Name: multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Vi tackar Drs. Mikhail Shapiro och Nikita Reznik för givande diskussioner. Detta arbete stöds av nystartade fonder från Western University of Health Sciences och NIH bevilja R21NS101384.

1. växande celler på akustiskt Transparent Polyesterfilm
<ol><li>Borra ett 12 mm hål storlek längst ned i en vanlig 35 mm kultur maträtt med en vertikal tryck-borr. Flytta övningen långsamt och Använd ögonskydd. Ta bort bitar av plast fäst i botten av skålen med ett blad för att skapa en slät yta på den externa sidan (figur 2).</li>
	<li>Applicera ett tunt lager marine-grade epoxi eller lim på externa bottenytan av skålen.</li>
	<li>Placera en film av polyester (2,5 µm tjo...

<ol>
	<li>Elhelf, I. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+intensity+focused+ultrasound:+The+fundamentals,+clinical+applications+and+research+trends.">High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends.</a> Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).</li><li>Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , (2018).</li><li>Duck, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+and+non-medical+protection+standards+for+ultrasound+and+infrasound.">Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).</li><li>Legon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+focused+ultrasound+modulates+the+activity+of+primary+somatosensory+cortex+in+humans.">Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).</li><li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanobiology+of+brain+function.">The mechanobiology of brain function.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).</li><li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+neuromodulation+with+ultrasound?+A+continuum+mechanics+hypothesis.">Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis.</a> Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).</li><li>Tufail, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+pulsed+ultrasound+stimulates+intact+brain+circuits.">Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits.</a> Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).</li><li>Tyler, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+excitation+of+neuronal+circuits+using+low-intensity,+low-frequency+ultrasound.">Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound.</a> PloS One. 3 (10), e3511 (2008).</li><li>Suarez Castellanos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+ultrasound+stimulation+of+secretory+events+from+pancreatic+beta+cells.">Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells.</a> Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).</li><li>Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+Stimulation+of+Insulin+Release+from+Pancreatic+Beta+Cells+as+a+Potential+Novel+Treatment+for+Type+2+Diabetes.">Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).</li><li>Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonogenetics+is+a+non-invasive+approach+to+activating+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 6, 8264 (2015).</li><li>Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Piezo1+but+Not+NaV1.2+Channels+by+Ultrasound+at+43+MHz.">Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).</li><li>Kubanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+modulates+ion+channel+currents.">Ultrasound modulates ion channel currents.</a> Scientific Reports. 6, 24170 (2016).</li><li>Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+response+of+model+lipid+membranes+to+ultrasonic+radiation+force.">Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force.</a> PloS One. 8 (10), e77115 (2013).</li><li>Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic+Neuromodulation+Causes+Widespread+Cortical+Activation+via+an+Indirect+Auditory+Mechanism.">Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism.</a> Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).</li><li>O'Brien, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-biophysics+mechanisms.">Ultrasound-biophysics mechanisms.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corrigendum:+Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 8, 16148 (2017).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 3, 736 (2012).</li><li>Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+mechanisms+of+millimeter+wave+stimulation+of+excitable+cells.">Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells.</a> Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).</li><li>Hwang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+contactless+high+frequency+ultrasound+microbeam+stimulation+for+determination+of+invasion+potential+of+breast+cancer+cells.">Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).</li><li>Nakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+ratiometric+fluorescent+thermometer+with+wide+range+and+rapid+response.">Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response.</a> PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).</li><li>Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+intracellular+temperature+using+green+fluorescent+protein.">Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein.</a> Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).</li></ol>

En stor fördel av fokuserat ultraljud är dess förmåga att leverera icke-invasivt mekanisk eller termisk energi till biologiska prover med hög plats och tid precision. Andra tekniker avsedda att mekaniskt stimulera celler brukar anställa invasiva fysiska sonder (t.ex. cell-PETA) eller kräver samverkan mellan hög energi laser balkar och främmande föremål (t.ex. optisk pincett). Magnetiska värme kan värma specifika rumsliga platser inuti biologiska prover men kräver närvaro av utländska mag...

