Name: identification of functional protein regions through chimeric protein construction
Uploaded: 2019-01-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction at JoVE.com

أيد هذا العمل جمعية ماكس بلانك، و Schüchtermann-العيادة (روثينفيلدي سيئة، ألمانيا). وكان نشر جزء من هذه البحوث في "مجلة الكيمياء البيولوجية". أدريان-سيغارا، ج. م. شندلر، نون، جاجودا، ص، Lörchner، حاء، براون، ت. & Pöling، ج. حلقة AB ود-الحلزون في ربط الموقع الثالث من م Oncostatin البشرية (OSM) مطلوبة من أجل تنشيط مستقبلات OSM. ج. محاضرة الكيمياء عام 2018؛ 18:7017-7029. © المؤلفين.

1-تصميم البروتين تشيميريك
<ol><li>تحديد بروتين مناسب (المانحين) لتبادل مناطق مع البروتين للفائدة (المتلقي) ينبغي أن يكون البروتين المانحين هيكلياً مشابهة، من الناحية المثالية الذين ينتمون إلى نفس الأسرة البروتين، ولكن تفتقر إلى النشاط البيولوجي لاستخدامها كقراءات. إذا تعرف لا البروتينات ا?...

<ol>
	<li>Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+evolution+of+class-I+helical+cytokines.">Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines.</a> The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).</li><li>Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+and+functions+of+the+human+interleukin+(IL)+gene+family.">Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family.</a> Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).</li><li>Bravo, J., Heath, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+recognition+by+gp130+cytokines.">Receptor recognition by gp130 cytokines.</a> The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).</li><li>Schneider, G., Fechner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-based+de+novo.+design+of+drug-like+molecules.">Computer-based de novo. design of drug-like molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).</li><li>Heydenreich, F. M., Milju&#353;, T., Jaussi, R., Benoit, R., Mili&#263;, D., Veprintsev, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mutagenesis+using+a+two-fragment+PCR+approach.">High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).</li><li>Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., L&#246;rchner, H., Braun, T., P&#246;ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AB+loop+and+D-helix+in+binding+site+III+of+human+Oncostatin+M+(OSM)+are+required+for+OSM+receptor+activation.">The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).</li><li>Wang, Y., Pallen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+characterization+of+wild+type,+truncated,+and+mutant+forms+of+the+intracellular+region+of+the+receptor-like+protein+tyrosine+phosphatase+HPTP+beta.">Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).</li><li>Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+full-length+midkine+reveals+novel+residues+important+for+heparin+binding+and+zebrafish+embryogenesis.">Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis.</a> The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).</li><li>Kim, K. -. W., Vallon-Eberhard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+structure/function+and+expression+analysis+of+the+CX3C+chemokine+fractalkine.">In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine.</a> Blood. 118 (22), 156-167 (2011).</li><li>Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+loop+structure+in+oncostatin+M+determines+binding+affinity+toward+oncostatin+M+receptor+and+leukemia+inhibitory+factor+receptor.">A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).</li><li>Aasland, D., Schuster, B., Gr&#246;tzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+leukemia+inhibitory+factor+receptor+functional+domains+by+chimeric+receptors+and+cytokines.">Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines.</a> Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).</li><li>Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+leukemia+inhibitory+factor+receptor+and+oncostatin+M+receptor+to+signal+transduction+in+heterodimeric+complexes+with+glycoprotein+130.">Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130.</a> Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).</li><li>Kallen, K. J., Gr&#246;tzinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+recognition+sites+of+cytokines+are+organized+as+exchangeable+modules.+Transfer+of+the+leukemia+inhibitory+factor+receptor-binding+site+from+ciliary+neurotrophic+factor+to+interleukin-6.">Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).