Name: identification of functional protein regions through chimeric protein construction
Uploaded: 2019-01-08T15:00:00
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Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft und der Schüchtermann-Klinik (Bad Rothenfelde, Deutschland) unterstützt. Teil dieser Forschung wurde ursprünglich im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. Die AB Schleife und D-Helix in Bindungsstelle III des menschlichen Oncostatin M (OSM) sind für die OSM-Rezeptor-Aktivierung erforderlich. J Biol Chem 2018; 18:7017-7029. © der Autoren.

(1) chimäres Protein-Design
<ol><li>Wählen Sie eine geeignete Protein (Spender), Regionen mit dem Protein des Interesses (Empfänger) auszutauschen, die die Spender-Protein strukturell ähnlich, im Idealfall, gehören zur gleichen Proteinfamilie, aber es fehlte die biologische Aktivität als Anzeige verwendet werden sollen. Wenn keine strukturell verwandte Proteine bekannt sind, können potenzielle Kandidaten identifiziert mit Hilfe eines automatisierten Tools wie die Vector Alignment Search Tool (VAST)<sup class="xr...

<ol>
	<li>Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+evolution+of+class-I+helical+cytokines.">Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines.</a> The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).</li><li>Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+and+functions+of+the+human+interleukin+(IL)+gene+family.">Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family.</a> Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).</li><li>Bravo, J., Heath, J. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+SDS:+Minipreparation.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+Sodium+Dodecyl+Sulfate:+Maxipreps.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).</li><li>Hopkins, R. F., Wall, V. 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Die Generation von Chimären Proteinen stellt eine vielseitige Technik, die über die Grenzen der abgeschnittenen Proteine zu Fragen wie die Modularität der Zytokin-Rezeptor bindende Domänen13gehen kann. Das Design der Chimären ist ein wichtiger Schritt in dieser Art von Studien und erfordert eine sorgfältige Prüfung. Vorstudien, Funktionsbereiche zu etablieren erfordert in der Regel Substitution von weite Regionen in einer ersten Phase, während kleinere Erneuerungen von variabler Länge fü...

Verschiedene Arten von Proteinen, einschließlich Zytokine und Wachstumsfaktoren, werden in Familien zusammengefasst, deren Mitglieder teilen ähnliche dreidimensionale Strukturen aber oft üben unterschiedliche biologische Funktionen1,2. Diese Funktionsvielfalt ist in der Regel die Folge der kleine Unterschiede in der Aminosäure-Zusammensetzung innerhalb des Moleküls aktive Zentren3. Identifikation von solchen Websites und funktionelle Determinanten bieten nicht nur evolutionäre Erkenntnisse sondern auch spezifischere Agonisten und Inhibitoren4zu entwerfen. Allerdings erschwert die große Zahl der Unterschiede in der Zusammensetzung der Rückstände häufig zwischen strukturell verwandten Proteinen gefunden diese Aufgabe. Obwohl große Bibliotheken mit Bau Hunderte von Mutanten ist heute machbar, Beurteilung jedes einzelnen Rückstände Variation und Kombinationen davon bleibt noch ein schwieriger und zeitaufwendiger Aufwand5.
Techniken, die Beurteilung der funktionalen Bedeutungdes des großen Protein Regionen sind somit von Wert, die Anzahl der möglichen Rückstände auf eine überschaubare Zahl6zu reduzieren. Abgeschnittene Proteine wurden die am häufigsten verwendete Ansatz, dieses Problem anzugehen. Dementsprechend gelten Regionen werden funktionell relevant, wenn die Funktion des Proteins unter Studie durch das Löschen einer bestimmten Region7,8,9betroffen ist. Eine große Einschränkung dieser Methode ist jedoch, dass Löschungen Sekundärstruktur des Proteins, führende Fehlfaltung, Aggregation und die Unfähigkeit die vorgesehene Region studieren auswirken können. Ein gutes Beispiel ist eine verkürzte Version von Zytokin Oncostatin M (OSM), in denen eine interne Löschung größer als 7 Rückstände fehlgefaltete Mutant geführt, die nicht weiter sein könnte10untersucht.
Die Generation von Chimären Proteinen bildet einen alternativen und innovativeren Ansatz, der die Analyse der größeren Protein Regionen ermöglicht. Das Ziel dieser Methode ist es, die Regionen von Interesse in einem Protein von strukturell verwandten Sequenzen in ein anderes Protein, zu tauschen, um den Beitrag der ersetzten Abschnitte bestimmten biologischen Funktionen zu bewerten. Weit verbreitet im Bereich der Signalisierung Rezeptoren zu identifizieren, Funktionsbereiche11,12, sind Chimäre Proteinen besonders nützlich, Proteinfamilien mit wenig Aminosäure Identität aber konservierte Sekundärstruktur zu studieren. Entsprechende Beispiele finden Sie in der Klasse von Interleukin-6 (IL-6) Typ Zytokine, wie Interleukin-6 und ciliary Neurotrophic Faktor (6 % Sequenz Identität)13 oder Leukämie hemmenden Faktor (LIF) und OSM (20 % Identität)6, auf denen die nach Protokoll basiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:599px;" width="599">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Labcycler thermocycler</td>
			<td style="width:97px;">Sensoquest</td>
			<td style="width:119px;">011-103</td>
			<td style="width:167px;">Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000C&#160;</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler 100 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AscI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PacI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Hot Start II DNA Polymerase</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP set (100 mM)</td>
			<td style="width:97px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:97px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:97px;">Macherey-Nagel</td>
			<td align="right" style="width:119px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MHS6278-202857165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LE agarose</td>
			<td style="width:97px;">Biozym</td>
			<td align="right" style="width:119px;">840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:97px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Human Oncostatin M cDNA</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital W&#252;rzburg, Germany)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Andr&#233; Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)</td>
		</tr>
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identification of functional protein regions through chimeric protein construction

