Name: identification of functional protein regions through chimeric protein construction
Uploaded: 2019-01-08T15:00:00
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이 작품은 맥스 플랑크 사회와 Schüchtermann-클리닉 (바트, 독일)에 의해 지원 되었다. 이 연구의 일부 생물 화학의 저널에 출판 되었다. 아드리안 Segarra, J. M., 쉰들러, 북 아 일, Gajawada, P., Lörchner, H., 브라운, 토니 & Pöling, 제이 AB 루프 및 D-나선형 바인딩 사이트 III 인간 Oncostatin M (OSM)의에서는 OSM 수용 체 활성화 필요 합니다. J. Biol. 화학 2018; 18:7017-7029. © 저자.

1. 공상 단백질 디자인
<ol><li>적당 한 단백질 (기증자) 교환 기증자 단백질 구조적으로 유사 하 고, 이상적으로 동일한 단백질 가족에 속하는 하지만 판독으로 사용 될 생물 학적 활동 부족 해야 관심 (받는 사람)의 단백질 영역을 선택 합니다. 없는 구조적으로 관련된 단백질, 알려 지는 경우 잠재적인 후보자 확인 될 수 있다 벡터 맞춤 검색 도구 (광대 한)14,<sup class="xref"...

<ol>
	<li>Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+evolution+of+class-I+helical+cytokines.">Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines.</a> The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).</li><li>Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+and+functions+of+the+human+interleukin+(IL)+gene+family.">Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family.</a> Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).</li><li>Bravo, J., Heath, J. 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Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).</li><li>Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+similarities+in+structure+comparison.">Surprising similarities in structure comparison.</a> Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).</li><li>Madej, T., Lanczycki, C. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+SDS:+Minipreparation.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+Sodium+Dodecyl+Sulfate:+Maxipreps.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).</li><li>Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+transient+recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells.">Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).</li><li>Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+shared+cytokine+receptors.">Structural biology of shared cytokine receptors.</a> Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).</li><li>Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+cytokine:Ig-domain+interaction+revealed+in+the+crystal+structure+of+leukemia+inhibitory+factor+(LIF)+in+complex+with+the+LIF+receptor.">An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).</li><li>Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. 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H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USER+friendly+DNA+engineering+and+cloning+method+by+uracil+excision.">USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision.</a> Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro.+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-fusion+assembly:+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li></ol>

공상 단백질의 생성 cytokine 수용 체 바인딩 도메인13의 모듈화 등 주소 질문에 잘린된 단백질의 한계를 넘어 이동 할 수 있는 다양 한 기술을 구성 합니다. 키메라의 디자인 연구의이 종류에 있는 중요 한 단계 이며, 신중한 검토를 요구 한다. 일반적으로 예비 연구 기능 도메인을 설정 하는 가변 길이의 작은 교체는 단일 영역의 상세한 연구에 더 적합 하는 동안 첫 번째 단계에서 ...