</li><li>Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+similarities+in+structure+comparison.">Surprising similarities in structure comparison.</a> Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).</li><li>Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMDB+and+VAST+:+tracking+structural+similarities+between+macromolecular+complexes.">MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes.</a> Nucleic Acids Research. 42, 297-303 (2014).</li><li>Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Announcing+the+worldwide+Protein+Data+Bank.">Announcing the worldwide Protein Data Bank.</a> Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).</li><li>Biasini, M., Bienert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWISS-MODEL:+modelling+protein+tertiary+and+quaternary+structure+using+evolutionary+information.">SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information.</a> Nucleic Acids Research. 42, 252-258 (2014).</li><li>Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+structure+homology+modeling+using+SWISS-MODEL+workspace.">Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace.</a> Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).</li><li>Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NCBI's+LocusLink+and+RefSeq.">NCBI's LocusLink and RefSeq.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).</li><li>Sievers, F., Wilm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+scalable+generation+of+high-quality+protein+multiple+sequence+alignments+using+Clustal+Omega.">Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.</a> Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+and+RNA.">Quantitation of DNA and RNA.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Transformation+of+Competent+E.+coli+Using+Calcium+Chloride.">Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+SDS:+Minipreparation.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+Sodium+Dodecyl+Sulfate:+Maxipreps.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).</li><li>Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+transient+recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells.">Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).</li><li>Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+shared+cytokine+receptors.">Structural biology of shared cytokine receptors.</a> Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).</li><li>Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+functional+dissection+of+the+cytostatic+cytokine+oncostatin.">Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin.</a> Structure. 8, 863-874 (2000).</li><li>Huyton, T., Zhang, J. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+cytokine:Ig-domain+interaction+revealed+in+the+crystal+structure+of+leukemia+inhibitory+factor+(LIF)+in+complex+with+the+LIF+receptor.">An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).</li><li>Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+conserved+sequence+motifs+in+cytochrome+P450+family+2.+Functional+and+structural+role+of+a+motif+187RFDYKD192+in+CYP2B+enzymes.">Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).</li><li>Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Functional+Motifs+and+Homology+Modeling+to+Predict+Hidden+Moonlighting+Functional+Sites.">Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).</li><li>McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localised+sequence+regions+possessing+high+melting+temperatures+prevent+the+amplification+of+a+DNA+mimic+in+competitive+PCR.">Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR.</a> Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).</li><li>Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fundamental+study+of+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+templates.">A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates.</a> Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).</li><li>Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+recombinational+cloning+using+gateway+and+in-fusion+cloning+schemes.">Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).</li><li>Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USER+friendly+DNA+engineering+and+cloning+method+by+uracil+excision.">USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision.</a> Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro.+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-fusion+assembly:+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li></ol>

