Name: identification of functional protein regions through chimeric protein construction
Uploaded: 2019-01-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי חברת מקס פלנק ו- Schüchtermann-המרפאה (רע Rothenfelde, גרמניה). חלק מחקר זה פורסם לראשונה בכתב העת לכימיה ביולוגית. אדריאן-Segarra, מ' ג', שינדלר, ש, Gajawada, עמ', Lörchner, ה', בראון, טי & Pöling, ג'יי לולאה AB ו- D-סליל באתר איגוד השלישי של מ' Oncostatin האנושית (OSM) נדרשים עבור הפעלת קולטן OSM. ג'יי Biol.. כימיה 2018; 18:7017-7029. © המחברים.

1. עיצוב חלבון chimeric
<ol><li>בחר חלבון מתאים (תורם) להחלפת אזורים עם החלבון עניין (הנמען) החלבון התורם צריך להיות דומים מבחינה מבנית, אידיאלי השייכים המשפחה חלבון, אבל חסר את פעילות ביולוגית כדי לשמש readout. אם אין חלבונים הקשורים מבחינה מבנית ידועים, מועמדים פוטנציאליים ניתן לזהות באמצעות כלי או?...

<ol>
	<li>Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+evolution+of+class-I+helical+cytokines.">Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines.</a> The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).</li><li>Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+and+functions+of+the+human+interleukin+(IL)+gene+family.">Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family.</a> Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).</li><li>Bravo, J., Heath, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+recognition+by+gp130+cytokines.">Receptor recognition by gp130 cytokines.</a> The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).</li><li>Schneider, G., Fechner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-based+de+novo.+design+of+drug-like+molecules.">Computer-based de novo. design of drug-like molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).</li><li>Heydenreich, F. M., Milju&#353;, T., Jaussi, R., Benoit, R., Mili&#263;, D., Veprintsev, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mutagenesis+using+a+two-fragment+PCR+approach.">High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).</li><li>Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., L&#246;rchner, H., Braun, T., P&#246;ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AB+loop+and+D-helix+in+binding+site+III+of+human+Oncostatin+M+(OSM)+are+required+for+OSM+receptor+activation.">The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).</li><li>Wang, Y., Pallen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+characterization+of+wild+type,+truncated,+and+mutant+forms+of+the+intracellular+region+of+the+receptor-like+protein+tyrosine+phosphatase+HPTP+beta.">Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).</li><li>Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+full-length+midkine+reveals+novel+residues+important+for+heparin+binding+and+zebrafish+embryogenesis.">Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis.</a> The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).</li><li>Kim, K. -. W., Vallon-Eberhard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+structure/function+and+expression+analysis+of+the+CX3C+chemokine+fractalkine.">In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine.</a> Blood. 118 (22), 156-167 (2011).</li><li>Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+loop+structure+in+oncostatin+M+determines+binding+affinity+toward+oncostatin+M+receptor+and+leukemia+inhibitory+factor+receptor.">A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).</li><li>Aasland, D., Schuster, B., Gr&#246;tzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+leukemia+inhibitory+factor+receptor+functional+domains+by+chimeric+receptors+and+cytokines.">Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines.</a> Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).</li><li>Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+leukemia+inhibitory+factor+receptor+and+oncostatin+M+receptor+to+signal+transduction+in+heterodimeric+complexes+with+glycoprotein+130.">Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130.</a> Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).</li><li>Kallen, K. J., Gr&#246;tzinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+recognition+sites+of+cytokines+are+organized+as+exchangeable+modules.+Transfer+of+the+leukemia+inhibitory+factor+receptor-binding+site+from+ciliary+neurotrophic+factor+to+interleukin-6.">Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).</li><li>Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+similarities+in+structure+comparison.">Surprising similarities in structure comparison.