la gama de los límites de intensidad de ultrasonido diagnóstico (LIPUS) puede ser eficaz de forma remota y segura manipulación neural disparar4, 5,6,7,8, secreción hormonal9,10 y Bioingeniería células11. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares por el cual las células sensación y responden al ultrasonido no quedan claros, imposibilitando la traducción clínica de LIPUS. Por lo tanto, en los últimos años, estudios de membranas artificiales, cultivos de células y animales estimulados con ultrasonido han ganado impulso para revelar biofísicos y los procesos fisiológicos modulan por LIPUS12,13, 14,15.
Sonido consiste en una vibración propagación por un medio físico. Un ultrasonido es un sonido con una frecuencia por encima del rango audible humano (es decir, por encima de 20 kHz). En un entorno de laboratorio, ondas de ultrasonido se producen generalmente por transductores piezoeléctricos que contienen un material que vibra en respuesta a un campo eléctrico Oscilante en un determinado ancho de banda de alta frecuencia. Existen dos tipos de transductores: único elemento transductores y arreglos de discos de transductor. Transductores piezoeléctricos individuales poseen una superficie curva que actúa como una lente de enfoque y por lo tanto, se concentra la energía acústica en una región definida llamada la zona focal. Único elemento transductores están mucho más barato y más fácil de utilizar que los arreglos de discos de transductor. Este artículo se centrará en transductores de elemento único.
El tamaño de la zona focal de un transductor de elemento enfocado depende de las propiedades geométricas de la lente acústica y su frecuencia acústica. Para lograr una zona focal de tamaño milimétrico con un transductor de elemento, frecuencias de ultrasonido en el rango de MHz se requiere generalmente. Desafortunadamente, las ondas acústicas en tal frecuencia se atenúan muy rápidamente cuando se propaga en un medio frágil como el aire. Así, las ondas del ultrasonido MHz tiene que ser generado y propagado a la muestra en un material más denso como el agua. Esto constituye el primer desafío de integración de la modalidad LIPUS a un microscopio.
Un segundo desafío es minimizar interfaces físicas entre materiales con diferentes impedancias acústicas (que es un producto de la densidad material y la velocidad acústica) a lo largo de la trayectoria acústica. Estas interfaces se pueden reflejar, refractar, dispersión y absorber las ondas acústicas, lo que hace difícil cuantificar la cantidad de energía acústica efectivamente entregado a una muestra. También pueden crear artefactos mecánicos no deseados. Por ejemplo, reflejos produce desajuste perpendicular al acústico impedancia interfaces crean backpropagating ondas que interfieren con los de propagación hacia adelante. A lo largo de la ruta de interferencia, las olas cancelan mutuamente en regiones fijadas de espacios llamados nodos y resumir en alternando regiones llamadas los nodos, creación de supuesto ondas estacionarias (figura 1). Es importante que el experimentador poder controlar o eliminar estas interfaces experimentales in vitro , que pueden no existir en vivo.
Medida de fluorescencia óptica reporteros es un método bien conocido para interrogar las muestras biológicas transparentes en tiempo real y con ninguna alteración física. Este enfoque por lo tanto es ideal para estudios LIPUS como cualquier sondas físicas presentes en el área de sonicación introducir artefactos mecánicos. Este protocolo describe la implementación y operación de LIPUS a un microscopio de epi-fluorescencia comercial.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CERNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>SliceScope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optomechanical components</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HFO series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>DSOX2004A (4-channels 70MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>function generator</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>33500B (20MHz single-channel)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronic Navigation Industries (ENI)</td>
			<td rowspan="2">325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronics &#38; Innovation (E&#38;I)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>focused immersion transdcuers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Benthowave Instrument</td>
			<td>HiFu transducer BII-76 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>Piezo-ceramic or HiFu transducers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Ultrasonic-S-lab</td>
			<td>HiFu transducers made to order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-density Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>VWR 80094-330</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar film 2.5 microns</td>
			<td>Chemplex</td>
			<td>CAT.NO:107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy

