Name: identification of functional protein regions through chimeric protein construction
Uploaded: 2019-01-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Max Planck samfunnet og Schüchtermann-klinikken (Bad Rothenfelde, Tyskland). En del av denne forskningen ble opprinnelig publisert i Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, s., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. AB loop og D-helix i binding området III av menneskelig Oncostatin M (OSM) kreves for OSM reseptor aktivisering. J. Biol. kjemiske 2018; 18:7017-7029. © forfatterne.

1. chimeric Protein Design
<ol><li>Velg en passende protein (giveren) å utveksle regioner med protein av interesse (mottaker) donor protein bør være samme, ideelt tilhører samme protein familien, men mangler den biologiske aktiviteten som avlesning. Hvis ingen strukturelt relaterte proteiner er kjent, kan potensielle kandidater identifiseres ved hjelp av en automatisert verktøyet som vektor justering Søk verktøyet (store)14,15<ol>
<li>Tilgang til Protein...

<ol>
	<li>Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+evolution+of+class-I+helical+cytokines.">Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines.</a> The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).</li><li>Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+and+functions+of+the+human+interleukin+(IL)+gene+family.">Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family.</a> Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).</li><li>Bravo, J., Heath, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+recognition+by+gp130+cytokines.">Receptor recognition by gp130 cytokines.</a> The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).</li><li>Schneider, G., Fechner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-based+de+novo.+design+of+drug-like+molecules.">Computer-based de novo. design of drug-like molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).</li><li>Heydenreich, F. M., Milju&#353;, T., Jaussi, R., Benoit, R., Mili&#263;, D., Veprintsev, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mutagenesis+using+a+two-fragment+PCR+approach.">High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).</li><li>Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., L&#246;rchner, H., Braun, T., P&#246;ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AB+loop+and+D-helix+in+binding+site+III+of+human+Oncostatin+M+(OSM)+are+required+for+OSM+receptor+activation.">The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).</li><li>Wang, Y., Pallen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+characterization+of+wild+type,+truncated,+and+mutant+forms+of+the+intracellular+region+of+the+receptor-like+protein+tyrosine+phosphatase+HPTP+beta.">Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).</li><li>Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+full-length+midkine+reveals+novel+residues+important+for+heparin+binding+and+zebrafish+embryogenesis.">Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis.</a> The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).</li><li>Kim, K. -. W., Vallon-Eberhard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+structure/function+and+expression+analysis+of+the+CX3C+chemokine+fractalkine.">In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine.</a> Blood. 118 (22), 156-167 (2011).</li><li>Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+loop+structure+in+oncostatin+M+determines+binding+affinity+toward+oncostatin+M+receptor+and+leukemia+inhibitory+factor+receptor.">A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).</li><li>Aasland, D., Schuster, B., Gr&#246;tzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+leukemia+inhibitory+factor+receptor+functional+domains+by+chimeric+receptors+and+cytokines.">Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines.</a> Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).</li><li>Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+leukemia+inhibitory+factor+receptor+and+oncostatin+M+receptor+to+signal+transduction+in+heterodimeric+complexes+with+glycoprotein+130.">Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130.</a> Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).</li><li>Kallen, K. J., Gr&#246;tzinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+recognition+sites+of+cytokines+are+organized+as+exchangeable+modules.+Transfer+of+the+leukemia+inhibitory+factor+receptor-binding+site+from+ciliary+neurotrophic+factor+to+interleukin-6.">Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).