</a> Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).</li><li>Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMDB+and+VAST+:+tracking+structural+similarities+between+macromolecular+complexes.">MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes.</a> Nucleic Acids Research. 42, 297-303 (2014).</li><li>Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Announcing+the+worldwide+Protein+Data+Bank.">Announcing the worldwide Protein Data Bank.</a> Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).</li><li>Biasini, M., Bienert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWISS-MODEL:+modelling+protein+tertiary+and+quaternary+structure+using+evolutionary+information.">SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information.</a> Nucleic Acids Research. 42, 252-258 (2014).</li><li>Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+structure+homology+modeling+using+SWISS-MODEL+workspace.">Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace.</a> Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).</li><li>Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NCBI's+LocusLink+and+RefSeq.">NCBI's LocusLink and RefSeq.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).</li><li>Sievers, F., Wilm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+scalable+generation+of+high-quality+protein+multiple+sequence+alignments+using+Clustal+Omega.">Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.</a> Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+and+RNA.">Quantitation of DNA and RNA.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Transformation+of+Competent+E.+coli+Using+Calcium+Chloride.">Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+SDS:+Minipreparation.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+Sodium+Dodecyl+Sulfate:+Maxipreps.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).</li><li>Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+transient+recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells.">Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).</li><li>Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+shared+cytokine+receptors.">Structural biology of shared cytokine receptors.</a> Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).</li><li>Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+functional+dissection+of+the+cytostatic+cytokine+oncostatin.">Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin.</a> Structure. 8, 863-874 (2000).</li><li>Huyton, T., Zhang, J. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+cytokine:Ig-domain+interaction+revealed+in+the+crystal+structure+of+leukemia+inhibitory+factor+(LIF)+in+complex+with+the+LIF+receptor.">An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).</li><li>Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+conserved+sequence+motifs+in+cytochrome+P450+family+2.+Functional+and+structural+role+of+a+motif+187RFDYKD192+in+CYP2B+enzymes.">Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).</li><li>Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Functional+Motifs+and+Homology+Modeling+to+Predict+Hidden+Moonlighting+Functional+Sites.">Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).</li><li>McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localised+sequence+regions+possessing+high+melting+temperatures+prevent+the+amplification+of+a+DNA+mimic+in+competitive+PCR.">Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR.</a> Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).</li><li>Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fundamental+study+of+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+templates.">A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates.</a> Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).</li><li>Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+recombinational+cloning+using+gateway+and+in-fusion+cloning+schemes.">Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).</li><li>Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USER+friendly+DNA+engineering+and+cloning+method+by+uracil+excision.">USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision.</a> Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro.+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-fusion+assembly:+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li></ol>