여러 종류의 단백질, cytokines 그리고 성장 인자를 포함 하 여 가족 구성원 유사한 3 차원 구조를 공유 하지만 고유한 생물학적 기능1,2를 자주 발휘에 그룹화 됩니다. 이 기능의 다양성 일반적으로 아미노산 구성 분자의 활성 사이트3내에 있는 작은 다름의 결과 이다. 이러한 사이트와 기능적인 결정 요인의 식별 제공 하지 않습니다만 중요 한 진화 통찰력 뿐만 아니라 좀 더 구체적인 촉진제와 억제제4디자인. 그러나, 구조상으로 관련된 단백질 사이 자주 발견 잔류물 구성에 있는 다름의 많은이 작업을 복잡. 포함 된 대규모 라이브러리를 구축 돌연변이의 수백은 현재 가능 하 고, 모든 단일 잔류물 변화를 평가 하 고 그들의 조합을 도전적이 고 시간이 걸리는 노력5에 아직도 남아 있다.
큰 단백질 영역의 기능적 중요성 평가 기법 관리 번호6에 가능한 잔류물의 수를 줄이기 위해 값의 따라서 이다. 잘린된 단백질이이 문제를 해결 하기 위해 가장 많이 사용 된 접근 되었습니다. 따라서 지역 연구에서 단백질 기능 특정 지역7,,89의 삭제에 의해 영향을 받는 경우 기능적으로 관련 된 것으로 간주 됩니다. 그러나,이 방법의 주요 한계는 삭제 misfolding, 집계 및 대상된 지역 연구를 선도 하는 단백질의 이차 구조, 영향을 미칠 수 있습니다. 좋은 예는 cytokine oncostatin M (OSM), 있는 내부 삭제 7 잔류물 귀착되 었 다 더 수 없습니다 misfolded 돌연변이 보다 더 큰 공부10의 잘린된 버전입니다.
공상 단백질의 생성 더 큰 단백질 영역의 분석을 허용 하는 대체 하 고 혁신적인 접근 방식을 구성 합니다. 이 방법의 목표는 특정 생물 학적 기능을 대체 섹션의 기여를 평가 다른 단백질에서 구조적으로 관련된 시퀀스에 의해 단백질에 관심 영역을 교환. 식별 기능 도메인11,12수용 체 신호의 분야에서 널리 이용 된다, 공상 단백질은 특히 유용 단백질 가족 작은 아미노산 정체성만 보존된 이차 구조를 공부. 인터 루 킨-6 및 속눈썹 neurotrophic 요인 (6% 순서 신원)13 또는 백혈병 금지 요인 (LIF) 및 OSM (20% 신원)6에 같은 인터 루 킨-6 (일리노이-6) 유형 cytokines의 클래스에 적절 한 예를 찾을 수 있습니다는 다음 프로토콜은 근거한 다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:599px;" width="599">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Labcycler thermocycler</td>
			<td style="width:97px;">Sensoquest</td>
			<td style="width:119px;">011-103</td>
			<td style="width:167px;">Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000C&#160;</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler 100 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AscI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PacI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Hot Start II DNA Polymerase</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP set (100 mM)</td>
			<td style="width:97px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:97px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:97px;">Macherey-Nagel</td>
			<td align="right" style="width:119px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MHS6278-202857165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LE agarose</td>
			<td style="width:97px;">Biozym</td>
			<td align="right" style="width:119px;">840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:97px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Human Oncostatin M cDNA</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital W&#252;rzburg, Germany)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Andr&#233; Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of functional protein regions through chimeric protein construction

이 프로토콜의 목표는 단백질의 고유 영역이이 지역의 기능적 중요성을 결정 하기 위하여 구조적으로 유사한 단백질에서의 해당 시퀀스에 의해 대체 됩니다 공상 단백질의 디자인을 포함. 그런 키메라 겹치는 DNA 파편을 사용 하 여 중첩 된 PCR 프로토콜에 의하여 생성 하 고 적절 하 게 설계 된 뇌관, 뒤에 기본 보조 구조와 포스트 번역 상 수정 되도록 포유류 시스템 내에서 그들의 식.
고유 영역의 기능 역할 다음 적절 한 판독 분석 결과에 키메라의 활동의 손실에 의해 표시 됩니다. 결과 중요 한 아미노산의 집합을 품고 지역 식별 됩니다는 분자 해상도 높이기 위해 보완 기술 (예: 사이트 감독 mutagenesis)에 의해 추가 상영 될 수 있습니다. 제한 경우에는 서로 다른 기능을 가진 구조적으로 관련된 단백질을 찾을 수 있습니다, 비록 공상 단백질 cytokines, 사이토카인 수용 체 등 단백질에 중요 한 바인딩 영역을 식별 하 성공적으로 고용 되어 있다. 이 메서드는 단백질의 기능 지역 잘 정의 되지 않은 경우에 특히 적합 하며 감독된 진화 접근 관심 영역을 좁혀 하 고 관련된 심사 노력을 줄이기 위해 중요 한 첫 번째 단계를 구성.