</li><li>Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+similarities+in+structure+comparison.">Surprising similarities in structure comparison.</a> Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).</li><li>Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMDB+and+VAST+:+tracking+structural+similarities+between+macromolecular+complexes.">MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes.</a> Nucleic Acids Research. 42, 297-303 (2014).</li><li>Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Announcing+the+worldwide+Protein+Data+Bank.">Announcing the worldwide Protein Data Bank.</a> Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).</li><li>Biasini, M., Bienert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWISS-MODEL:+modelling+protein+tertiary+and+quaternary+structure+using+evolutionary+information.">SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information.</a> Nucleic Acids Research. 42, 252-258 (2014).</li><li>Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+structure+homology+modeling+using+SWISS-MODEL+workspace.">Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace.</a> Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).</li><li>Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NCBI's+LocusLink+and+RefSeq.">NCBI's LocusLink and RefSeq.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).</li><li>Sievers, F., Wilm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+scalable+generation+of+high-quality+protein+multiple+sequence+alignments+using+Clustal+Omega.">Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.</a> Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+and+RNA.">Quantitation of DNA and RNA.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Transformation+of+Competent+E.+coli+Using+Calcium+Chloride.">Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+SDS:+Minipreparation.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Plasmid+DNA+by+Alkaline+Lysis+with+Sodium+Dodecyl+Sulfate:+Maxipreps.">Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).</li><li>Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+transient+recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells.">Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).</li><li>Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+shared+cytokine+receptors.">Structural biology of shared cytokine receptors.</a> Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).</li><li>Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+and+functional+dissection+of+the+cytostatic+cytokine+oncostatin.">Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin.</a> Structure. 8, 863-874 (2000).</li><li>Huyton, T., Zhang, J. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+cytokine:Ig-domain+interaction+revealed+in+the+crystal+structure+of+leukemia+inhibitory+factor+(LIF)+in+complex+with+the+LIF+receptor.">An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).</li><li>Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+conserved+sequence+motifs+in+cytochrome+P450+family+2.+Functional+and+structural+role+of+a+motif+187RFDYKD192+in+CYP2B+enzymes.">Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).</li><li>Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Functional+Motifs+and+Homology+Modeling+to+Predict+Hidden+Moonlighting+Functional+Sites.">Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).</li><li>McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localised+sequence+regions+possessing+high+melting+temperatures+prevent+the+amplification+of+a+DNA+mimic+in+competitive+PCR.">Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR.</a> Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).</li><li>Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fundamental+study+of+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+templates.">A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates.</a> Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).</li><li>Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+recombinational+cloning+using+gateway+and+in-fusion+cloning+schemes.">Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).</li><li>Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USER+friendly+DNA+engineering+and+cloning+method+by+uracil+excision.">USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision.</a> Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro.+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-fusion+assembly:+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li></ol>

