Name: identification of functional protein regions through chimeric protein construction
Uploaded: 2019-01-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Max Planck Society og Schüchtermann-klinikken (Bad Rothenfelde, Tyskland). En del af denne forskning blev oprindeligt offentliggjort i Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. AB loop og D-helix i bindingssted III af menneskelige Oncostatin M (OSM) er påkrævet for OSM receptor aktivering. J. Biol. Chem. 2018; 18:7017-7029. © forfatterne.

1. kimære Protein Design
<ol><li>Vælg en egnet protein (donor) at udveksle regioner med protein af interesse (modtageren) donor protein bør være strukturelt ens, ideelt tilhører samme protein familie, men mangler den biologiske aktivitet skal bruges som udlæsning. Hvis ingen strukturelt relaterede proteiner er kendt, kan potentielle kandidater identificeres ved hjælp af en automatiseret værktøj såsom vektor justering søgning værktøj (VAST)14,15<ol>...

<ol>
	<li>Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+evolution+of+class-I+helical+cytokines.">Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines.</a> The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).</li><li>Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+and+functions+of+the+human+interleukin+(IL)+gene+family.">Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family.</a> Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).</li><li>Bravo, J., Heath, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+recognition+by+gp130+cytokines.">Receptor recognition by gp130 cytokines.</a> The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).</li><li>Schneider, G., Fechner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-based+de+novo.+design+of+drug-like+molecules.">Computer-based de novo. design of drug-like molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).</li><li>Heydenreich, F. M., Milju&#353;, T., Jaussi, R., Benoit, R., Mili&#263;, D., Veprintsev, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mutagenesis+using+a+two-fragment+PCR+approach.">High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).</li><li>Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., L&#246;rchner, H., Braun, T., P&#246;ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AB+loop+and+D-helix+in+binding+site+III+of+human+Oncostatin+M+(OSM)+are+required+for+OSM+receptor+activation.">The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).</li><li>Wang, Y., Pallen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+characterization+of+wild+type,+truncated,+and+mutant+forms+of+the+intracellular+region+of+the+receptor-like+protein+tyrosine+phosphatase+HPTP+beta.">Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).</li><li>Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+full-length+midkine+reveals+novel+residues+important+for+heparin+binding+and+zebrafish+embryogenesis.">Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis.</a> The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).</li><li>Kim, K. -. W., Vallon-Eberhard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+structure/function+and+expression+analysis+of+the+CX3C+chemokine+fractalkine.">In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine.</a> Blood. 118 (22), 156-167 (2011).</li><li>Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+loop+structure+in+oncostatin+M+determines+binding+affinity+toward+oncostatin+M+receptor+and+leukemia+inhibitory+factor+receptor.">A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).</li><li>Aasland, D., Schuster, B., Gr&#246;tzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+leukemia+inhibitory+factor+receptor+functional+domains+by+chimeric+receptors+and+cytokines.">Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines.</a> Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).</li><li>Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+leukemia+inhibitory+factor+receptor+and+oncostatin+M+receptor+to+signal+transduction+in+heterodimeric+complexes+with+glycoprotein+130.">Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130.</a> Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).</li><li>Kallen, K. J., Gr&#246;tzinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+recognition+sites+of+cytokines+are+organized+as+exchangeable+modules.+Transfer+of+the+leukemia+inhibitory+factor+receptor-binding+site+from+ciliary+neurotrophic+factor+to+interleukin-6.">Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).</li><li>Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+similarities+in+structure+comparison.">Surprising similarities in structure comparison.</a> Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).</li><li>Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMDB+and+VAST+:+tracking+structural+similarities+between+macromolecular+complexes.">MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes.</a> Nucleic Acids Research. 42, 297-303 (2014).</li><li>Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Announcing+the+worldwide+Protein+Data+Bank.">Announcing the worldwide Protein Data Bank.</a> Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).</li><li>Biasini, M., Bienert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWISS-MODEL:+modelling+protein+tertiary+and+quaternary+structure+using+evolutionary+information.">SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information.</a> Nucleic Acids Research. 42, 252-258 (2014).</li><li>Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+structure+homology+modeling+using+SWISS-MODEL+workspace.">Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace.</a> Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).</li><li>Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NCBI's+LocusLink+and+RefSeq.">NCBI's LocusLink and RefSeq.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).</li><li>Sievers, F., Wilm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+scalable+generation+of+high-quality+protein+multiple+sequence+alignments+using+Clustal+Omega.">Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.</a> Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+and+RNA.">Quantitation of DNA and RNA.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Transformation+of+Competent+E.+coli+Using+Calcium+Chloride.">Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+SDS:+Minipreparation.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+Sodium+Dodecyl+Sulfate:+Maxipreps.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).</li><li>Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+transient+recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells.">Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).</li><li>Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+shared+cytokine+receptors.">Structural biology of shared cytokine receptors.</a> Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).</li><li>Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+functional+dissection+of+the+cytostatic+cytokine+oncostatin.">Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin.</a> Structure. 8, 863-874 (2000).</li><li>Huyton, T., Zhang, J. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+cytokine:Ig-domain+interaction+revealed+in+the+crystal+structure+of+leukemia+inhibitory+factor+(LIF)+in+complex+with+the+LIF+receptor.">An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).</li><li>Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+conserved+sequence+motifs+in+cytochrome+P450+family+2.+Functional+and+structural+role+of+a+motif+187RFDYKD192+in+CYP2B+enzymes.">Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).</li><li>Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Functional+Motifs+and+Homology+Modeling+to+Predict+Hidden+Moonlighting+Functional+Sites.">Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).</li><li>McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localised+sequence+regions+possessing+high+melting+temperatures+prevent+the+amplification+of+a+DNA+mimic+in+competitive+PCR.">Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR.</a> Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).</li><li>Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fundamental+study+of+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+templates.">A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates.</a> Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).</li><li>Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+recombinational+cloning+using+gateway+and+in-fusion+cloning+schemes.">Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).</li><li>Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USER+friendly+DNA+engineering+and+cloning+method+by+uracil+excision.">USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision.</a> Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro.+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-fusion+assembly:+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li></ol>