Många sjukdomar kräver någon form av invasiv medicinsk intervention. Dessa förfaranden är ofta dyra, riskfyllda, kräver återhämtningsperioder och därmed lägga en börda till hälso-och sjukvårdssystem. Icke-invasiv terapeutiska modaliteter har potential att ge säkrare och billigare alternativ till konventionella kirurgiska ingrepp. Nuvarande icke-invasiva metoder såsom farmakoterapi eller transkraniell magnetisk stimulering är dock ofta begränsade av avvägningar mellan vävnad penetration, spatiotemporal upplösning och oönskade off-target effekter. I detta sammanhang utgör en fokuserad ultraljud en lovande icke-invasiv teknik med potential att manipulera biologiska funktioner djupt inne i vävnader med hög spatiotemporal noggrannhet och begränsade off-target effekter.
Fokuserat ultraljud stimulering består av att leverera akustisk energi på exakta platser djupt inne i levande organismer. Beroende på akustisk puls parametrar, kan denna energi ha en mängd olika medicinska användningsområden. Till exempel, har Food and Drug Administration godkänt användning av högintensivt fokuserat ultraljud (HiFU) för termisk ablation av prostatacancertumörer, tremor-orsakar hjärnregioner, myom och smärta-orsakar nervändar i skelettmetastaser1 . HiFu-medierad mikrobubblor kavitation används också övergående öppna den blood - brain barriären för riktade leverans av systemiskt administrerat therapeutics2. Spatial-topp puls-genomsnittliga intensiteten (jagsppa) och rumsliga-peak temporal-genomsnittet intensitet (jagspta) används för HiFU tillämpningar är vanligtvis över flera kW cm-2 och producera pulstrycket av flera tiotals MPa. Dessa intensitetsvärden är långt över den FDA-godkända jagsppa och jagspta gränser för diagnostiskt ultraljud, 190 W cm-2 och 720 mW cm-2, respektive3. Däremot har nyare studier visat att icke-förstörande pulsad ultraljud stimulering som är inom eller nära diagnostiskt ultraljud intensitet gränsvärden (LIPUS) kan vara effektivt att distans och säkert manipulera neurala skjuter4, 5,6,7,8, hormonell utsöndring9,10 och bioengineered celler11. De cellulära och molekylära mekanismer genom vilka celler känna och reagera på ultraljud är dock fortfarande oklart, utgör hinder för kliniska översättning av LIPUS. Därför, i de senaste åren, studier av konstgjorda membraner, odlade celler och djur stimuleras med ultraljud har fått fart att avslöja biofysiska och fysiologiska processer moduleras av LIPUS12,13, 14,15.
Ljud består av en vibration som förökningsmaterial genom ett fysiskt medium. Ett ultraljud är ljud med en frekvens över mänsklig hörbara intervallet (dvs. över 20 kHz). I laboratoriemiljö, är ultraljudsvågor allmänt produceras av piezoelektrisk givare som innehåller ett material som vibrerar som svar på ett elektriskt fält oscillerar i en särskild hög frekvens bandbredd. Det finns två typer av givare: inre elementet givare och givaren matriser. Enstaka element piezoelektrisk givare besitter en krökt yta som fungerar som en fokuserande lins och därmed koncentrerar akustisk energi in i en definierad region som kallas fokal zonen. Enstaka element givare är mycket billigare och lättare att manövrera än givaren matriser. Denna artikel kommer att fokusera på enstaka element givare.
Storleken på en fokuserad enda element givare fokal zon beror på akustisk linsen geometriska egenskaper och dess akustiska frekvens. För att uppnå en millimeter-storlek fokal zon med en enda element givare, erfordras ultraljud frekvenser i intervallet MHz i allmänhet. Akustiskt vinkar med sådan frekvens är tyvärr mycket snabbt försvagade när sprids i en svag medium såsom luft. MHz ultraljudsvågor behöver alltså, skapas och sprids till provet i ett tätare material såsom vatten. Detta utgör den första utmaningen i att integrera LIPUS modalitet till Mikroskop.
En andra utmaningen är att minimera fysiska gränssnitt mellan material med olika akustiska impedanser (som är en produkt av materialdensitet och akustiska hastigheten) längs den akustiska väg. Dessa gränssnitt kan reflektera, bryta, scatter och absorbera akustiska vågor, vilket gör det svårt att kvantifiera mängden akustisk energi effektivt levereras till ett urval. De kan också skapa oönskade mekaniska artefakter. Till exempel skapa reflektioner producerade vinkelrätt mot akustisk mismatch impedans gränssnitt backpropagating vågor som störa framåt-förökningsmaterial och kära. Längs sökvägen störningar avbryta vågorna varandra på fasta regioner av utrymmen som kallas noder och sammanfatta på alternerande regioner kallas anti noder, skapa så kallade stående vågor (figur 1). Det är viktigt för experimentalist för att kunna styra eller eliminera dessa experimentella gränssnitt in vitro som de inte kanske finns i vivo.
Fluorescens mätning av optiska reportrar är en välkänd metod för att förhöra transparent biologiska prover i realtid och med ingen fysisk störning. Detta tillvägagångssätt är således perfekt för LIPUS studier som någon fysisk sonder i sonicated området kommer att införa mekaniska artefakter. Det här protokollet beskriver genomförandet och driften av LIPUS till kommersiella påljusfluorescens Mikroskop.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CERNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upright microscope with large working volume</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>SliceScope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optomechanical components</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>ONDA Corporation</td>
			<td>HFO series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>DSOX2004A (4-channels 70MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>function generator</td>
			<td>Keysight Technology</td>
			<td>33500B (20MHz single-channel)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronic Navigation Industries (ENI)</td>
			<td rowspan="2">325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF power amplifier</td>
			<td>Electronics &#38; Innovation (E&#38;I)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>focused immersion transdcuers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Benthowave Instrument</td>
			<td>HiFu transducer BII-76 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>Piezo-ceramic or HiFu transducers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion ultrasound transducer</td>
			<td>Ultrasonic-S-lab</td>
			<td>HiFu transducers made to order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-density Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>VWR 80094-330</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar film 2.5 microns</td>
			<td>Chemplex</td>
			<td>CAT.NO:107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexing focused ultrasound stimulation with fluorescence microscopy

