Name: identification of functional protein regions through chimeric protein construction
Uploaded: 2019-01-08T15:00:00
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यह काम मैक्स प्लैंक सोसायटी और Schüchtermann-क्लिनिक (Bad Rothenfelde, जर्मनी) द्वारा समर्थित किया गया था । इस शोध का हिस्सा मूलतः जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित किया गया था । एड्रियन-Segarra, जे. एम., शिंडलर्स, एन., Gajawada, पी., Lörchner, एच., रचाई, टी. & Pöling, जे. अटल बिहारी पाश और डी-मानव Oncostatin एम (OSM) के बंधन साइट III में कुंडल OSM रिसेप्टर सक्रियण के लिए आवश्यक हैं. J. बियोल. २०१८; 18:7017-7029. © द लेखक.

1. Chimeric प्रोटीन डिजाइन
<ol><li>एक उपयुक्त प्रोटीन का चयन करें (दाता) ब्याज के प्रोटीन के साथ विनिमय क्षेत्रों के लिए (प्राप्तकर्ता) दाता प्रोटीन संरचनात्मक रूप से समान होना चाहिए, आदर्श एक ही प्रोटीन परिवार स?...

<ol>
	<li>Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+evolution+of+class-I+helical+cytokines.">Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines.</a> The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).</li><li>Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+and+functions+of+the+human+interleukin+(IL)+gene+family.">Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family.</a> Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).</li><li>Bravo, J., Heath, J. 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Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).</li><li>Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+similarities+in+structure+comparison.">Surprising similarities in structure comparison.</a> Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).</li><li>Madej, T., Lanczycki, C. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+SDS:+Minipreparation.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+Sodium+Dodecyl+Sulfate:+Maxipreps.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).</li><li>Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+transient+recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells.">Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).</li><li>Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+shared+cytokine+receptors.">Structural biology of shared cytokine receptors.</a> Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).</li><li>Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+cytokine:Ig-domain+interaction+revealed+in+the+crystal+structure+of+leukemia+inhibitory+factor+(LIF)+in+complex+with+the+LIF+receptor.">An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).</li><li>Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. 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H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USER+friendly+DNA+engineering+and+cloning+method+by+uracil+excision.">USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision.</a> Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro.+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-fusion+assembly:+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li></ol>

chimeric प्रोटीन की पीढ़ी एक बहुमुखी तकनीक है, जो काट दिया प्रोटीन की सीमा से परे जाने के लिए इस तरह के cytokine रिसेप्टर बाइंडिंग डोमेन13की मॉड्यूलरता के रूप में सवालों के पता करने में सक्षम है का गठन किया...

प्रोटीन के कई प्रकार, साइटोकिंस और विकास कारकों सहित, परिवारों में समूहीकृत कर रहे है जिनके सदस्य समान तीन आयामी संरचनाओं का हिस्सा है लेकिन अक्सर अलग जैविक कार्य1,2डालती । इस कार्यात्मक विविधता आमतौर पर है अणु सक्रिय3साइटों के भीतर एमिनो एसिड संरचना में छोटे मतभेदों का परिणाम है । ऐसी साइटों और कार्यात्मक निर्धारकों की पहचान मूल्यवान विकासवादी अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करते हैं, लेकिन यह भी अधिक विशिष्ट एगोनिस्ट और अवरोधक4डिजाइन करने के लिए । हालांकि, अक्सर संरचनात्मक रूप से संबंधित प्रोटीन के बीच पाया अवशेषों संरचना में अंतर की बड़ी संख्या इस कार्य पेचीदा । हालांकि म्यूटेंट के सैकड़ों युक्त बड़े पुस्तकालयों का निर्माण आजकल संभव है, हर एक अवशेष भिन्नता का आकलन और उनमें से संयोजन अभी भी एक चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाला प्रयास5रहता है.
बड़े प्रोटीन क्षेत्रों के कार्यात्मक महत्व का आकलन तकनीक मूल्य के इस तरह के एक प्रबंधनीय संख्या6के लिए संभव अवशेषों की संख्या को कम कर रहे हैं । कटा हुआ प्रोटीन इस मुद्दे से निपटने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया दृष्टिकोण किया गया है । तदनुसार, क्षेत्रों के लिए कार्यात्मक प्रासंगिक माना जाता है यदि अध्ययन के तहत प्रोटीन समारोह एक विशेष क्षेत्र7,8,9के विलोपन से प्रभावित है । हालांकि, इस विधि की एक प्रमुख सीमा है कि विलोपन प्रोटीन माध्यमिक संरचना को प्रभावित कर सकते हैं, खुलासा करने के लिए अग्रणी, एकत्रीकरण और इरादा क्षेत्र का अध्ययन करने के लिए अक्षमता. एक अच्छा उदाहरण है cytokine oncostatin एम (OSM), जिसमें एक आंतरिक विलोपन से बड़ा 7 अवशेषों एक खुलासा उत्परिवर्ती है कि आगे10का अध्ययन नहीं किया जा सकता के परिणामस्वरूप के एक छोटा संस्करण है ।
chimeric प्रोटीन की पीढ़ी एक वैकल्पिक और अभिनव दृष्टिकोण है कि बड़े प्रोटीन क्षेत्रों के विश्लेषण परमिट का गठन किया । इस विधि का लक्ष्य एक प्रोटीन में एक और प्रोटीन में संरचनात्मक रूप से संबंधित अनुक्रम द्वारा ब्याज के क्षेत्रों का आदान प्रदान करने के लिए है, ताकि विशिष्ट जैविक कार्यों के लिए प्रतिस्थापित वर्गों के योगदान का आकलन करने के लिए । व्यापक रूप से संकेत रिसेप्टर्स कार्यात्मक डोमेन11,12की पहचान करने के क्षेत्र में इस्तेमाल किया, chimeric प्रोटीन विशेष रूप से थोड़ा एमिनो एसिड पहचान के साथ प्रोटीन परिवारों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं, लेकिन माध्यमिक संरचना संरक्षित । उपयुक्त उदाहरण interleukin-6 (IL-6) प्रकार साइटोकिंस के वर्ग में पाया जा सकता है, जैसे interleukin-6 और सिलिअरी neurotrophic फैक्टर (6% अनुक्रम पहचान)13 या ल्यूकेमिया निरोधात्मक फैक्टर (लिफ) और OSM (20% पहचान)6, जिस पर निंन प्रोटोकॉल आधारित है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:599px;" width="599">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Labcycler thermocycler</td>
			<td style="width:97px;">Sensoquest</td>
			<td style="width:119px;">011-103</td>
			<td style="width:167px;">Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000C&#160;</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler 100 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AscI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PacI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Hot Start II DNA Polymerase</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP set (100 mM)</td>
			<td style="width:97px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:97px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:97px;">Macherey-Nagel</td>
			<td align="right" style="width:119px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MHS6278-202857165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LE agarose</td>
			<td style="width:97px;">Biozym</td>
			<td align="right" style="width:119px;">840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:97px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Human Oncostatin M cDNA</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital W&#252;rzburg, Germany)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Andr&#233; Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of functional protein regions through chimeric protein construction