Generering av chimeric proteiner utgjør en allsidig teknikk, hvilke er kjøpedyktig gå utover grensene for avkortet proteiner til adressen spørsmål som modularitet cytokin-reseptor bindende domener13. Utformingen av chimeras er et viktig skritt i denne typen studier, og krever nøye overveielse. Forstudier å etablere funksjonelle domener krever generelt substitusjon av brede områder i en første fase, mens mindre erstatninger med variabel lengde er mer egnet til detaljerte studier av ett. Sp...

Flere typer proteiner, inkludert cytokiner og vekstfaktorer, er gruppert i familier hvis medlemmer dele lignende tredimensjonale strukturer, men ofte utøve forskjellige biologiske funksjoner1,2. Dette funksjonelle mangfoldet er vanligvis konsekvensen av små forskjeller i aminosyre komposisjon i molekylets aktive nettsteder3. Identifikasjon av slike nettsteder og funksjonelle determinanter ikke bare tilbyr verdifull evolusjonære innsikt men også utforme mer spesifikke agonister og hemmere4. Men kompliserer mange forskjeller i rester komposisjon ofte funnet mellom strukturelt relaterte proteiner denne oppgaven. Selv om bygge store biblioteker som inneholder hundrevis av mutanter er i dag mulig, vurdere hver enkelt rester Variant kombinasjoner av dem fortsatt en tidkrevende og utfordrende innsats5.
Teknikker vurdere funksjonelle betydningen av store protein regioner er dermed å redusere antall mulig rester til et håndterlig antall6. Avkortet proteiner er den mest brukte måten å håndtere dette problemet. Følgelig regnes områder være funksjonelt relevant hvis funksjonen protein under studien påvirkes av slettingen av en bestemt region7,8,9. En stor begrensning av denne metoden er imidlertid at slettinger kan påvirke protein's sekundære struktur, fører til misfolding, aggregering og manglende evne til å studere den tiltenkte regionen. Et godt eksempel er en avkortet versjon av cytokin oncostatin M (OSM), som studerte en intern sletting større enn 7 rester resulterte i en misfolded mutant som ikke kunne ytterligere10.
Generering av chimeric proteiner utgjør en alternativ og nyskapende tilnærming som tillater analyse av større protein regioner. Målet med denne metoden er å utveksle områder av interesse i et protein av strukturelt relaterte sekvenser i en annen protein, for å vurdere bidrag erstattet delene til bestemte biologiske funksjoner. Mye brukt i feltet signalnettverk reseptorer å identifisere funksjonelle domener11,12, er chimeric proteiner spesielt nyttig å studere protein familier med liten aminosyre identitet men bevarte sekundære struktur. Aktuelle eksempler kan bli funnet i klassen av interleukin-6 (IL-6) type cytokiner, slik som interleukin-6 og ciliary nevrotropisk faktor (6% sekvens identitet)13 eller leukemi hemmende faktor (LIF) og OSM (20% identitet)6, som den etter protokoll basert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:599px;" width="599">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Labcycler thermocycler</td>
			<td style="width:97px;">Sensoquest</td>
			<td style="width:119px;">011-103</td>
			<td style="width:167px;">Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000C&#160;</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler 100 bp DNA ladder</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AscI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PacI restriction enzyme</td>
			<td style="width:97px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Hot Start II DNA Polymerase</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP set (100 mM)</td>
			<td style="width:97px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:97px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:97px;">Macherey-Nagel</td>
			<td align="right" style="width:119px;">740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock</td>
			<td style="width:97px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MHS6278-202857165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LE agarose</td>
			<td style="width:97px;">Biozym</td>
			<td align="right" style="width:119px;">840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:97px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Human Oncostatin M cDNA</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital W&#252;rzburg, Germany)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gift of Dr. Andr&#233; Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of functional protein regions through chimeric protein construction

Målet med denne protokollen omfatter utformingen av chimeric proteiner som atskilte områder av et protein er erstattet med de tilsvarende sekvensene i en samme protein, for å fastslå funksjonelle betydningen av disse regionene. Slike chimeras genereres ved hjelp av en nestede PCR-protokoll overlappende DNA fragmenter og tilstrekkelig utviklet primere, etterfulgt av deres uttrykk innenfor et pattedyr system å sikre opprinnelige sekundære struktur og post-translasjonell modifikasjoner.
Funksjonell rolle en distinkt region angis deretter med tap av aktivitet chimera i riktig avlesning analysen. I følge identifiseres regioner huse en rekke kritiske aminosyrer, som kan bli ytterligere vist av komplementære teknikker (f.eks området-rettet mutagenese) for å øke molekylær oppløsning. Begrenset til saker som et strukturelt relaterte protein med ulike funksjoner kan bli funnet, har chimeric proteiner vært vellykket ansatt å identifisere kritiske bindende områder i proteiner som cytokiner og cytokin reseptorer. Denne metoden er spesielt godt egnet i tilfeller der den protein funksjonelle områder ikke er godt definert, og utgjør en verdifull første skritt i regissert utvikling tilnærminger til å begrense områdene rundt og redusere screening krefter involvert.

Konstruksjon og generering av et chimeric protein (figur 1) vil være eksemplifisert med to medlemmer av interleukin-6 cytokin familien, OSM og LIF, som var gjenstand for en nylig publisert studie6. Figur 2 viser tredimensjonale strukturen av disse proteinene. Begge molekyler vedta karakteristiske sekundære strukturen i klassen jeg cytokiner, med fire helikser (kalt A til D) pakket i en pakke, og sammen m...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction at JoVE.com

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Strukturelt relaterte proteiner utøve ofte forskjellige biologiske funksjoner. Utveksling av tilsvarende områder av disse proteinene vil opprette chimeric proteiner utgjør en innovativ tilnærming for å identifisere kritiske protein områder som er ansvarlig for deres funksjonelle divergens.