Genom att fokusera låg intensitet ultraljud pulser som penetrerar mjukdelar, representerar LIPUS en lovande biomedicinsk teknik för distans och säkert manipulera neurala bränning, hormonell utsöndring och genetiskt omprogrammerade celler. Översättningen av denna teknik för medicinska tillämpningar hämmas dock för närvarande av bristande biofysiska mekanismer genom vilka riktade vävnader känsla och bemöta LIPUS. En lämplig metod att identifiera dessa mekanismer skulle vara att använda optiska biosensorer i kombination med LIPUS för att fastställa underliggande signalvägar. Dock införa genomföra LIPUS till fluorescens Mikroskop oönskade mekaniska artefakter på grund av fysiska gränssnitt som återspeglar, absorberar och bryter Akustiskt vinkar. Denna artikel presenterar en steg för steg-procedur för att införliva LIPUS till kommersiellt tillgängliga upprätt påljusfluorescens Mikroskop samtidigt minimera påverkan av fysiska gränssnitt på akustisk vägen. En enkel procedur beskrivs att använda ett enda element ultraljudstransducern och föra transducern fokal zon i den objektiva brännpunkten. Användning av LIPUS illustreras med ett exempel på LIPUS-inducerad kalcium transienter i odlade mänskliga glioblastoma celler mäts med hjälp av kalcium imaging.

Figur 5 är ett exempel av LIPUS experiment multiplexade med kalcium imaging. Glioblastoma celler (A-172) var odlas på EMPM belagd polyester film i standard odlingsmedium (kompletteras med 10% serum och 1% antibiotika) och inkuberas med kalcium-känsliga fluorescerande reporter Fluo-4 AM. Cellerna var avbildats med en 10 X nedsänkning objektiv och belyst med en vit LED-ljuskälla och fluorescens ljus samlades använder en standarduppsättning med GFP filter...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy

Låg intensitet pulsad ultraljud stimulering (LIPUS) är en modalitet för noninvasiv mekanisk stimulering av endogen eller modifierade celler med hög rumsliga och temporal upplösning. Denna artikel beskriver hur du implementerar LIPUS till ett epi-fluorescens Mikroskop och hur man kan minimera akustisk impedans obalans på ultraljud vägen att förhindra oönskade mekaniska artefakter.

Multiplexing fokuserat ultraljud stimulering med fluorescensmikroskopi

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely ...