הדור של חלבונים chimeric מהווה טכניקה רב-תכליתי, אשר מסוגל ללכת מעבר לגבולות של חלבונים קטום להפנות שאלות כגון המודולריות של ציטוקינים-קולטן איגוד תחומים13. העיצוב של כימרות נמצא צעד מפתח בסוג זה של מחקרים, ודורש שיקול דעת זהיר. מחקרים ראשוניים להקים תחומים פונקציונליים בדרך כלל י...

מספר סוגים של חלבונים, לרבות ציטוקינים גורמי גדילה, מקובצים במשפחות שחבריה חולקים מבנים תלת מימדיים דומה אך לעיתים קרובות להפעיל פונקציות ביולוגיות שונות1,2. המגוון פונקציונלי הוא בדרך כלל התוצאה של הרכב חומצות אמינו בתוך אתרים פעילים של המולקולה3הבדלים קטנים. זיהוי של אתרים כאלה גורמים תפקודית לא רק להציע תובנות אבולוציונית אלא גם עיצוב ספציפי יותר אגוניסטים, מעכבי4. עם זאת, מספר גדול של ההבדלים בהרכב שאריות לעתים קרובות למצוא בין חלבונים הקשורים מבחינה מבנית מסבך משימה זו. אף-על-פי בניית ספריות גדול המכיל מאות מוטציות כיום ריאלי, הערכת כל וריאציה שאריות יחיד ונותרה שילובים שלהם עדיין מאתגר ולגזול מאמץ5.
טכניקות להעריך את חשיבות תפקודית של חלבון גדולה אזורים ובכך הם בעלי ערך כדי לצמצם את מספר שאריות אפשרי לניהול מספר6. חלבונים קטום כבר הגישה הנפוצה ביותר כדי להתמודד עם בעיה זו. בהתאם לכך, אזורים נחשבים באופן פונקציונלי זה רלוונטי אם הפונקציה חלבון שנבחנה מושפע על-ידי המחיקה של אזור מסוים7,8,9. אולם, מגבלה עיקרית של שיטה זו הוא כי מחיקות יכול להשפיע על מבנה שניוני של החלבון, המוביל אל misfolding, צבירת וחוסר יכולת ללמוד את האזור המיועד. דוגמה טובה היא גרסה קטום של ציטוקינים oncostatin M (OSM), שבו למד מחיקה פנימיים גדולים יותר משקעים 7, גרמו מוטציה misfolded שלא היתה אפשרות נוספת10.
הדור של חלבונים chimeric מהווה גישה חלופית וחדשנית המאפשרת הניתוח של אזורים גדולים יותר חלבון. המטרה של שיטה זו היא להחליף מחוזות עניין חלבון מאת רצפים הקשורות מבנית בחלבון אחר, כדי להעריך את התרומה של הסעיפים הוחלף על תפקודים ביולוגיים ספציפיים. בשימוש נרחב בתחום של איתות קולטנים לזהות תחומים פונקציונליים11,12, חלבונים chimeric שימושיים בעיקר ללמוד חלבון משפחות עם מעט חומצת אמינו זהות אבל שנשמרת מבנה שניוני. ניתן למצוא דוגמאות המתאימות בכיתה של interleukin-6 (IL-6) מסוג ציטוקינים, כגון neurotrophic interleukin-6 ו ciliary פקטור (6% רצף זהות)13 או לוקמיה מעכבות פקטור (LIF) ו OSM (20% זהות)6, שבו ע פ הפרוטוקול מבוסס.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:599px;" width="599">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Labcycler thermocycler</td>
			<td style="width:97px;">Sensoquest</td>
			<td style="width:119px;">011-103</td>
			<td style="width:167px;">Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000C&#160;</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler 100 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AscI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PacI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Hot Start II DNA Polymerase</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP set (100 mM)</td>
			<td style="width:97px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:97px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:97px;">Macherey-Nagel</td>
			<td align="right" style="width:119px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MHS6278-202857165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LE agarose</td>
			<td style="width:97px;">Biozym</td>
			<td align="right" style="width:119px;">840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:97px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Human Oncostatin M cDNA</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital W&#252;rzburg, Germany)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Andr&#233; Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of functional protein regions through chimeric protein construction

המטרה של פרוטוקול זה מקיף את העיצוב של חלבונים chimeric שבו אזורים הנבדלים זה מזה של חלבון מוחלפים על-ידי שלהם רצפי המתאימים חלבון מבנית דומה, על מנת לקבוע את החשיבות פונקציונלי של אזורים אלה. כזה כימרות נוצרות באמצעות פרוטוקול ה-PCR מקוננות באמצעות קטעים חופפים DNA ועוצב שלמאחה תחל, ואחריו הביטוי שלהם בתוך מערכת יונקים כדי להבטיח מבנה שניוני יליד ושינויים post-translational.
תפקיד פונקציונלי של אזור ברורים אז מציינים לאובדן של הפעילות של החימרה ב וזמינותו הבדיקה המתאימה. כתוצאה מכך, אזורי מחסה ערכה של חומצות אמינו קריטי מזוהים, אשר יכולים להיות מוקרן נוספת בטכניקות משלימים (למשל מוטגנזה) כדי להגדיל את הרזולוציה מולקולרית. למרות מוגבל למקרים שבהם ניתן למצוא חלבון מבנית קשורים עם פונקציות שונות, חלבונים chimeric יש כבר בהצלחה מועסקים כדי לזהות אזורים איגוד קריטי ב חלבונים כגון קולטנים ציטוקינים ו ציטוקינים. שיטה זו מתאימה במיוחד במקרים שבהם אזורים פונקציונליים של החלבון אינם מוגדרים היטב, ומהווה צעד ראשון חשוב בגישות אבולוציה מכוונת לצמצם את האזורים של ריבית, להפחית את המאמץ ההקרנה מעורב.