ويشكل توليد بروتينات تشيميريك تقنية متعددة الاستعمالات، وقادرة على تجاوز حدود البروتينات مبتوراً بمعالجة مسائل مثل الجزئية سيتوكين-مستقبلات ملزم المجالات13. تصميم التركيبات هو خطوة أساسية في هذا النوع من الدراسات، ويتطلب دراسة متأنية. الدراسات الأولية إنشاء مجالات وظيفية ?...

يتم تجميع عدة أنواع من البروتينات، بما في ذلك السيتوكينات وعوامل النمو، في أسر أعضاؤها مشاركة هياكل ثلاثية الأبعاد مشابهة ولكن غالباً ما يمارس الوظائف البيولوجية المتميزة1،2. هذا التنوع الوظيفي هو عادة نتيجة للفروق الصغيرة في تكوين الأحماض الأمينية داخل المواقع النشطة للجزيء3. تحديد هذه المواقع والمحددات الوظيفية لا فقط تقدم أفكاراً قيمة تطورية بل أيضا لتصميم أكثر تحديداً يضع ومثبطات4. ومع ذلك، عدد كبير من الاختلافات في تكوين بقايا كثيرا ما وجدت بين البروتينات المرتبطة هيكلياً تعقيد هذه المهمة. على الرغم من أن تشييد المكتبات الكبيرة التي تحتوي على مئات طفرات في الوقت الحاضر ممكناً، تقييم كل الاختلاف بقايا واحد ولا تزال مجموعات منهم صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً جهد5.
تقنيات تقييم أهمية الوظيفية لمناطق كبيرة من البروتين ذات قيمة للحد من العدد البقايا المحتملة إلى الإدارة رقم6وهكذا. وقد البروتينات مبتوراً النهج الأكثر استخداماً لمعالجة هذه القضية. وبناء على ذلك، تعتبر مناطق ذات الصلة الوظيفية إذا تأثرت بحذف المنطقة خاصة7،،من89وظيفة البروتين قيد الدراسة. ومع ذلك، قيداً رئيسيا لهذا الأسلوب أن الحذف يمكن أن تؤثر على هيكل الثانوية للبروتين، مما يؤدي إلى ميسفولدينج والتجميع وعدم القدرة على دراسة المنطقة المقصودة. مثال جيد هو نسخة مقتطعة من oncostatin سيتوكين M (OSM)، الذي درس حذف داخلية أكبر من بقايا 7 أسفرت عن تجمعات متحولة لا يمكن زيادة10.
ويشكل توليد بروتينات تشيميريك نهج البديلة والمبتكرة التي تسمح بتحليل مناطق أكبر من البروتين. والهدف من هذا الأسلوب تبادل المناطق ذات الاهتمام في بروتين بتسلسل يتصل هيكلياً في بروتين آخر، بغية تقييم مساهمة الفروع حل محل للوظائف البيولوجية المحددة. يستخدم على نطاق واسع في مجال إشارات مستقبلات لتحديد المجالات الوظيفية11،12، البروتينات تشيميريك مفيدة بشكل خاص لدراسة البروتين الأسر مع القليل من الأحماض الأمينية الهوية لكن الهيكل الثانوي المصانة. يمكن العثور على أمثلة المناسبة في الفئة من انترلوكين-6 السيتوكينات (إيل-6) نوع، كعامل نيوروتروفيك انترلوكين-6 والهدبيه (6% تسلسل الهوية)13 أو اللوكيميا العوامل المثبطة (LIF) و OSM (هوية 20%)6، الذي ويستند اتباع البروتوكول.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:599px;" width="599">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Labcycler thermocycler</td>
			<td style="width:97px;">Sensoquest</td>
			<td style="width:119px;">011-103</td>
			<td style="width:167px;">Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000C&#160;</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler 100 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AscI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PacI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Hot Start II DNA Polymerase</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP set (100 mM)</td>
			<td style="width:97px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:97px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:97px;">Macherey-Nagel</td>
			<td align="right" style="width:119px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MHS6278-202857165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LE agarose</td>
			<td style="width:97px;">Biozym</td>
			<td align="right" style="width:119px;">840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:97px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Human Oncostatin M cDNA</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital W&#252;rzburg, Germany)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Andr&#233; Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of functional protein regions through chimeric protein construction

والهدف من هذا البروتوكول يشمل تصميم البروتينات تشيميريك فيها مناطق متميزة من البروتين تحل محلها تسلسل المقابلة في بروتين هيكلياً مشابهة، من أجل تحديد أهمية هذه المناطق الوظيفية. مثل هذه التركيبات يتم إنشاؤها بواسطة بروتوكول PCR متداخلة باستخدام شظايا من الحمض النووي متداخلة والمصممة على نحو كاف الإشعال، متبوعاً بالتعبير عنها ضمن نظام الثدييات لضمان هيكل الثانوية الأصلية والتعديلات بوستترانسلاشونال.
ثم يشار إلى الدور الوظيفي لمنطقة متميزة بفقدان نشاط الوهم في مقايسة قراءات مناسبة. ونتيجة لذلك، يتم تحديد مناطق إيواء مجموعة من الأحماض الأمينية الهامة، التي يمكن أن تكون كذلك فرزهم بتقنيات تكميلية (مثل موقع الموجه الطفرات) لزيادة دقة الجزيئية. على الرغم من أن يقتصر على الحالات التي يمكن العثور على بروتين هيكلياً المتصلة بوظائف مختلفة، البروتينات تشيميريك قد استخدمت بنجاح لتحديد المناطق الحرجة ملزمة في البروتينات مثل السيتوكينات وسيتوكين المستقبلات. هذا الأسلوب هو مناسبة خاصة في الحالات التي لا تكون المناطق الوظيفية للبروتين محددة تحديداً جيدا، ويشكل خطوة أولى قيمة في نهج التطور الموجه لتضييق المناطق ذات الاهتمام وتقليل الجهد الفحص المعنية.