건설 및 공상 단백질 (그림 1) 최근에 출판 된 연구6의 주제 이었다 OSM 및 LIF, 인터 루 킨-6 cytokine 가족의 두 멤버와 궁 행 것입니다. 그림 2 는이 단백질의 3 차원 구조를 보여 줍니다. 두 분자 나 cytokines, 4 개의 나선 (나 d A)와 번들에서 포장 하 고 루프28합류 클래스의 특성 이차 구조를 채택 한?...

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Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

구조적으로 관련된 단백질 자주 가지 생물 학적 기능을 발휘 한다. 공상 단백질을 만들기 위해이 단백질의 동등한 지역 교환 그들의 기능 차이 대 한 책임은 중요 한 단백질 영역을 식별 하는 혁신적인 접근 방식을 구성 합니다.

공상 단백질 구축을 통한 기능성 단백질 영역 식별

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

키머라를 만들기 위해 구조적으로 유사한 단백질의 영역을 교환하면 분자의 생물학적 기능에 대한 책임이있는 영역의 중요성을 연구 할 수 있습니다. 지역 교류는 단백질의 일반적인 이차 구조를 프레도오프하여 전체적인 구조에 대한 지역중요성으로 생물학적 기능을 직접 중재하는 것과 구별될 수 있습니다. 교체할 정확한 영역을 선택으로 전환할 수 있습니다.더 큰 교류로 시작하는 것은 일반적으로 단백질의 주요 기능을 확인하는 데 도움이됩니다. 절차를 시작하려면, 텍스트 프로토콜에 상세한 바와 같이 관심의 단백질과 영역을 교환하는 기증자로서 적합한 단백질을 선택합니다. 이어서, 참조 서열 데이터베이스로부터 수신자 및 기증자 단백질의 단백질 아미노산 서열을 먼저 참조 세크 웹페이지에서 유전자 섹션에 접근시킴으로써 얻을 수 있다.검색 상자에 관심 있는 단백질의 이름을 입력하고 검색을 클릭합니다. 결과 목록에서 원하는 종에 대한 유전자 이름을 클릭합니다. 참조 seq 섹션으로 스크롤하여 문서화된 모든 등소 양식을 확인합니다.관심 있는 등소형식에 대한 시퀀스 식별자를 클릭합니다. 아래로 스크롤하여 CD를 클릭하여 유전자의 단백질 코딩 영역을 강조합니다. 화면 오른쪽 하단에서 FAFSDA를 클릭하고 유전자 서열을 복사합니다.적합한 DNA 편집 소프트웨어를 사용하여 DNA 서열을 저장합니다. 자유롭게 사용할 수 있는 APE를 사용하는 경우 프로그램을 열고 복사된 시퀀스를 빈 상자에 붙여 넣은 다음 시퀀스 이름을 선택하고 저장을 클릭합니다. 지금, 다른 기메라 구조에서 대체되는 단백질 영역을 선택하여 먼저 뚜렷한 구조 영역에서 관심의 단백질 서열을 분할한다.이렇게 하려면 PDBe 웹 사이트에서 관심 있는 단백질의 구조 데이터를 다운로드하십시오. PDBe 페이지에 액세스하여 단백질에 액세스하고 화면 의 오른쪽에서 다운로드를 클릭하여 PDBe 파일을 다운로드합니다. Pymol과 같은 분자 시각화 시스템에서 PDBe 파일을 엽니다.Pymol에서, 뉴클레오티드 서열을 표시하고, 기본 구조 데이터를 숨기고, 단백질의 구조적 특징을 명확하게 시각화하기 위해 만화 뷰를 선택한다. 각 독특한 구조 적 특징에 대응하는 아미노산을 지적, 분자의 다른 부분을 강조하기 위해 화면의 상단에 뉴클레오티드 서열을 클릭합니다. 지금, APE에서 DNA 서열에 뚜렷한 구조 영역을 인음하여 DNA 서열을 열고, 그것을 선택하고, ORF를 클릭한 다음, DNA 서열에서의 위치를 강조하기 위해 첫 번째 영역의 마지막 아미노산을 클릭하고 그 지역에 대한 뉴클레오티드의 코딩을 선택한다.