Al enfocar pulsos de ultrasonido de baja intensidad que penetran en los tejidos blandos, LIPUS representa una prometedora Tecnología biomédica remotamente y con seguridad manipular leña neuronal, secreción hormonal y las células reprogramadas genéticamente. Sin embargo, la traducción de esta tecnología para aplicaciones médicas actualmente es obstaculizada por la falta de mecanismos biofísicos que objetivo sentido tejidos y responder a LIPUS. Un enfoque adecuado para identificar estos mecanismos sería utilizar biosensores ópticos en combinación con LIPUS para determinar base de vías de señalización. Sin embargo, aplicación del LIPUS a un microscopio de fluorescencia puede introducir artefactos mecánicos indeseados debido a la presencia de interfaces físicas que reflejan, absorben y refractan las ondas acústicas. Este artículo presenta un procedimiento paso a paso para incorporar LIPUS a microscopios de epifluorescencia vertical comercialmente disponibles y reducir al mínimo la influencia de interfaces físicas a lo largo de la trayectoria acústica. Se describe un procedimiento sencillo para operar un solo elemento transductor y para poner la zona focal del transductor en el punto focal objetivo. El uso de LIPUS se ilustra con un ejemplo de transitorios del calcio LIPUS-inducida en células de glioblastoma humano cultivadas medidas usando proyección de imagen del calcio.

Figura 5 es un ejemplo de experimento LIPUS multiplexado con proyección de imagen de calcio. Células de glioblastoma (A-172) se cultiva en EMPM recubierto de película de poliéster en medio de cultivo estándar (suplementado con 10% suero y 1% antibióticos) y se incubaron con el reportero fluorescente sensible al calcio Fluo-4 AM. Células fueron fotografiadas usando un lente de inmersión X 10 e iluminado con una fuente de luz blanca de LED y luz de la f...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy

Estimulación de ultrasonido pulsado (LIPUS) de baja intensidad es una modalidad de estimulación mecánica no invasiva de células endógenas o ingeniería con alta resolución espacial y temporal. Este artículo describe cómo implementar LIPUS a un microscopio de epifluorescencia y cómo minimizar el desajuste de impedancia acústica en el camino de ultrasonido para evitar artefactos mecánicos no deseados.

La multiplexación enfocada ultrasonido estimulación con microscopía de fluorescencia