עם שני בני משפחת ציטוקין interleukin-6, OSM ו LIF, אשר היו מושא מחקר שפורסם לאחרונה6דוגמה הבנייה, דור של חלבון chimeric (איור 1). איור 2 מציג את מבנה תלת ממדי של חלבונים אלה. שתי מולקולות לאמץ את מבנה שניוני אופייני של מחלקה אני ציטוקינים, עם אר?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction at JoVE.com

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

חלבונים הקשורים מבחינה מבנית להפעיל לעתים קרובות תפקודים ביולוגיים ברורים. ההחלפה של אזורים המקבילה של חלבונים אלה כדי ליצור חלבונים chimeric מהווה גישה חדשנית כדי לזהות אזורים קריטיים חלבון אשר אחראים על הבדלי הפונקציונלית שלהם.

זיהוי של חלבון פונקציונלי אזורים באמצעות חלבון Chimeric בנייה

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

החלפת אזורים של חלבונים דומים מבחינה מבנית כדי ליצור קימראס מאפשרת לנו לחקור את החשיבות של אזורים האחראים על תפקודים ביולוגיים של המולקולה להיחקר. חילופי אזורים קדם למבנה המשני הכללי של החלבון כך שניתן יהיה להבדיל בין המבנה הכללי של האזור לבין התפקודים הביולוגיים התיווכו ישירות. ניתן להפוך אותו לבחירת האזורים המדויקים שיש להחליף.החל מחילופים גדולים יותר הוא בדרך כלל מועיל לזהות את הפונקציונליות העיקרית של החלבון. כדי להתחיל את ההליך, בחר חלבון מתאים כתורם כדי להחליף אזורים עם חלבון העניין כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להשיג את רצפי חומצות האמינו חלבון של הנמען וחלבונים התורם מתוך מסד הנתונים רצף התייחסות על ידי גישה ראשונה סעיף הגן בדף האינטרנט seq ref.הקלד את שם החלבון המעניין בתיבת החיפוש ולחץ על חיפוש. לחץ על שם הגן עבור המין הרצוי ברשימה וכתוצאה מכך. גלול מטה אל מקטע seq של ref כדי לראות את כל צורות ה- isoform המתועדות.לחץ על מזהה הרצף עבור isoform של עניין. גלול מטה ולחץ על תקליטורים כדי להדגיש את אזור קידוד החלבון של הגן. בפינה השמאלית התחתונה של המסך, לחץ על FAFSDA והעתק את רצף הגנים.שמור את רצף הדנ"א באמצעות תוכנת עריכת דנ"א מתאימה. בעת שימוש ב- APE הזמין בחופשיות, פתח את התוכנית, הדבק את הרצף המועתק בתיבה הריקה, בחר את שם הרצף ולחץ על שמור. עכשיו, לבחור את אזורי החלבון להיות מוחלף במבני קימריק שונים על ידי חלוקת תחילה את רצף החלבון של עניין באזורים מבניים שונים.כדי לעשות זאת, להוריד את הנתונים המבניים של החלבון של עניין מאתר האינטרנט של PDBe. גש לדף PDBe עבור החלבון והורד את קובץ ה- PDBe על-ידי לחיצה על הורדה בצד ימין של המסך. פתח את קובץ PDBe במערכת הדמיה מולקולרית, כמו פימול.