선택을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 이름과 색상을 제공하기 위해 새 기능을 선택합니다. 이전 단계에서 식별된 각 구조 영역에 대한 프로세스를 반복합니다. 두 단백질의 잔류체 서열을 맞추기 위해 먼저 APE에서 기증자 및 수용체 단백질의 전체 아미노산 서열을 얻습니다.이전과 마찬가지로 기증자 DNA 서열을 열고 선택하여 ORF를 클릭하여 변환합니다. 그런 다음, Clustal 오메가 웹 페이지에 액세스 한 다음 두 단백질의 아미노산 서열을 넣습니다. 각 서열은 단백질 이름이 있는 텍스트 줄에 의해 제대로 식별되어야 합니다.아래로 스크롤하여 제출을 클릭합니다. 다운로드 정렬 파일 탭을 클릭하여 정렬 파일을 검색하고 저장합니다. 이 파일은 모든 텍스트 편집 프로그램에서 열 수 있습니다.정렬 파일을 참고로 사용하여, 그들의 DNA 서열에서 기증자 단백질의 해당 구조 영역에 인가한다. 수용체 단백질의 부가 된 DNA 서열의 사본을 만들고 기메라 단백질로 이름을 바꿉니다. APE에서 이름이 변경된 DNA 서열을 엽니다.기증자 단백질에서 교환되는 영역을 선택한 다음 이름이 변경된 수용체 단백질에서 해당 영역을 선택합니다. 기증자 단백질 DNA 서열을 붙여 넣은 다음 변화를 저장합니다. APE와 같은 DNA 편집기를 사용하여 터미널 프라이머를 설계합니다.새 DNA 파일을 만들고, 리더 시퀀스를 사용하여 최종 단말 프라이머를 시작합니다. 벡터 MCS 및 관심 유전자의 초기 18 에서 27 염기 쌍에서 선택적 스페이서에서 선택된 첫 번째 제한 부위가 뒤따릅니다. 새로운 DNA 파일에서, C 단말 프라이머 서열을 설계하여 관심 유전자의 최종 18~27기 쌍으로 시작하여 선택적 스페이서, 선택된 제2 제한 부위 및 지도자 서열이 뒤따릅니다.전체 시퀀스를 강조 표시하고 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 역방향 칭찬을 선택하여 역프라이머를 가져옵니다. 이제 키메라 구문에서 각 테두리 영역에 대한 프라이머를 디자인합니다. 키모라의 DNA 서열에서, 원래 및 삽입된 서열이 접촉되는 영역에서 30개의 염기 쌍 영역을 강조한다.이는 각 시퀀스에서 15개의 베이스 쌍으로 구성됩니다. 영역을 복사하여 새 DNA 파일에 붙여 넣습니다. 이 시퀀스는 앞으로 프라이머가 됩니다.이전 단계에서 생성된 포워드 프라이머의 복사본을 만들고 역계 프라이머로 이름을 바꿉니다. 프라이머 시퀀스를 강조 표시하고 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 역방향 칭찬을 선택하여 역프라이머 시퀀스를 생성합니다. 기황 DNA 서열의 각 접촉 영역에 대해 이러한 단계를 반복한다.일반적으로 N 단말 또는 C 단말 영역에서 교체가 발생하지 않는 한 두 세트의 전방 역 프라이머가 하나의 키메라를 생성해야 한다. 기메라 단백질을 구성하는 각 단편에 대해 개별 PCR 반응 혼합물을 준비한다. 먼저 얼음에 1점 5 밀리터 마이크로퓨즈 튜브를 설정하고 텍스트 프로토콜에 나열된 순서로 PCR 혼합물의 상이한 시약을 피펫한다.각 PCR 반응에 대해 올바른 프라이머와 템플릿이 사용되도록 합니다. 각 반응에 대해 두 개의 얇은 벽제로 0점 2개의 밀리리터 PCR 튜브를 라벨로 지정하고 각 튜브에 해당 PCR 혼합물의 20 마이크로리터를 이송한다. PCR 튜브를 PCR 열순환기로 전송하고 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 프로토콜을 시작합니다.PCR 반응이 완료된 후 각 튜브에 6x DNA 로딩 버퍼의 4개의 마이크로리터를 추가합니다. 