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la mecanobiología, como cómo las muestras biológicas responden a las fuerzas mecánicas producidas por la estimulación por ultrasonido de baja intensidad. La principal ventaja de esta técnica es que permite a un experimentalista aplicar de forma no invasiva fuerzas mecánicas a una muestra y medir varios perímetros biológicos en tiempo real. Para comenzar, taladre lentamente un agujero de 12 milímetros en la parte inferior de un plato de cultivo estándar de 35 milímetros usando un taladro de prensa vertical.Una vez perforado, retire los trozos de plástico unidos a la parte inferior del plato usando una cuchilla, para crear una superficie lisa en el lado externo. A continuación, aplique una fina capa de epoxi o pegamento de grado marino en la superficie inferior externa del plato. En la parte superior del adhesivo, coloque una película de poliéster de dos puntos y cinco micras de espesor, presionando firmemente para asegurarse de que el adhesivo se extiende uniformemente entre la película y la superficie de plástico gruesa.Tire suavemente de la película de una manera centrífuga con los dedos, para crear una superficie plana. Una vez que el adhesivo se haya secado, enjuague brevemente el plato inferior de poliéster con 95% de etanol. Luego, UV esterilizar el plato colocándolo bajo una fuerte fuente de excitación UV de 254 nanómetros.Ajuste la duración y la intensidad para administrar una dosis UV de aproximadamente 330 miljoules por centímetro cuadrado. A continuación, diluir una mezcla de proteína de matriz extracelular disponible comercialmente con el medio de cultivo deseado en una proporción de uno a 100. Trabaje en hielo para prevenir la polimerización de la matriz y aplique rápidamente 100 microlitros de la mezcla media sobre la película de poliéster.Vuelva a colocar la tapa sobre el plato para mantener la esterilidad. Una vez cubierto, incubar los platos inferiores de poliéster recubiertos de matriz en un cultivo celular, incubadora con dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante seis a 12 horas. Después de la incubación, aspirar el exceso de medio y sembrar directamente la superficie con las células en la densidad deseada.Coloque un tanque de agua debajo del objetivo de un microscopio vertical. A continuación, utilizando componentes optomecánicos disponibles comercialmente, coloque el soporte de muestra entre el objetivo y el transductor. Asegúrese de que las partes móviles y los actuadores de las etapas de traducción estén fuera del tanque o por encima de la línea de agua para evitar daños por agua.A continuación, llene el tanque con agua desionizada y desgasificado hasta el plano horizontal del soporte de muestra, antes de utilizar el transductor de inmersión. Utilizando componentes optomecánicos no corrosivos y disponibles comercialmente, asegúrese de que el transductor esté en posición oblicua con respecto a la trayectoria óptica. Esto asegurará que las ondas reflejadas se alejarán de la muestra.Ajuste la frecuencia del generador de funciones a la frecuencia pico nominal del transductor. A continuación, cree un pulso de voltaje sinusoidal de la duración deseada y la frecuencia de repetición, utilizando el modo de ráfaga del generador de funciones. A continuación, ajuste el voltaje de pico a pico a un valor deseado.Asegúrese de que la duración del pulso sea más corta que el tiempo transcurrido entre dos pulsos consecutivos. Conecte la salida del generador de funciones a la entrada de un osciloscopio. Utilice el osciloscopio para confirmar que la forma de onda corresponde a la señal deseada.A continuación, conecte la salida del generador de funciones a la entrada de una potencia de un amplificador de RF del tamaño adecuado. Usando una sonda de hidrófono que funcione con un rango de frecuencia e intensidad acústica compatible con el del transductor de ultrasonido, ponga cuidadosamente la punta de la sonda en el foco dentro del campo de visión del objetivo en la posición de la muestra. Asegúrese de que tanto la sonda como el transductor estén sumergidos en el baño de agua y realice una prealineación bruta del transductor posicionando visualmente su eje acústico hacia la sonda de hidrófono.Asegúrese de que la distancia entre los dos corresponde a la distancia focal del transductor. No golpee la punta del hidrófono con ningún objeto físico que no sea agua, ya que esto alterará su recubrimiento y afectará la medición. A continuación, conecte la salida del hidrófono a una de las entradas de señal del osciloscopio.A continuación, conecte el disparador de sincronización desde el generador de funciones a otra entrada de osciloscopio. Visualice ambas señales simultáneamente en el osciloscopio. A continuación, conduzca el transductor con pocos ciclos de ultrasonido a un ciclo de trabajo bajo y baja amplitud para evitar dañar la sonda.Consulte con el fabricante del hidrófono las condiciones de funcionamiento seguras para evitar dañar la punta del hidrófono. Ajuste la perilla de división S de acuerdo con el tiempo de viaje del ultrasonido desde la superficie del transductor hasta el hidrófono. Busque una señal de hidrófono en el osciloscopio después del disparador de sincronización.A continuación, acciona lentamente el transductor utilizando una etapa XYZ motorizada o manual. Coloque el transductor en la posición que se correlaciona con la señal máxima del hidrófono. Con el haz ahora alineado, mida la amplitud pico a pico de la salida del hidrófono en el osciloscopio para varios voltajes que impulsan el transductor.Asegúrese de no exceder el límite de presión del hidrófono. Sustituya el medio de cultivo de la célula por el búfer de imágenes deseado que contenga cinco micromolares de un tinte sensible al calcio y permeante de células, como Fluo-4 AM. Luego, incuba el plato de cultivo en una incubadora con dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante una hora. Después de la incubación, lave cuidadosamente las células con el mismo tampón libre de tinte.A continuación, coloque el plato en el portacuchillas. Emociona las células usando iluminación de luz azul a 490 nanómetros. Ajuste la intensidad de excitación y la exposición de la cámara para evitar el blanqueo excesivo o la saturación de píxeles.Realice imágenes de lapso de tiempo utilizando un objetivo de inmersión con una larga distancia de trabajo para una mejor calidad de imagen y para reducir los reflejos no deseados. Aquí, las células del glioblastoma se muestran en la película de poliéster recubierta de matriz extracelular en medio de cultivo estándar. Estas células han sido incubadas con un reportero fluorescente sensible al calcio.En esta imagen, los puntos rojos representan celdas fluorescentes individuales, identificadas mediante un software de procesamiento de imágenes. Tras la estimulación durante 10 segundos con ultrasonido, se visualizaron elevaciones robustas de calcio en muchas regiones de interés. El número de regiones de interés activadas se muestra aquí a lo largo del tiempo.Después de la activación de 10 segundos con ultrasonido, se encontró que aproximadamente el 70% de las regiones estaban por encima de los valores de umbral definidos por el usuario. Al intentar este procedimiento, es importante recordar alinear el haz de ultrasonido antes de realizar la medición de fluorescencia.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Engineering