Generation af kimære proteiner udgør en alsidig teknik, som er i stand til at gå ud over grænserne for afkortede proteiner til løsning af spørgsmål såsom modularitet af cytokin-receptor binding domæner13. Design af kimærer er et vigtigt skridt i denne form for undersøgelser, og kræver nøje overvejelse. Foreløbige undersøgelser at etablere funktionelle domæner vil generelt kræve substitution af brede regioner i en første fase, mens mindre udskiftninger af variabel længde er mere ...

Flere typer af proteiner, herunder cytokiner og vækstfaktorer, er grupperet i familier hvis medlemmer deler lignende tredimensionale strukturer, men ofte lægge forskellige biologiske funktioner1,2. Denne funktionelle mangfoldighed er normalt følge af små forskelle i aminosyresammensætning inden for det molekyle aktive steder3. Identifikation af sådanne websteder og funktionaldeterminanter ikke kun tilbyder værdifuld evolutionære indsigt men også til at designe mere specifikke agonister og hæmmere4. Men det store antal forskelle i rest sammensætning ofte findes mellem strukturelt relaterede proteiner komplicerer denne opgave. Selvom konstruere store biblioteker, der indeholder hundredvis af mutanter er i dag muligt, vurdere hver enkelt rest variation og kombinationer af dem er stadig en udfordrende og tidskrævende indsats5.
Teknikker vurdere store protein regioner funktionelle betydning er således af værdi at reducere antallet af mulige rester til et overskueligt antal6. Afkortet proteiner har været den mest anvendte metode til at tackle dette problem. Regioner er derfor anses for at være funktionelt relevante, hvis funktionen protein under undersøgelse er påvirket af fjernelsen af en bestemt region7,8,9. En stor begrænsning af denne metode er dog at sletninger kan påvirke det protein sekundær struktur, fører til misfoldning, sammenlægning og manglende evne til at studere den tilsigtede region. Et godt eksempel er en trunkeret version af cytokin oncostatin M (OSM), hvor en indre sletning større end 7 rester resulterede i en fejlfoldede mutant, der ikke kunne yderligere undersøgt10.
Generation af kimære proteiner udgør en alternativ og innovative tilgang, der tillader analyse af større protein regioner. Målet med denne metode er at udveksle regioner af interesse i et protein af strukturelt beslægtede sekvenser i et andet protein, for at vurdere bidrag af de udskiftede dele til specifikke biologiske funktioner. Udbredt inden for signalering receptorer til at identificere funktionelle domæner11,12, er kimære proteiner særligt nyttige til at undersøge protein familier med lidt aminosyre identitet men bevarede sekundær struktur. Relevante eksempler kan findes i klassen af interleukin-6 (IL-6) type cytokiner, såsom interleukin-6 og ciliaere neurotrope faktor (6% sekvens identitet)13 eller leukæmi hæmmende faktor (LIF) og OSM (20% identitet)6, hvor den følgende protokol er baseret.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:599px;" width="599">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Labcycler thermocycler</td>
			<td style="width:97px;">Sensoquest</td>
			<td style="width:119px;">011-103</td>
			<td style="width:167px;">Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000C&#160;</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler 100 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AscI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PacI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Hot Start II DNA Polymerase</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP set (100 mM)</td>
			<td style="width:97px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:97px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:97px;">Macherey-Nagel</td>
			<td align="right" style="width:119px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MHS6278-202857165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LE agarose</td>
			<td style="width:97px;">Biozym</td>
			<td align="right" style="width:119px;">840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:97px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Human Oncostatin M cDNA</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital W&#252;rzburg, Germany)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Andr&#233; Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of functional protein regions through chimeric protein construction