Das Ziel dieses Protokolls umfasst das Design von Chimären Proteinen in die unterschiedliche Regionen eines Proteins durch ihre entsprechenden Sequenzen in einem strukturell ähnlichen Protein ersetzt werden, um die funktionelle Bedeutung dieser Regionen zu ermitteln. Diese Chimären entstehen mittels einer verschachtelten PCR-Protokoll mit überlappenden DNA-Fragmente und angemessen entworfen, Grundierungen, gefolgt von ihren Ausdruck in einem Säugetier-System nativen Sekundärstruktur und post-translationalen Modifikationen zu gewährleisten.
Die funktionale Rolle der eigenständige Region wird dann durch einen Verlust der Aktivität der Schimäre in einer entsprechenden Anzeige-Assay. In der Folge werden Regionen beherbergen eine Reihe von wichtigen Aminosäuren identifiziert, die weiter durch ergänzende Techniken (z.B. Site-verwiesene Mutagenese) zur Erhöhung der molekularen Auflösung gezeigt werden. Obwohl auf Fälle begrenzt, in denen strukturell verwandte Proteine mit unterschiedlichen Funktionen gefunden werden kann, haben Chimäre Proteinen erfolgreich eingesetzt worden, um kritische verbindliche Regionen in Proteine wie Zytokine und Zytokin-Rezeptoren zu identifizieren. Diese Methode eignet sich besonders in Fällen, in denen das Protein funktionale Regionen nicht gut definiert sind, und ist einen wertvollen erste Schritt gerichtete Evolution Ansätze zur Eingrenzung der Regionen von Interesse und reduzieren den Aufwand für Screening.

Konstruktion und Erstellung von ein chimäres Protein (Abbildung 1) werden mit zwei Mitgliedern der Familie Zytokin Interleukin-6, OSM und LIF, die Gegenstand einer kürzlich veröffentlichten Studie6waren veranschaulicht werden. Abbildung 2 zeigt die dreidimensionale Struktur dieser Proteine. Beide Moleküle übernehmen die charakteristische Sekundärstruktur der Klasse ich Zytokine, mit vier Helices (gen...

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Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Strukturell verwandte Proteine üben häufig unterschiedliche biologische Funktionen. Der Austausch von äquivalenten Regionen dieser Proteine um Chimären Proteinen zu schaffen stellt einen innovativen Ansatz zur kritischen Protein Regionen zu identifizieren, die für ihre funktionale Divergenz verantwortlich sind.