בפימול, הצג את רצף הנוקלאוטיד, הסתר את הנתונים המבניים המוגדרים כברירת מחדל ובחר את התצוגה המצוירת כדי לדמיין בבירור את התכונות המבניות של החלבון. לחץ על רצף הנוקלאוטיד בחלק העליון של המסך כדי להדגיש חלקים שונים של המולקולה, וציין את חומצות האמינו המתאימות לכל תכונה מבנית ייחודית. עכשיו, להוסיף ביאורים לאזורים מבניים נפרדים על רצף ה- DNA ב- APE על ידי פתיחת רצף ה- DNA, בחירתו, ולחיצה על ORFs לתרגם, ולאחר מכן לחץ על חומצת האמינו האחרונה של האזור הראשון כדי להדגיש את מיקומו ברצף ה- DNA ולבחור את הקידוד של הנוקלאוטיד עבור אזור זה.לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הבחירה ובחר תכונה חדשה כדי לתת לה שם וצבע. חזור על התהליך עבור כל אזור מבני שזוהה בשלב הקודם. כדי ליישר את רצפי השאריות של שני החלבונים, ראשית, להשיג את רצפי חומצות האמינו המלאים של חלבונים תורמים וקולטנים ב- APE.כמו קודם, פתח את רצף הדנ"א של התורם, בחר אותו ולחץ על ORFs לתרגם. לאחר מכן, לגשת לדף האינטרנט של אומגה Clustal ולאחר מכן לשים את רצפי חומצות האמינו של שני חלבונים. כל רצף צריך להמשיך על ידי שורת טקסט עם שם חלבון להיות מזוהה כראוי.גלול מטה ולחץ על שלח. אחזר את קובץ היישור על-ידי לחיצה על כרטיסיית קובץ יישור ההורדה ושמור אותו. כל תוכנית לעריכת טקסט יכולה לפתוח קובץ זה.באמצעות קובץ היישור כהפניה, ביאור האזורים המבניים המתאימים של חלבון התורם ברצף ה- DNA שלהם. צור עותק של רצף הדנ"א המבאר של חלבון הקולטן ושנה את שמו לחלבון קימרי. פתח את רצף הדנ"א ששמו שונה ב- APE.בחר את האזור שיש להחליף בחלבון התורם, ולאחר מכן בחר את האזור המתאים בחלבון הקולטן ששמו שונה. הדבק את רצף הדנ"א של חלבון התורם ולאחר מכן שמור את השינויים. עצב את פריימרים הטרמינל באמצעות עורך DNA כגון APE.צור קובץ DNA חדש, ליזום את פריימר מסוף הקצה עם רצף מנהיג. ואחריו אתר ההגבלה הראשון שנבחר בווקטורים MCS והמרחב האופציונלי ב-18 עד 27 זוגות הבסיס הראשונים של גן העניין. בקובץ הדנ"א החדש, תכנן את רצף פריימר מסוף C כך שיתחיל עם 18 עד 27 זוגות הבסיס הסופיים של גן העניין ואחריו רווח אופציונלי, אתר ההגבלה השני שנבחר ורצף המנהיגים.סמן את הרצף כולו, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר מחמאה הפוכה כדי להשיג את פריימר הפוך. עכשיו, תכנן פריימרים לכל אחד מאזורי הגבול במבנונים הקימורים. ברצף הדנ"א של קימרה, סמן אזור זוג בסיס 30 באזור שבו הרצפים המקוריים והכניסו נמצאים במגע.זה מורכב מ-15 זוגות בסיסים בכל רצף. העתק את האזור והדבק אותו בקובץ דנ"א חדש. רצף זה יהיה פריימר קדימה.הפוך עותק של פריימר קדימה שנוצר בשלב הקודם, ושנה את שמו לתווים ההפוך. סמן את רצף פריימר, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר מחמאה הפוכה כדי ליצור את רצף פריימר הפוך. חזור על שלבים אלה עבור כל אזור מגע ברצף הדנ"א ה קימריק.בדרך כלל, שתי קבוצות של פריימרים הפוכים קדימה נדרשים כדי ליצור קימרה אחת, אלא אם כן ההחלפה מתרחשת באזורי מסוף N או מסוף C. הכינו תערובת תגובת PCR אישית לכל אחד מהשברים שמלחינים את החלבון הקמרתי. ראשית להגדיר נקודה אחת חמש צינור microfuse mililiter על קרח צינור reagents שונים של תערובות PCR בסדר המפורטים בפרוטוקול הטקסט.