Målet med denne protokol omfatter udformningen af kimære proteiner, forskellige regioner af en protein erstattes af deres tilsvarende sekvenser i et strukturelt lignende protein, for at bestemme den funktionelle betydning af disse regioner. Disse kimærer er genereret ved hjælp af et indlejret PCR-protokol ved hjælp af overlappende DNA fragmenter og tilstrækkeligt designet primere, efterfulgt af deres udtryk inden for et pattedyr system til at sikre indfødte sekundær struktur og posttranslationelle modifikationer.
Den funktionelle rolle i et særskilt område angives derefter med et tab af aktiviteten af chimera i en passende udlæsning assay. Derfor identificeres regioner huser en række kritiske aminosyrer, der kan være yderligere screenet af supplerende teknikker (f.eks. site-directed mutagenese) at øge molekylære opløsning. Selv om begrænset til tilfælde, hvor der kan findes en strukturelt relaterede proteiner med forskellige funktioner, er kimære proteiner blevet med held ansat til at identificere kritiske bindende regioner i proteiner som cytokiner og cytokin receptorer. Denne metode er særligt egnet i tilfælde, hvor det protein funktionelle regioner ikke er veldefineret, og udgør et værdifuldt første skridt i styret evolution tilgange til at indsnævre regioner af interesse og reducere screening kræfter involveret.

Konstruktion og produktion af en kimære protein (figur 1) vil blive eksemplificeret med to medlemmer af familien interleukin-6 cytokin OSM og LIF, som var genstand for en nyligt offentliggjort undersøgelse6. Figur 2 viser de tre-dimensionelle struktur af disse proteiner. Begge molekyler vedtage den karakteristiske sekundær struktur af klasse jeg cytokiner, med fire helices (betegnes A til D) pakket i en...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction at JoVE.com

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Strukturelt relaterede proteiner udøve ofte forskellige biologiske funktioner. Udveksling af tilsvarende regioner af disse proteiner for at skabe kimære proteiner udgør en innovativ tilgang til at identificere kritiske protein regioner, der er ansvarlige for deres funktionelle divergens.

Identifikation af funktionelle Protein regioner gennem kimære Protein konstruktion