Festlegung der funktionellen Protein Regionen durch chimäres Protein Aufbau

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Der Austausch von Regionen strukturell ähnlicher Proteine zur Herstellung von Kimeras ermöglicht es uns, die Bedeutung von Regionen zu untersuchen, die für die biologischen Funktionen des zu untersuchenden Moleküls verantwortlich sind. Der Austausch von Regionen predoff die allgemeine sekundäre Struktur des Proteins, so dass die Region wichtig für seine Gesamtstruktur kann von denen direkt vermittelnde biologische Funktionen unterschieden werden. Es kann in die Auswahl der genauen Bereiche umgewandelt werden, die ersetzt werden sollen.Das Starten mit größeren Austausch ist in der Regel hilfreich, um die wichtigsten Funktionen des Proteins zu identifizieren. Um das Verfahren zu beginnen, wählen Sie ein geeignetes Protein als Spender aus, um Regionen mit dem Protein von Interesse auszutauschen, wie im Textprotokoll beschrieben. Dann erhalten Sie die Protein-Aminosäuresequenzen der Empfänger- und Spenderproteine aus der Referenzsequenzdatenbank, indem Sie zuerst auf den Genabschnitt auf der Ref-Seq-Webseite zugreifen.Geben Sie den Namen des von Interesse interessierten Proteins in das Suchfeld ein, und klicken Sie auf Suchen. Klicken Sie in der resultierenden Liste auf den Gennamen der gewünschten Art. Scrollen Sie nach unten zum Abschnitt ref seq, um alle dokumentierten Isoformen anzuzeigen.Klicken Sie auf die Sequenzkennung für die Isoform von Interesse. Scrollen Sie nach unten und klicken Sie auf CDs, um den Protein-Codierungsbereich des Gens hervorzuheben. Klicken Sie unten rechts auf dem Bildschirm auf FAFSDA und kopieren Sie die Gensequenz.Speichern Sie die DNA-Sequenz mit einer geeigneten DNA-Bearbeitungssoftware. Wenn Sie die frei verfügbare APE verwenden, öffnen Sie das Programm, fügen Sie die kopierte Sequenz in das leere Feld ein, wählen Sie den Sequenznamen aus, und klicken Sie auf Speichern. Wählen Sie nun die Proteinregionen aus, die in den verschiedenen Kimeric-Konstrukten ersetzt werden sollen, indem Sie zunächst die Proteinsequenz des Interesses in verschiedene Strukturregionen dividieren.Laden Sie dazu die Strukturdaten des von Interesse interessierten Proteins von der PDBe-Website herunter. Greifen Sie auf die PDBe-Seite für das Protein zu und laden Sie die PDBe-Datei herunter, indem Sie auf Download auf der rechten Seite des Bildschirms klicken. Öffnen Sie die PDBe-Datei in einem molekularen Visualisierungssystem wie Pymol.Zeigen Sie in Pymol die Nukleotidsequenz an, blenden Sie die Standardstrukturdaten aus und wählen Sie die Zeichentrickansicht aus, um die strukturellen Merkmale des Proteins klar zu visualisieren. Klicken Sie auf die Nukleotidsequenz oben auf dem Bildschirm, um verschiedene Teile des Moleküls hervorzuheben, wobei Sie die Aminosäuren notieren, die jedem charakteristischen strukturellen Merkmal entsprechen. Kommentieren Sie nun die unterschiedlichen Strukturbereiche auf der DNA-Sequenz in APE, indem Sie die DNA-Sequenz öffnen, auswählen und auf ORFs übersetzen klicken, klicken Sie dann auf die letzte Aminosäure der ersten Region, um ihre Position in der DNA-Sequenz hervorzuheben und die Codierung des Nukleotids für diesen Bereich auszuwählen.Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Auswahl und wählen Sie eine neue Funktion aus, um ihr einen Namen und eine Farbe zu geben. Wiederholen Sie den Vorgang für jeden Strukturbereich, der im vorherigen Schritt identifiziert wurde. Um die Rückstandssequenzen der beiden Proteine auszurichten, erhalten Sie zunächst die vollständigen Aminosäuresequenzen von Spender- und Rezeptorproteinen in APE.