وسوف تجسد البناء وتوليد بروتين تشيميريك (الشكل 1) مع اثنين من أعضاء الأسرة سيتوكين انترلوكين-6، OSM وليف، والتي كانت موضوع دراسة نشرت مؤخرا6. ويبين الشكل 2 هيكل ثلاثي الأبعاد لهذه البروتينات. كلا جزيئات اعتماد هيكل الثانوية المم?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction at JoVE.com

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

وكثيراً ما تمارس البروتينات المرتبطة هيكلياً الوظائف البيولوجية المتميزة. تبادل مناطق ما يعادل هذه البروتينات من أجل خلق البروتينات تشيميريك يشكل نهجاً مبتكراً لتحديد المناطق الحرجة البروتين التي المسؤولة عن الاختلاف الوظيفي.

تحديد المناطق الوظيفية البروتين من خلال تشييد البروتين تشيميريك

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

تبادل مناطق من البروتينات مماثلة هيكليا لخلق كيميراس يسمح لنا للتحقيق في أهمية المناطق المسؤولة عن الوظائف البيولوجية للجزيء الذي يتعين دراسته. المنطقة تبادل predoff الهيكل الثانوي العام للبروتين بحيث المنطقة الهامة لانها هيكل شامل يمكن تمييزها عن تلك التي تتوسط مباشرة وظائف البيولوجية. هو يستطيع كنت حوّلت داخل انتقيت أيّ مناطق دقيقة أن يكون استبدلت.البدء بتبادل أكبر عادة ما يكون مفيداً لتحديد وظيفة البروتين الرئيسية. لبدء الإجراء، حدد بروتين مناسب كمتبرع لتبادل المناطق مع البروتين من الفائدة كما هو مفصل في بروتوكول النص. ثم، والحصول على تسلسل البروتينات من الأحماض الأمينية من البروتينات المتلقي والمتبرع من قاعدة بيانات تسلسل مرجع من خلال الوصول أولا إلى قسم الجينات في صفحة ويب سيك.اكتب اسم البروتين الذي يهمك في مربع البحث وانقر فوق البحث. انقر على اسم الجين للأنواع المطلوبة في القائمة الناتجة. مرر لأسفل إلى المقطع seq المرجع لرؤية كافة isoforms موثقة.انقر على معرّف التسلسل لـ isoform من الفائدة. انتقل لأسفل وانقر على الأقراص المدمجة لتسليط الضوء على منطقة ترميز البروتين من الجين. في أسفل يمين الشاشة، انقر على FAFSDA وانسخ التسلسل الجيني.حفظ تسلسل الحمض النووي باستخدام برنامج مناسب لتحرير الحمض النووي. عند استخدام APE المتوفرة بحرية، افتح البرنامج، ولصق التسلسل المنسوخ في المربع الفارغ، وحدد اسم التسلسل، وانقر فوق حفظ. الآن، اختر مناطق البروتين التي سيتم استبدالها في بنيات الكيكم المختلفة من خلال تقسيم تسلسل البروتين من الاهتمام في المناطق الهيكلية المتميزة.للقيام بذلك، تحميل البيانات الهيكلية للبروتين من الفائدة من الموقع PDBe. الوصول إلى صفحة PDBe للبروتين وتحميل ملف PDBe بالنقر فوق التحميل في الجانب الأيمن من الشاشة. افتح ملف PDBe في نظام التصور الجزيئي ، مثل Pymol.في بيمول، قم بعرض تسلسل النيوكليوتيدات، وإخفاء البيانات الهيكلية الافتراضية واختيار طريقة عرض الرسوم المتحركة لتصور الميزات الهيكلية للبروتين بوضوح. انقر على تسلسل النيوكليوتيدات في الجزء العلوي من الشاشة لتسليط الضوء على أجزاء مختلفة من الجزيء، مشيرا إلى الأحماض الأمينية المقابلة لكل سمة هيكلية مميزة. الآن، تعليقات توضيحية للمناطق الهيكلية المتميزة على تسلسل الحمض النووي في APE من خلال فتح تسلسل الحمض النووي، واختياره، والنقر على ترجمة ORFs، ثم انقر على الأحماض الأمينية الأخيرة من المنطقة الأولى لتسليط الضوء على موقفها في تسلسل الحمض النووي واختيار ترميز النيوكليوتيد لتلك المنطقة.