1% 아가로스 젤을 전기전도 장치에 삽입하고 TAE 버퍼로 덮습니다. 조심스럽게 분자량 후자와 함께 젤에 샘플을로드합니다.겔을 80~ 120볼트에서 20~45분 동안 실행한 후, 전기전도 장치를 끄고 아고로스 젤을 제거한다. 자외선 아래에서 증폭된 DNA 밴드를 시각화합니다. 면도날을 사용하여 젤에서 개별 DNA 조각을 잘라 내어 두 개의 밀리터 리터 마이크로 퓨즈 튜브에 라벨을 부착합니다.PCR 정리 키트를 사용하여 DNA 단편을 정화한 후 분광계에서 260나노미터 및 340 나노미터에서 샘플의 흡광도를 측정하여 회수된 DNA의 양을 정량화합니다. 지금, 키메라 DNA 서열을 생성하기 위해 PCR 증폭을 수행한다. 먼저, 이전과 같이 키미라의 분리성분을 융합하기 위해 PCR 반응의 50마이크로리터를 설정한다.증폭된 각 DNA 단편의 10나노그램과 함께 N 단자 및 C 단말 프라이머를 채용한다. 핵 자유 물의 30 마이크로 리터에서, 이전과 같이 정제 된 DNA 조각을 복구하고 정량화. 이 단편은 단말 프라이머에 포함된 제한 부위에 의해 측면에 있는 기홍 DNA 서열을 포함한다.기메라 단백질의 생성은 인터 루크와 여섯 sytokine 가족의 두 구성원으로 예시된다. 백혈병 억제 인자에서 Oncostaten M. OSM 리프트 키모라는 OSM의 BC 루프 영역을 해당 리프트 시퀀스와 교환한 결과입니다.첫 번째 PCR 증폭 단계는 세 개의 별도 반응으로 구성되었습니다. N 단자 OSM 앞으로 및 BC 시작 역 프라이머가 필요 N 단말 OSM 조각은 템플릿으로 OSM을 사용했다. LIF BC 루프는 BC 시작을 통해 얻어졌고, BC N은 LIF를 템플릿으로 사용하여 프라이머를 역전시켰다.C-터미널 OSM 조각은 BC 엔드 포워드와 C 단말 OSM 역 프라이머뿐만 아니라 OSM을 템플릿으로 사용했습니다. 이러한 정제된 단편은 해당 OSM LIF BC 루프 유전자 서열을 증폭시키기 위해 N단 OSM 포워드 및 C 단말 OSM 역프라이머와 함께 제2 PCR 반응에서 템플릿으로 사용하였다. e-coli로 정화 및 변환에 따라, 개별 플라스미드는 DNA 단편의 적절한 삽입을 위한 제한 효소 소화에 의해 격리되고 검열되었다.겔 전기 전도는 다음 시퀀스 검증을 위해 전송 된 긍정적 인 안타를 공개했다. 키메라 단백질은 생성되어야 하며 완벽한 파벌 시스템에서 측정된 활성이 있어야 합니다. 특정 진영에 대해 대체 된 영역의 중요성을 결정하기 위해.이 기술은 주요 기능 도메인 및 수용체 인식 사이트를 식별하기 위해 신호 수용체를 방해하는 매우 유용하고 자주 적용되었습니다. DNA 전기 전광에 사용하는 숫자는 일회용 장갑, 실험실 코트 및 보호 안경을 사용하여 처리해야합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

연구

생화학

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated 세포 관통 펩 티 드 세포내 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

전사에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 생체층 간섭측정기(BLI) 적용

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...