Identifikasjon av funksjonelle Protein områder gjennom Chimeric Protein konstruksjon

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Utveksling av regioner med strukturelt lignende proteiner for å skape kimeras gjør det mulig for oss å undersøke viktigheten av regioner som er ansvarlige for molekylets biologiske funksjoner som skal studeres. Regionutvekslinger predoff den generelle sekundære strukturen av proteinet slik at regionens viktig for sin generelle struktur kan skilles fra de direkte mediere biologiske funksjoner. Det kan være å velge hvilke nøyaktige regioner som skal erstattes.Starter med større utveksling er vanligvis nyttig for å identifisere proteinets nøkkelfunksjonalitet. For å starte prosedyren, velg et passende protein som donor for å utveksle regioner med protein av interesse som beskrevet i tekstprotokollen. Deretter får du proteinaminosyresekvensene til mottakeren og donorproteinene fra referansesekvensdatabasen ved først å få tilgang til gendelen på ref seq-nettsiden.Skriv inn navnet på proteinet av interesse i søkeboksen, og klikk søk. Klikk på gennavnet for de ønskede artene i den resulterende listen. Rull ned til ref seq-delen for å se alle de dokumenterte isoformene.Klikk på sekvens-IDen for isoformen av interesse. Rull ned og klikk på cds for å markere proteinkodingsområdet til genet. Nederst til høyre på skjermen klikker du på FAFSDA og kopierer gensekvensen.Lagre DNA-sekvensen ved hjelp av en passende DNA-redigeringsprogramvare. Når du bruker den fritt tilgjengelige AP-en, åpner du programmet, limer inn den kopierte sekvensen i den tomme boksen, velger sekvensnavnet og klikker lagre. Nå velger du proteinområdene som skal erstattes i de forskjellige kimeriske konstruksjonene ved først å dele proteinsekvensen av interesse i forskjellige strukturelle regioner.For å gjøre dette, last ned de strukturelle dataene til proteinet av interesse fra PDBe-nettstedet. Åpne PDBe-siden for proteinet og last ned PDBe-filen ved å klikke last ned til høyre på skjermen. Åpne PDBe-filen i et molekylært visualiseringssystem, som Pymol.I Pymol viser du nukleotidsekvensen, skjuler standard strukturelle data og velger tegneserievisningen for å tydelig visualisere proteinets strukturelle egenskaper. Klikk på nukleotidsekvensen øverst på skjermen for å markere ulike deler av molekylet, og legg merke til aminosyrene som svarer til hver karakteristiske strukturelle funksjon. Nå, kommentere de distinkte strukturelle områdene på DNA-sekvensen i APE ved å åpne DNA-sekvensen, velge den, og klikke ORFs oversette, klikk deretter på den siste aminosyren i den første regionen for å markere sin posisjon i DNA-sekvensen og velge nukleotid koding for den regionen.Høyreklikk på utvalget og velg ny funksjon for å gi den et navn og en farge. Gjenta prosessen for hvert strukturelle område som er identifisert i forrige trinn. For å justere restsekvensene av de to proteinene, først, få full aminosyre sekvenser av donor og reseptor proteiner i APE.Som før åpner du DONOR-DNA-sekvensen, velger den og klikker på ORFer oversettes. Deretter, få tilgang til Clustal Omega nettsiden og deretter sette aminosyre sekvenser av de to proteinene. Hver sekvens bør fortsettes med en tekstlinje med proteinnavn som skal identifiseres riktig.Bla nedover, og klikk på Send inn. Hent justeringsfilen ved å klikke kategorien nedlastingsjusteringsfil og lagre den. Denne filen kan åpnes av et hvilket som helst tekstredigeringsprogram.Ved hjelp av justeringsfilen som referanse, kommenter de tilsvarende strukturelle områdene av donorproteinet i DNA-sekvensen. Lag en kopi av