Unit 1

Sound

SCIENTISTS IN ACTION

Synthesis of Phase-shift Nanoemulsions with Narrow Size Distributions for Acoustic Droplet Vaporization and Bubble-enhanced Ultrasound-mediated Ablation

Síntesis de nanoemulsiones de cambio de fase con distribuciones de tamaño estrechas para la vaporización Droplet acústica y Bubble mejorada ablación por ultrasonidos mediada

High-intensity  focused ultrasound (HIFU) is used clinically to thermally ablate tumors. To  enhance localized heating and improve thermal ablation in ...

Investigación

Ingeniería

Time Multiplexing Super Resolving Technique for Imaging from a Moving Platform

Tiempo Multiplexing Súper Resolución Técnica de la Imagen de una plataforma móvil

We propose a method for increasing the resolution of an object and overcoming the diffraction limit of an optical system installed on top of a moving ...

Fabrication of Gate-tunable Graphene Devices for Scanning Tunneling Microscopy Studies with Coulomb Impurities

Fabricación de puerta-sintonizables grafeno dispositivos de escaneo de Estudios microscopía de efecto túnel con Coulomb impurezas

Owing to its relativistic low-energy charge carriers, the interaction between graphene and various impurities leads to a wealth of new physics and degrees ...

Ohmic Contact Fabrication Using a Focused-ion Beam Technique and Electrical Characterization for Layer Semiconductor Nanostructures

Óhmico Contacto Fabricación Usando una técnica enfocada-ion Beam y Eléctrica Caracterización de Nanoestructuras capa semiconductora

Layer semiconductors with easily processed two-dimensional (2D) structures exhibit indirect-to-direct bandgap transitions and superior transistor ...

In Depth Analyses of LEDs by a Combination of X-ray Computed Tomography (CT) and Light Microscopy (LM) Correlated with Scanning Electron Microscopy (SEM)

In Depth Analyses of LEDs by a Combination of X-ray Computed Tomography CT and Light Microscopy LM Correlated with Scanning Electron Microscopy SEM

Los análisis en profundidad de los LEDs mediante una combinación de rayos-X de tomografía computarizada (TC) y la microscopía de luz (LM) correlacionado con microscopía electrónica de barrido (SEM)

In failure analysis, device characterization and reverse engineering of light emitting diodes (LEDs), and similar electronic components of ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Resolución de imagen subnanométrica con modulación de amplitud en microscopía de fuerza atómica en Líquido

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Focused Ion Beam Fabrication of LiPON-based Solid-state Lithium-ion Nanobatteries for In Situ Testing

Focused Ion Beam Fabrication of LiPON-based Solid-state Lithium-ion Nanobatteries for In Situ Testing

Ion enfocado viga fabricación de Nanobatteries LiPON basado en estado sólido-ion de litio para la prueba In Situ

Solid-state electrolytes are a promising replacement for current organic liquid electrolytes, enabling higher energy densities and improved safety of ...

Three-Dimensional Ultrasonic Needle Tip Tracking with a Fiber-Optic Ultrasound Receiver

Punta de aguja ultrasónica tridimensional de seguimiento con un receptor de ultrasonido de fibra óptica

Ultrasound is frequently used for guiding minimally invasive procedures, but visualizing medical devices is often challenging with this imaging modality. ...

Controllable Nucleation of Cavitation from Plasmonic Gold Nanoparticles for Enhancing High Intensity Focused Ultrasound Applications

Nucleación controlable de la cavitación de la plasmónica nanopartículas de oro para aumentar la intensidad alta enfocada ultrasonido aplicaciones

In this study, plasmonic gold nanoparticles were simultaneously exposed to pulsed near-infrared laser light and high intensity focused ultrasound (HIFU) ...