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य chimeric प्रोटीन के डिजाइन जिसमें एक प्रोटीन के विभिंन क्षेत्रों में एक संरचनात्मक रूप से इसी तरह के प्रोटीन में उनके इसी क्रम से बदल रहे हैं, क्रम में इन क्षेत्रों के कार्यात्मक महत्व निर्धारित करने के लिए शामिल हैं । इस तरह के chimeras के माध्यम से उत्पन्न कर रहे हैं एक नेस्टेड पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग कर अतिव्यापी डीएनए अंशों और पर्याप्त रूप से डिजाइन प्राइमरों, एक स्तनधारी प्रणाली के भीतर उनकी अभिव्यक्ति के बाद देशी माध्यमिक संरचना और पोस्ट-शोधों संशोधनों को सुनिश्चित करने के लिए.
एक विशिष्ट क्षेत्र की कार्यात्मक भूमिका तो एक उचित readout परख में कल्पना की गतिविधि के नुकसान से संकेत दिया है । परिणाम में, महत्वपूर्ण अमीनो एसिड का एक सेट बंदरगाह क्षेत्रों की पहचान कर रहे हैं, जो आगे पूरक तकनीक द्वारा जांच की जा सकती है (जैसे साइट-निर्देशित mutagenesis) आणविक संकल्प को बढ़ाने के लिए । हालांकि मामलों में जो भिंन कार्यों के साथ एक संरचनात्मक रूप से संबंधित प्रोटीन पाया जा सकता है तक सीमित है, chimeric प्रोटीन सफलतापूर्वक ऐसे साइटोकिंस और cytokine रिसेप्टर्स के रूप में प्रोटीन में महत्वपूर्ण बाध्यकारी क्षेत्रों की पहचान के लिए कार्यरत किया गया है । इस विधि के मामलों में विशेष रूप से उपयुक्त है जिसमें है प्रोटीन कार्यात्मक क्षेत्रों को अच्छी तरह से परिभाषित नहीं कर रहे हैं, और निर्देशित विकास के दृष्टिकोण में एक मूल्यवान पहले कदम के लिए नीचे ब्याज के क्षेत्रों संकीर्ण और स्क्रीनिंग शामिल प्रयास को कम करने का गठन ।

निर्माण और एक chimeric प्रोटीन की पीढ़ी (चित्रा 1) interleukin-6 cytokine परिवार, OSM और लिफ, जो एक हाल ही में प्रकाशित अध्ययन का विषय थे के दो सदस्यों के साथ उदाहरण किया जाएगा6. चित्रा 2</str...

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Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

संरचनात्मक रूप से संबंधित प्रोटीन अक्सर अलग जैविक कार्यों डालती है । chimeric प्रोटीन बनाने के लिए इन प्रोटीन के समकक्ष क्षेत्रों के आदान-प्रदान के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन क्षेत्रों है कि उनके कार्यात्मक विचलन के लिए जिंमेदार है की पहचान करने के लिए एक अभिनव दृष्टिकोण का गठन किया ।

Chimeric प्रोटीन निर्माण के माध्यम से कार्यात्मक प्रोटीन क्षेत्रों की पहचान

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों की सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित पहचान के लिए नमूना तैयारी

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated सेल-मर्मज्ञ पेप्टाइड्स Intracellular प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 में 1: प्रोटीन और प्रोटीन-Metabolite परिसरों के समानांतर विश्लेषण के लिए एक कदम संबध शुद्धि

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए प्रोटीन की आबंध स्थिरीकरण

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

सेल-सेल संपर्कों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की एक प्रतिदीप्ति अस्थिरता स्पेक्ट्रोस्कोपी परख

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

प्रतिलेखन फैक्टर के उच्च संवेदनशीलता माप-प्रतिस्पर्धी अनुमापन द्वारा डीएनए बाध्यकारी समानताएं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

प्रोटीन तह, परिवहन, और रेडियोधर्मी पल्स चेस द्वारा जीवित कोशिकाओं में क्षरण का विश्लेषण

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

ट्रांसक्रिप्शन में प्रोटीन-प्रोटिन इंटरेक्शन के अध्ययन के लिए बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (बीआईएलआई) का अनुप्रयोग

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

एक पर झिल्ली पाचन तकनीक का उपयोग कर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरेक्शन का मूल्यांकन

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...