Öffnen Sie wie bisher die Spender-DNA-Sequenz, wählen Sie sie aus, und klicken Sie auf ORFs übersetzen. Dann greifen Sie auf die Clustal Omega Webseite und setzen Sie dann die Aminosäuresequenzen der beiden Proteine. Jede Sequenz sollte durch eine Textzeile mit Proteinnamen durchgeführt werden, um richtig identifiziert zu werden.Scrollen Sie nach unten und klicken Sie auf Absenden. Rufen Sie die Ausrichtungsdatei ab, indem Sie auf die Registerkarte Ausrichtungsdatei herunterladen klicken, und speichern Sie sie. Diese Datei kann von jedem Textbearbeitungsprogramm geöffnet werden.Kommentieren Sie anhand der Ausrichtungsdatei die entsprechenden Strukturbereiche des Spenderproteins in ihrer DNA-Sequenz. Erstellen Sie eine Kopie der annotierten DNA-Sequenz des Rezeptorproteins und benennen Sie es in kimeric Protein um. Öffnen Sie die umbenannte DNA-Sequenz in APE.Wählen Sie die Region aus, die im Spenderprotein ausgetauscht werden soll, und wählen Sie dann die entsprechende Region im umbenannten Rezeptorprotein aus. Fügen Sie die Protein-DNA-Sequenz des Spenderproteins ein, und speichern Sie dann die Änderungen. Entwerfen Sie die Terminalprimer mit einem DNA-Editor wie APE.Erstellen Sie eine neue DNA-Datei, initiieren Sie den Endklemmenprimer mit einer Leader-Sequenz. Gefolgt von der ersten Restriktionsstelle, die in den Vektoren MCS und dem optionalen Abstandser in den anfänglichen 18 bis 27 Basenpaaren des betreffenden Gens ausgewählt wurde. Entwerfen Sie in der neuen DNA-Datei die C-Terminal-Primersequenz, um mit den letzten 18 bis 27 Basenpaaren des Gens von Interesse zu beginnen, gefolgt von einem optionalen Abstandsraum, der gewählten zweiten Einschränkungsstelle und der Leader-Sequenz.Markieren Sie die gesamte Sequenz, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie reverse compliment aus, um die umgekehrte Grundierung zu erhalten. Entwerfen Sie nun Primer für jede der Grenzregionen in den Kimeric-Konstrukten. Markieren Sie in der DNA-Sequenz der Kimera einen 30-Basispaar-Bereich in der Zone, in der die ursprünglichen und eingefügten Sequenzen in Kontakt sind.Diese besteht aus 15 Basispaaren in jeder Sequenz. Kopieren Sie den Bereich, und fügen Sie ihn in eine neue DNA-Datei ein. Diese Sequenz wird die Vorwärts-Primer sein.Erstellen Sie eine Kopie des im vorherigen Schritt generierten Vorwärtsprimers, und benennen Sie ihn in umgekehrte Grundierung um. Markieren Sie die Primersequenz, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie reverse compliment aus, um die umgekehrte Primersequenz zu generieren. Wiederholen Sie diese Schritte für jede Kontaktzone in der kimerischen DNA-Sequenz.Im Allgemeinen sind zwei Sätze von Vorwärts-Reverse-Primern erforderlich, um eine Kimera zu generieren, es sei denn, der Austausch erfolgt an den N-Terminal- oder C-Terminalbereichen. Bereiten Sie für jedes der Fragmente, die das kimericProtein setzen, ein individuelles PCR-Reaktionsgemisch vor. Legen Sie zunächst ein ein Punkt fünf Milliliter Mikrofuse Rohr auf Eis und Pipetten die verschiedenen Reagenzien der PCR-Mischungen in der Reihenfolge im Textprotokoll aufgeführt.Stellen Sie sicher, dass für jede PCR-Reaktion korrekte Primer und Vorlagen verwendet werden. Beschriften Sie zwei dünnwandige Nullpunkt-ZWEI-Milliliter-PCR-Röhren für jede Reaktion und übertragen Sie 20 Mikroliter des entsprechenden PCR-Gemischs in jedes Rohr. Übertragen Sie die PCR-Röhren in einen PCR-Thermocycler und initiieren Sie das Protokoll, wie im Textprotokoll beschrieben.Nachdem die PCR-Reaktion abgeschlossen ist, fügen Sie vier Mikroliter von sechs x DNA-Ladepuffer in jeder Röhre hinzu. Legen Sie das einprozentige Agaross-Gel in eine Elektrophoreseeinheit ein und decken Sie es mit TAE-Puffer ab. Laden Sie die Proben vorsichtig zusammen mit einem Molekulargewicht in das Gel.Nach dem Laufen des Gels bei 80 bis 120 Volt für 20 bis 45 Minuten, schalten Sie die Elektrophoreseeinheit aus und entfernen Sie das Agoross-Gel. Visualisieren Sie die verstärkten DNA-Bänder unter UV-Licht. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge die einzelnen DNA-Fragmente aus dem Gel aus und übertragen Sie sie in beschriftete zwei Milliliter-Mikrofuse-Röhren.Nach der Verwendung eines PCR-Reinigungskits zur Reinigung der DNA-Fragmente, quantifizieren Sie die Menge der zurückgewonnenen DNA, indem Sie die Absorption der Proben mit 260 Nanometern und 340 Nanometern in einem Spektrofetometer messen. Führen Sie nun die PCR-Verstärkung durch, um die kimerische DNA-Sequenz zu generieren. Richten Sie zunächst 50 Mikroliter einer PCR-Reaktion ein, um die einzelnen Bestandteile der Kimera wie zuvor zu verschmelzen.Verwenden Sie die Klemmengrundierungen N und C zusammen mit 10 Nanogramm jedes der verstärkten DNA-Fragmente. Erholen und quantifizieren Sie das gereinigte DNA-Fragment wie bisher in 30 Mikroliter nukzellfreiem Wasser. Dieses Fragment enthält die kimerische DNA-Sequenz, die von den in den Terminalprimern enthaltenen Restriktionsstellen flankiert wird.Die Erzeugung eines kimerischen Proteins wird mit zwei Mitgliedern der Interluke- und sechs Sytokin-Familie veranschaulicht. Oncostaten M bei Leukämie-Hemmfaktor. Die OSM Lift Kimera resultiert aus dem Austausch der BC-Schleife region OSM mit einer entsprechenden Hubsequenz.Der erste PCR-Verstärkungsschritt bestand aus drei getrennten Reaktionen. Das N-Terminal OSM-Fragment, das N-Terminal OSM vorwärts und BC Start Reverse Primer erforderte, verwendete OSM als Vorlage. Die LIF BC-Schleife wurde durch BC-Start-Forward und BC N-Reverse-Primer unter Verwendung von LIF als Vorlage erhalten.Das C-Terminal OSM-Fragment verwendete BC End Forward und C-Terminal OSM Reverse Primer sowie OSM als Vorlage. Diese gereinigten Fragmente wurden dann als Vorlage in der zweiten PCR-Reaktion zusammen mit N-Terminal OSM vorwärts und C-Terminal OSM Reverse Primer verwendet, um die entsprechende OSM LIF BC-Loop-Gensequenz zu verstärken. Nach der Reinigung und Umwandlung in E-coli wurden einzelne Plasmide isoliert und durch Einschränkungsenzymverdauung zur korrekten Insertion des DNA-Fragments abgeschirmt.Die Gelelektrophorese zeigte positive Treffer, die dann zur Sequenzüberprüfung gesendet wurden. Kimeric Proteine müssen produziert und die Aktivität in einem perfekten Fraktionalitätssystem gemessen werden. Um die Bedeutung der ersetzten Regionen für diese bestimmte Fraktion zu bestimmen.Diese Technik war sehr nützlich und häufig angewendet, interferiert von Signalrezeptoren, um wichtige Funktionsbereiche und Rezeptoren-Erkennungsstellen zu identifizieren. Die Nummer, die ich für die DNA-Elektrophorese verwende, sollte mit Einweghandschuhen, einem Labormantel und Schutzbrillen behandelt werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Forschung

Biochemie

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylierte Zelle eindringen Peptide, intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu studieren

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hohe Empfindlichkeit Messung der Transkription Faktor-DNA verbindlichen Affinitäten durch wettbewerbsfähige Titration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anwendung der Biolayer-Interferometrie (BLI) zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Erstellen hochspezifischer chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme durch schrittweise Phage-Auswahl einer kombinatorischen Single-Domain-Antikörperbibliothek