انقر بزر الماوس الأيمن على التحديد وحدد ميزة جديدة لإعطائها اسم ولون. كرر العملية لكل منطقة هيكلية تم تحديدها في الخطوة السابقة. لمحاذاة متواليات بقايا اثنين من البروتينات، أولا، الحصول على تسلسل كامل من الأحماض الأمينية من البروتينات المانحة والمستقبلات في APE.كما كان من قبل، افتح تسلسل الحمض النووي للمتبرع، وحدده، وانقر فوق ترجمة ORFs. ثم, الوصول إلى صفحة الويب أوميغا Clustal ومن ثم وضع تسلسل الأحماض الأمينية من اثنين من البروتينات. وينبغي أن يتم المضي في كل تسلسل بواسطة سطر نص مع اسم البروتين ليتم تحديدها بشكل صحيح.مرر لأسفل وانقر على إرسال. استرداد ملف المحاذاة بالنقر فوق علامة التبويب ملف محاذاة التحميل وحفظه. يمكن فتح هذا الملف بواسطة أي برنامج تحرير النص.باستخدام ملف المحاذاة كمرجع، تعليقات توضيحية للمناطق الهيكلية المقابلة للبروتين المانح في تسلسل الحمض النووي. إنشاء نسخة من تسلسل الحمض النووي المشروح من البروتين مستقبلات وإعادة تسميته كبروتين الكيكم. افتح تسلسل الحمض النووي المعاد تسميته في APE.حدد المنطقة التي سيتم تبادلها في البروتين المانح، ثم حدد المنطقة المقابلة في بروتين المستقبلات المعاد تسميته. لصق تسلسل الحمض النووي البروتين المانح، ومن ثم حفظ التغييرات. تصميم التمهيديات الطرفية باستخدام محرر الحمض النووي مثل APE.إنشاء ملف الحمض النووي الجديد، بدء التمهيدي نهاية الطرفية مع تسلسل زعيم. متبوعاً موقع التقييد الأول المحدد في ناقلات MCS و spacer اختياري في أزواج قاعدة 18 إلى 27 الأولي من الجين من الفائدة. في ملف الحمض النووي الجديد، تصميم تسلسل التمهيدي المحطة C لتبدأ أزواج قاعدة 18 إلى 27 النهائي من الجين الفائدة تليها الفضاء اختياري، وموقع تقييد الثاني المختار، وتسلسل زعيم.تسليط الضوء على تسلسل كامل، انقر بزر الماوس الأيمن، وحدد عكس مجاملة للحصول على التمهيدي العكسي. الآن، تصميم التمهيديات لكل من المناطق الحدودية في بنيات الكيكمي. في تسلسل الحمض النووي للكيميرا، سلط الضوء على منطقة زوج 30 قاعدة في المنطقة حيث يتم الاتصال بالتسلسل الأصلي والمدرج.وهذا يتكون من 15 زوجاً من أزواج الأساس في كل تسلسل. انسخ المنطقة، ولصقها في ملف حمض نووي جديد. هذا التسلسل سيكون التمهيدي الأمام.قم بعمل نسخة من التمهيدي الأمامي الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة، ثم أعد تسميته كـ التمهيدي العكسي. تسليط الضوء على تسلسل التمهيدي ، انقر بزر الماوس الأيمن ، وحدد مجاملة عكسي لتوليد تسلسل التمهيدي العكسي. كرر هذه الخطوات لكل منطقة اتصال في تسلسل الحمض النووي الكيكمي.عموما، هناك حاجة إلى مجموعتين من التمهيديات العكسية الأمامية لإنشاء كيميرا واحدة، ما لم يحدث الاستبدال في المناطق الطرفية N أو C. إعداد مزيج تفاعل PCR الفردية لكل من شظايا يؤلف البروتين الكيكمي. تعيين أول نقطة واحدة خمس mililiter microfuse أنبوب على الجليد pipet والكواشف المختلفة من خليط PCR في الترتيب المذكور في بروتوكول النص.ضمان استخدام التمهيديات والقوالب الصحيحة لكل تفاعل PCR. تسمية اثنين رقيقة مسورة صفر نقطة اثنين من أنابيب PCR mililiter لكل رد فعل ونقل 20 ميكرولترات من خليط PCR المقابلة في كل أنبوب. نقل أنابيب PCR إلى ثيرسيكلر PCR وبدء البروتوكول كما هو مفصل في بروتوكول النص.بعد اكتمال تفاعل PCR، إضافة أربعة ميكرولترات من ستة × الحمض النووي تحميل العازلة في كل أنبوب. أدخل واحد في المئة agaross هلام في وحدة الكهرباء والغطاء مع عازلة TAE. تحميل بعناية العينات في هلام جنبا إلى جنب مع الوزن الجزيئي الأخير.