Denna metod kan hjälpa till att svara på viktiga frågor i mekanobiologi, såsom hur biologiska prover svarar på mekaniska krafter som produceras av lågintensiv ultraljud stimulering. Den största fördelen med denna teknik är att den tillåter en experimentalist att noninvasively tillämpa mekaniska krafter på ett prov och mäta olika biologiska omkrets i realtid. Till att börja med borra långsamt ett 12 millimeters hål längst ner på en vanlig 35 millimeter kultur skålen med hjälp av en vertikal press borr.När borras, ta bort bitar av plast fäst vid botten av skålen med hjälp av ett blad, för att skapa en slät yta på den externa sidan. Därefter applicera ett tunt lager av marin-grade epoxi eller lim på den yttre bottenytan av skålen. Ovanpå limmet, placera en två-punkt-fem-mikron tjock film av polyester, trycka ordentligt för att se till att limmet sprider sig jämnt mellan filmen och den tjocka plastytan.Dra försiktigt filmen i en centrifugal sätt med fingrar, för att skapa en plan yta. När limmet har torkat, skölj kortfattat polyester botten skålen med 95%etanol. Sedan, UV sterilisera skålen genom att placera den under en stark 254 nanometer UV excitation källa.Justera varaktighet och intensitet för att leverera en UV-dos på cirka 330 millijoule per kvadratcentimeter. Därefter späd en kommersiellt tillgänglig extracellulär matrisproteinblandning med önskat odlingsmedium vid ett förhållande av ett till 100. Arbeta på is för att förhindra matrispolymerisering, och snabbt applicera 100 mikroliter av medelblandningen på polyesterfilmen.Placera locket tillbaka på skålen för att bibehålla steriliteten. När den väl har täckts in, inkuberas de matrisbelagda, polyesterbottensrätterna i en cellodling, koldioxidbuffertad inkubator vid 37 grader Celsius i sex till 12 timmar. Efter inkubation, aspirera överskottsmediet och direkt utsäde ytan med celler vid önskad densitet.Placera en vattentank under målet med ett upprätt mikroskop. Därefter, med hjälp av kommersiellt tillgängliga optomekaniska komponenter, placera provinnehavaren mellan målsättningen och givaren. Se till att de rörliga delarna och manöverdonen för översättningsstadarna antingen ligger utanför tanken eller ovanför vattenledningen för att undvika vattenskador.Fyll sedan tanken med avjoniserat och avgasat vatten upp till provexemplahållarens horisontella plan, innan du utnyttjar nedsänkningsgivaren. Med hjälp av icke-korrosiva, kommersiellt tillgängliga optomekaniska komponenter, se till att givaren i snedställning med avseende på den optiska banan. Detta kommer att säkerställa att alla reflekterade vågor kommer att riktas bort från provet.Justera frekvensen för funktionsgeneratorn till den nominella toppfrekvensen för givaren. Skapa sedan en sinusformad spänningspuls av önskad varaktighet och repetitionsfrekvens, med hjälp av funktionsgeneratorns sprängningsläge. Därefter justerar topp-till-topp spänning till ett önskat värde.Se till att pulsens längd är kortare än den tid som förflutit mellan två på varandra följande pulser. Anslut utdata från funktionsgeneratorn till ingången av ett oscilloskop. Använd oscilloskopet för att bekräfta att vågformen motsvarar den önskade signalen.Anslut sedan utdata från funktionsgeneratorn till ingången av en effekt av en RF-förstärkare med korrekt storlek. Med hjälp av en hydrofonsond som arbetar med ett frekvensområde och akustisk intensitet kompatibel med ultraljudsgivarens, för försiktigt sondens spets i fokus inom målets synfält på provets position. Se till att både sond och givare är nedsänkta i vattenbadet och utför en grov förinriktning av givaren genom att visuellt placera sin akustiska axel mot hydrofonsonden.Se till att avståndet mellan de två motsvarar givarens brännvidd. Stöt inte över vattenkraftens spets med något annat fysiskt föremål än vatten, eftersom detta kommer att förändra dess beläggning och påverka mätningen. Därefter ansluter du hydrofonutgången till en av oscilloskopets signalingång.Anslut sedan synkroniseringsutlösaren från funktionsgeneratorn till en annan oscilloskopingång. Visualisera båda signalerna samtidigt på oscilloskopet. Därefter kör givaren med få ultraljudscykler vid en låg tjänstgöringscykel och låg amplitud för att undvika att skada sonden.Kontrollera med hydrofonens tillverkare säkra driftförhållanden för att undvika att skada hydrofonspetsen. Justera S-divisionsvredet enligt restiden för ultraljudet från givarens yta till hydrofonen. Leta efter en hydrofonsignal på oscilloskopet efter synkroniseringsutlösaren.Därefter, långsamt aktivera givaren med hjälp av en motoriserad eller manuell XYZ-stadium. Placera givaren i det läge som korrelerar med den maximala hydrofonsignalen. Med balken nu i linje, mäta topp-till-topp amplitud av hydrofonen produktionen vid oscilloskopet för olika spänningar som driver givaren.Se till att inte överskrida vattenkraftens tryckgräns. Ersätt cellens odlingsmedium med den önskade bildbufferten innehållande fem mikromolar av ett cellpermeant, kalciumkänsligt färgämne, såsom Fluo-4 AM. Sedan, inkubera kultur skålen i en koldioxidbufferterade inkubator på 37 grader Celsius i en timme. Efter inkubation, tvätta försiktigt celler med samma buffert fri från färgämne.Placera sedan skålen i provhållaren. Excitera cellerna med hjälp av blå ljus belysning vid 490 nanometer. Justera excitationsintensiteten och kameraexponeringen för att undvika överdriven blekning eller pixelmättnad.Utför timelapse-avbildning med hjälp av ett mål för nedsänkning med ett långt arbetsavstånd för bättre bildkvalitet, och för att minska oönskade reflektioner. Här visas glioblastomceller på extracellulär matrisbelagd polyesterfilm i standardkulturmedium. Dessa celler har inkuberas med en kalcium-känslig fluorescerande reporter.I den här bilden representerar de röda punkterna enskilda fluorescerande celler, som identifieras med hjälp av en programvara för bildbehandling. Vid stimulering i 10 sekunder med ultraljud, var robust kalcium höjder visualiseras i många regioner av intresse. Antalet aktiverade regioner av intresse visas här över tid.Efter 10-sekunders aktiveringen med ultraljud befanns ungefär 70%av regionerna ligga över användardefinierade tröskelvärden. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att anpassa ultraljud strålen innan du gör fluorescens mätning.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Engineering