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Udveksling af regioner af strukturelt lignende proteiner til at skabe kimeras giver os mulighed for at undersøge betydningen af regioner, der er ansvarlige for biologiske funktioner i molekylet, der skal undersøges. Region udvekslinger predoff den generelle sekundære struktur af proteinet, så regionens vigtige for det overordnede struktur kan skelnes fra dem, der direkte mægle biologiske funktioner. Det kan være at blive til at vælge, hvilke nøjagtige regioner der skal erstattes.Startende med større udvekslinger er normalt nyttigt at identificere proteinets vigtigste funktionalitet. For at starte proceduren skal du vælge et egnet protein som donor for at udveksle regioner med det protein af interesse, der er beskrevet i tekstprotokollen. Derefter opnås protein aminosyre sekvenser af modtageren og donor proteiner fra referencesekvens database ved først at få adgang til gensektionen i ref seq webside.Skriv navnet på det protein, der er af interesse i søgefeltet, og klik på Søg. Klik på gennavnet for de ønskede arter på den resulterende liste. Rul ned til ref seq-sektionen for at se alle de dokumenterede isoformer.Klik på sekvens-id'et for interesseisoformen. Rul ned og klik på cd'er for at fremhæve proteinkodningsområdet af genet. Nederst til højre på skærmen skal du klikke på FAFSDA og kopiere gensekvensen.Gem DNA-sekvensen ved hjælp af en passende DNA-redigeringssoftware. Når du bruger den frit tilgængelige APE, skal du åbne programmet, indsætte den kopierede sekvens i det tomme felt, markere sekvensnavnet og klikke på Gem. Vælg nu de proteinregioner, der skal erstattes i de forskellige kimeriske konstruktioner, ved først at dividere proteinsekvensen af interesse i forskellige strukturregioner.For at gøre dette, downloade de strukturelle data af protein af interesse fra PDBe hjemmeside. Få adgang til PDBe-siden for proteinet, og download PDBe-filen ved at klikke på download i højre side af skærmen. Åbn PDBe-filen i et molekylært visualiseringssystem, f.eks.I Pymol skal du vise nukleotidsekvensen, skjule standardstrukturdataene og vælge tegneserievisningen for klart at visualisere proteinets strukturelle træk. Klik på nukleotid sekvens øverst på skærmen for at fremhæve forskellige dele af molekylet, at notere aminosyrer svarende til hver karakteristiske strukturelle træk. Anmærk nu de forskellige strukturelle områder på DNA-sekvensen i APE ved at åbne DNA-sekvensen, vælge den og klikke på ORF'er oversætte, og klik derefter på den sidste aminosyre i den første region for at fremhæve sin position i DNA-sekvensen og vælge nukleotids kodning for den pågældende region.Højreklik på markeringen og vælg ny funktion for at give det et navn og en farve. Gentag processen for hver strukturregion, der er identificeret i det forrige trin. For at justere restsekvenserne af de to proteiner, først, få den fulde aminosyre sekvenser af donor og receptor proteiner i APE.Som før skal du åbne donor-DNA-sekvensen, markere den og klikke på ORF'er oversætte. Derefter få adgang til Clustal Omega webside og derefter sætte aminosyre sekvenser af de to proteiner. Hver sekvens skal udføres ved hjælp af en tekstlinje med proteinnavn, der skal identificeres korrekt.Rul ned, og klik på Send. Hent justeringsfilen ved at klikke på fanen downloadjusteringsfil, og gem den. Denne fil kan åbnes af ethvert tekstredigeringsprogram.Ved hjælp af justeringsfilen som reference anmærkes de tilsvarende strukturelle områder af donorproteinet i deres DNA-sekvens. Opret en kopi af den kommenterede DNA-sekvens af receptorproteinet og omdøb den som et kimerprotein. Åbn den omdøbte DNA-sekvens i APE.Vælg den region, der skal udveksles i donorproteinet, og vælg derefter det tilsvarende område i det omdøbte receptorprotein. Indsæt donorprotein-DNA-sekvensen, og gem derefter ændringerne. Design terminalprimerne ved hjælp af en DNA-editor som APE.Opret en ny DNA-fil, indlede ende terminal primer med en leder sekvens. Efterfulgt af den første begrænsning site udvalgt i vektorer MCS og den valgfrie spacer i den oprindelige 18 til 27 base par af genet af interesse. I den nye DNA-fil, designe C terminal primer sekvens til at starte med den endelige 18 til 27 base par af genet af interesse efterfulgt af en valgfri spacer, den anden begrænsning site valgt, og leder sekvens.Fremhæv hele sekvensen, højreklik, og vælg omvendt kompliment for at få den omvendte primer. Nu skal du designe primere for hver af grænseregionerne i kimeriske konstruktioner. I kimeraens DNA-sekvens skal du fremhæve et 30 basisparområde i den zone, hvor de oprindelige og indsatte sekvenser er i kontakt.Dette består af 15 basispar i hver sekvens. Kopier området, og indsæt det i en ny DNA-fil. Denne sekvens vil være den forreste