ודא שהתבניות והתבניות הנכונות מועסקות עבור כל תגובת PCR. תווית שתי נקודות אפס דק מוקף חומה שני צינורות PCR mililiter עבור כל תגובה ולהעביר 20 microliters של תערובת PCR המתאימה בכל צינור. העבר את צינורות PCR לתוך תרמוצ'יקלר PCR וליזום את הפרוטוקול כמפורט בפרוטוקול הטקסט.לאחר השלמת תגובת PCR, להוסיף ארבעה microliters של שישה x מאגר טעינת DNA בכל צינור. הכנס את ג'ל אגרוס אחוז אחד ביחידת אלקטרופורזה ולכסות עם חיץ TAE. בזהירות לטעון את הדגימות לתוך הג'ל יחד עם משקל מולקולרי האחרון.לאחר הפעלת הג'ל ב 80 עד 120 וולט במשך 20 עד 45 דקות, לכבות את יחידת אלקטרופורזה ולהסיר את ג'ל אגורוס. דמיינו את רצועות הדנ"א המוגברות תחת אור UV. בעזרת סכין גילוח, חותכים את שברי הדנ"א הבודדים מהג'ל ומעבירים אותם לשני צינורות מיקרו-פיוז'ן מיליטריים.לאחר שימוש בערכת ניקוי PCR לטיהור שברי הדנ"א, כימת את כמות הדנ"א שנמצאה על ידי מדידת ספיגת הדגימות ב-260 ננומטר ו-340 ננומטר בספקטרופטומטר. עכשיו, לבצע הגברה PCR כדי ליצור את רצף ה-DNA קימרית. ראשית, להגדיר 50 microliters של תגובת PCR כדי להתיך את המרכיבים הנפרדים של קימרה כמו קודם.השתמשו בפרימרים של מסוף N ו-C יחד עם 10 ננוגרם של כל אחד מרסיסי הדנ"א המוגברים. לשחזר ולכומת את שבר ה-DNA מטוהר כמו קודם, ב 30 microliters של מים ללא גרעין. קטע זה מכיל את רצף הדנ"א הקימרי מוקף באתרי ההגבלה הכלולים בפרימרים של הטרמינל.דור של חלבון קימריק בא לידי ביטוי עם שני בני משפחת האינטר לוק ושישה סיטוקין. אונקוסטטין M בגורם מעכב לוקמיה. הרמת OSM קימרה נובעת מהחלפת אזור לולאת BC של OSM עם רצף הרמה מתאים.שלב ההגברה הראשון של PCR כלל שלוש תגובות נפרדות. קטע OSM N-מסוף, אשר נדרש N-מסוף OSM קדימה ו- BC להתחיל פריימרים הפוכים השתמשו OSM כתבנית. לולאת LIF BC הושגה באמצעות BC התחל קדימה ו- BC N פריימרים הפוכים באמצעות LIF כתבנית.קטע OSM של מסוף C השתמש בפריימים אחוריים של קצה BC קדימה ו- C מסוף OSM וכן ב- OSM כתבנית. קטעים מטוהרים אלה שימשו אז כתבנית בתגובת PCR השנייה יחד עם OSM מסוף N קדימה ו- C-מסוף OSM פריימרים הפוכים כדי להגביר את רצף הגנים המתאימים OSM LIF BC לולאה. לאחר טיהור וטרנספורמציה ל- e-coli, פלסמידים בודדים היו מבודדים והוקרנו על ידי הגבלת עיכול אנזימים להכנסה נכונה של שבר ה- DNA.אלקטרופורזה של ג'ל חשפה להיטים חיוביים שנשלחו לאחר מכן לאימות רצף. יש לייצר חלבונים קימריים ואת הפעילות הנמדדת במערכות סיעתיות מושלמות. על מנת לקבוע את החשיבות של האזורים המוחלף עבור אותה סיעה מסוימת.טכניקה זו הייתה שימושית מאוד מיושם לעתים קרובות, הפרעה של קולטנים אות על מנת לזהות תחומים פונקציה מפתח ואתרי זיהוי קולטן. יש לטפל במספר בו אני משתמש לאלקטרופורזה של דנ"א באמצעות כפפות חד פעמיות, מעיל מעבדה ומשעפי מגן.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...