Unit 1

Sound

SCIENTISTS IN ACTION

Synthesis of Phase-shift Nanoemulsions with Narrow Size Distributions for Acoustic Droplet Vaporization and Bubble-enhanced Ultrasound-mediated Ablation

Syntes av fasförskjutning nanoemulsioner med smala storleksfördelningar för akustiska Droplet förångning och Bubble-förstärkt ultraljud-medierad Ablation

High-intensity  focused ultrasound (HIFU) is used clinically to thermally ablate tumors. To  enhance localized heating and improve thermal ablation in ...

Time Multiplexing Super Resolving Technique for Imaging from a Moving Platform

Time Multiplexing Super Lösa Teknik för avbildning från en rörlig plattform

We propose a method for increasing the resolution of an object and overcoming the diffraction limit of an optical system installed on top of a moving ...

Fabrication of Gate-tunable Graphene Devices for Scanning Tunneling Microscopy Studies with Coulomb Impurities

Tillverkning av Gate-avstämbara grafen enheter för sveptunnelmikroskopi Studier med Coulomb Föroreningar

Owing to its relativistic low-energy charge carriers, the interaction between graphene and various impurities leads to a wealth of new physics and degrees ...

Ohmic Contact Fabrication Using a Focused-ion Beam Technique and Electrical Characterization for Layer Semiconductor Nanostructures

Resistiv Kontakta Fabrication Med hjälp av en fokuserad-ion Beam Teknik och elektrisk karakterisering för Layer Semiconductor nanostrukturer

Layer semiconductors with easily processed two-dimensional (2D) structures exhibit indirect-to-direct bandgap transitions and superior transistor ...

In Depth Analyses of LEDs by a Combination of X-ray Computed Tomography (CT) and Light Microscopy (LM) Correlated with Scanning Electron Microscopy (SEM)

In Depth Analyses of LEDs by a Combination of X-ray Computed Tomography CT and Light Microscopy LM Correlated with Scanning Electron Microscopy SEM

I Djup Analyser av lysdioder genom en kombination av röntgen Computed Tomography (CT) och ljusmikroskop (LM) korrelerad med svepelektronmikroskop (SEM)

In failure analysis, device characterization and reverse engineering of light emitting diodes (LEDs), and similar electronic components of ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Sub-nanometer Resolution Imaging med amplitudmodulering atomkraftsmikroskopi i Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Focused Ion Beam Fabrication of LiPON-based Solid-state Lithium-ion Nanobatteries for In Situ Testing

Focused Ion Beam Fabrication of LiPON-based Solid-state Lithium-ion Nanobatteries for In Situ Testing

Fokuserad Ion Beam tillverkning av LiPON-baserade SSD Lithium-ion Nanobatteries för In Situ testning

Solid-state electrolytes are a promising replacement for current organic liquid electrolytes, enabling higher energy densities and improved safety of ...

Three-Dimensional Ultrasonic Needle Tip Tracking with a Fiber-Optic Ultrasound Receiver

Tredimensionellt ultraljud nål spets spårning med en fiberoptisk ultraljud mottagare

Ultrasound is frequently used for guiding minimally invasive procedures, but visualizing medical devices is often challenging with this imaging modality. ...

Controllable Nucleation of Cavitation from Plasmonic Gold Nanoparticles for Enhancing High Intensity Focused Ultrasound Applications

Kontrollerbar kärnbildning av kavitation från plasmoniska guld nanopartiklar för att förbättra hög intensitet fokuserat ultraljud program

In this study, plasmonic gold nanoparticles were simultaneously exposed to pulsed near-infrared laser light and high intensity focused ultrasound (HIFU) ...