primer.Lav en kopi af den fremadrettede primer, der blev genereret i det forrige trin, og omdøb den som den omvendte primer. Fremhæv primersekvensen, højreklik, og vælg omvendt kompliment for at generere den omvendte primersekvens. Gentag disse trin for hver kontaktzone i den kimeriske DNA-sekvens.Generelt er der behov for to sæt fremadrettede primere for at generere en kimera, medmindre udskiftningen sker i N-terminal- eller C-terminalområderne. Forbered en individuel PCR reaktion blanding for hver af de fragmenter komponere kimeric protein. Først sættes et et punkt fem mililiter mikrofuse rør på is og pipet de forskellige reagenser af PCR blandinger i den rækkefølge, der er anført i tekstprotokollen.Sørg for, at der anvendes korrekte primere og skabeloner til hver PCR-reaktion. Mærl to tynde vægede nulpunkt to mililiter PCR-rør for hver reaktion og overfør 20 mikroliter af den tilsvarende PCR-blanding i hvert rør. Overfør PCR-rørene til en PCR-termocyr, og initier protokollen som beskrevet i tekstprotokollen.Når PCR-reaktionen er afsluttet, tilsættes fire mikroliter på seks x DNA-belastningsbuffer i hvert rør. Indsæt den ene procent agaross gel i en elektroforese enhed og dække med TAE buffer. Læg forsigtigt prøverne i gelen sammen med en molekylvægt sidstnævnte.Efter at have kørt gelen ved 80 til 120 volt i 20 til 45 minutter, skal du slukke for elektroforeseenheden og fjerne agoross gelen. Visualiser de forstærkede DNA-bånd under UV-lys. Ved hjælp af et barberblad, skåret de enkelte DNA fragmenter fra gelen og overføre dem til mærket to mililiter mikrofuse rør.Efter brug af et PCR-oprydningssæt til at rense DNA-fragmenterne kvantificeres mængden af DNA, der genvindes, ved at måle prøvernes absorbans ved 260 nanometer og 340 nanometer i et spektrofetometer. Nu udføre PCR forstærkning til at generere kimeric DNA-sekvens. Først skal du oprette 50 mikroliter af en PCR reaktion til at smelte de separate bestanddele af kimera som før.Anskjærg N terminal og C terminal primere sammen med 10 nanogram af hver af de forstærkede DNA fragmenter. Genvind og kvantificere det rensede DNA-fragment som før i 30 mikroliter kernefrit vand. Dette fragment indeholder den kimeriske DNA-sekvens flankeret af de begrænsningssteder, der indgår i terminalprimerne.Generation af et kimerisk protein er eksemplificeret med to medlemmer af inter luke og seks sytokin familie. Oncostaten M i leukæmi hæmmende faktor. OSM lift kimera resultater fra udveksling af BC loop region OSM med en tilsvarende lift sekvens.Det første PCR-forstærkningstrin bestod af tre separate reaktioner. N-terminal OSM fragment, som krævede N-terminal OSM fremad og BC start omvendt primere brugt OSM som skabelon. LIF BC loop blev opnået gennem BC start fremad og BC N omvendt primere ved hjælp af LIF som skabelon.C-terminal OSM fragment, der anvendes BC ende fremad og C terminal OSM omvendt primere samt OSM som skabelonen. Disse rensede fragmenter blev derefter brugt som skabelon i den anden PCR reaktion sammen med N-terminal OSM fremad og C-terminal OSM omvendt primere til at forstærke den tilsvarende OSM LIF BC loop gensekvens. Efter rensning og omdannelse til e-coli blev individuelle plasmider isoleret og screenet ved begrænsning af enzymfordøjelsen for korrekt indsættelse af DNA-fragmentet.Gel elektroforese afslørede positive hits, som derefter blev sendt til sekvens verifikation. Kimeriske proteiner skal produceres, og aktiviteten måles i et perfekt fraktionalitetssystem. For at fastslå betydningen af de erstattede regioner for netop denne fraktion.Denne teknik har været meget nyttig og hyppigt anvendt, forstyrret af signal receptorer med henblik på at identificere centrale funktion domæner og receptor anerkendelse websteder. Det antal, jeg bruger til DNA-elektroforese, skal håndteres ved hjælp af engangshandsker, en laboratoriekittel og beskyttelsesbriller.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated celle-gennemtrængende peptider til at studere intracellulær Protein-protein interaktioner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: et-trins affinitet rensning for den parallelle analyse af Protein-Protein og Protein-metabolit komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering af proteiner for enkelt molekyle kraft spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anvendelse af Biolayer interferometri (BLI) til undersøgelse af protein-protein interaktioner i transkriptionen

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluering af protein-protein interaktioner ved hjælp af en on-membran fordøjelse teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Oprettelse af meget specifikke kemisk induceret protein Dimerization systemer ved trinvis Phage udvælgelse af en kombinatorisk enkelt domæne antistof bibliotek