بعد تشغيل الجل في 80 إلى 120 فولت لمدة 20 إلى 45 دقيقة، إيقاف وحدة الكهرباء وإزالة هلام أفيروس. تصور نطاقات الحمض النووي المضخمة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع شظايا الحمض النووي الفردية من هلام ونقلها إلى اثنين من أنابيب microfuse الميلليتر المسمى.بعد استخدام مجموعة تنظيف PCR لتنقية شظايا الحمض النووي ، وتحديد كمية الحمض النووي المستعادة عن طريق قياس امتصاص العينات في 260 نانومتر و 340 نانومتر في مقياس الطيف. الآن، تنفيذ تضخيم PCR لتوليد تسلسل الحمض النووي الكيكمي. أولاً، قم بإعداد 50 ميكروليتر من تفاعل PCR لدمج المكونات المنفصلة للكيميرا كما كان من قبل.استخدام محطة N والناائي C التمهيدية جنبا إلى جنب مع 10 نانوغرام من كل من شظايا الحمض النووي تضخيمها. استرداد وتحديد كمية جزء الحمض النووي المنقى كما كان من قبل، في 30 ميكرولترات من المياه الحرة النواة. تحتوي هذه القطعة على تسلسل الحمض النووي الكيميري الذي يحيط به مواقع التقييد المضمنة في السطوح التمهيدية الطرفية.وتجسد جيل من البروتين الكيكمي مع اثنين من أعضاء في مجموعة لوك وعائلة الستة sytokine. Oncostaten M في عامل مثبطة سرطان الدم. وOSM رفع كيميرا النتائج من تبادل منطقة حلقة BC من OSM مع تسلسل رفع المقابلة.وتألفت أول خطوة تضخيم لـ PCR من ثلاثة تفاعلات منفصلة. يستخدم الجزء OSM N-terminal، الذي يتطلب OSM N-terminal إلى الأمام وبدء BC التمهيدي العكسي OSM كقالب. تم الحصول على حلقة LIF BC من خلال بدء BC إلى الأمام والبدء العكسي BC N باستخدام LIF كقالب.يستخدم جزء OSM C-terminal نهاية BC إلى الأمام و C ال التمهيديات العكسية OSM الطرفية بالإضافة إلى OSM كقالب. ثم استخدمت هذه الشظايا المنقية كقالب في تفاعل PCR الثاني مع N-terminal OSM إلى الأمام و C-terminal OSM عكس التمهيدي لتضخيم تسلسل الجينات حلقة OSM LIF BC المقابلة. بعد تنقية والتحول إلى الإشريكية القولونية، تم عزل البلازميدات الفردية وفحصها عن طريق تقييد الهضم الإنزيمي لإدراج سليم من جزء الحمض النووي.جل electrophoresis كشفت عن الضربات الإيجابية التي تم إرسالها بعد ذلك للتحقق من التسلسل. البروتينات الكيكمي يجب أن تنتج والنشاط تقاس في أنظمة فئوية مثالية. من أجل تحديد أهمية المناطق التي تم استبدالها لهذا الفصيل بالذات.وقد كانت هذه التقنية مفيدة جدا وكثيرا ما تطبق، وتدخلت من مستقبلات signally من أجل تحديد المجالات وظيفة رئيسية ومواقع التعرف على مستقبلات. وينبغي التعامل مع عدد يمكنني استخدام لكهربية الحمض النووي باستخدام قفازات المتاح، معطف المختبر والنظارات الواقية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

الببتيدات اختراق الخلية بيوتينيلاتيد لدراسة تفاعلات البروتين البروتين داخل الخلايا

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 في 1: انجذاب تطهير لتحليل مواز للبروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المجمعات من خطوة واحدة

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

تجميد التساهمية من البروتينات للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

تطبيق قياس التداخل الحيوي (BLI) لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في النسخ

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

تقييم تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...