den kommenterte DNA-sekvensen av reseptorproteinet og gi det nytt navn som et kimerisk protein. Åpne DEN omdøpte DNA-sekvensen i APE.Velg regionen som skal byttes i donorproteinet, og velg deretter det tilsvarende området i det omdøpte reseptorproteinet. Lim inn donorprotein-DNA-sekvensen, og lagre deretter endringene. Design terminal primere ved hjelp av en DNA editor som APE.Opprett en ny DNA-fil, initier endeterminalen primer med en ledersekvens. Etterfulgt av det første restriksjonsstedet som er valgt i vektorene MCS og den valgfrie avstandss avstandssyren i de første 18 til 27 basisparene av interessegenet. I den nye DNA-filen, design C terminal primer sekvens for å starte med de siste 18 til 27 base par av genet av interesse etterfulgt av en valgfri avstandsmann, den andre restriksjonen området valgt, og ledersekvensen.Merk hele sekvensen, høyreklikk, og velg omvendt kompliment for å få omvendt primer. Nå, design primere for hver av grenseområdene i kimeriske konstruksjoner. I KIMERA-sekvensen markerer du et 30 basisparområde i sonen der de opprinnelige og innsatte sekvensene er i kontakt.Dette består av 15 basispar i hver sekvens. Kopier området, og lim det inn i en ny DNA-fil. Denne sekvensen vil være den fremre primeren.Lag en kopi av primeren som genereres fremover i forrige trinn, og gi den nytt navn som omvendt primer. Merk primersekvensen, høyreklikk, og velg omvendt kompliment for å generere omvendt primer sekvens. Gjenta disse trinnene for hver kontaktsone i den kimeriske DNA-sekvensen.Vanligvis er to sett med fremover revers primere nødvendig for å generere en kimera, med mindre erstatning skjer på N terminal eller C terminal regioner. Forbered en individuell PCR-reaksjonsblanding for hvert av fragmentene som komponerer kimerisk protein. Sett først et ett punkt fem mililiter mikrofuse rør på is og pipet de forskjellige reagenser av PCR-blandingene i rekkefølgen som er oppført i tekstprotokollen.Kontroller at korrekte primere og maler brukes for hver PCR-reaksjon. Merk to tynne inngjerdede nullpunkt to mililiter PCR-rør for hver reaksjon og overfør 20 mikroliter av den tilsvarende PCR-blandingen i hvert rør. Overfør PCR-rørene til en PCR-termocycler og start protokollen som beskrevet i tekstprotokollen.Etter at PCR-reaksjonen er fullført, legg til fire mikroliter med seks x DNA-lastbuffer i hvert rør. Sett inn en prosent agaross gel i en elektroforese enhet og dekk med TAE buffer. Last forsiktig prøvene inn i gelen sammen med en molekylær vekt sistnevnte.Etter å ha kjørt gelen på 80 til 120 volt i 20 til 45 minutter, slå av elektroforeseenheten og fjern agorossgelen. Visualiser de forsterkede DNA-båndene under UV-lys. Bruk et barberblad, kutt ut de enkelte DNA-fragmentene fra gelen og overfør dem til merkede to mililitermikrofuserør.Etter å ha brukt et PCR-oppryddingssett for å rense DNA-fragmentene, kvantifisere mengden DNA som gjenvinnes ved å måle absorbansen til prøvene ved 260 nanometer og 340 nanometer i et spektrofetometer. Utfør PCR-forsterkning for å generere den kimeriske DNA-sekvensen. Først setter du opp 50 mikroliter av en PCR-reaksjon for å smelte sammen de separate bestanddelene av kimeraen som før.Bruk N-terminalen og C-terminal primere sammen med 10 nanograms av hver av de forsterkede DNA-fragmentene. Gjenopprett og kvantifisere det rensede DNA-fragmentet som før, i 30 mikroliter kjernefritt vann. Dette fragmentet inneholder den kimeriske DNA-sekvensen flankert av restriksjonsstedene som er inkludert i terminal primere.Generering av kimerisk protein er eksemplifisert med to medlemmer av inter luke og seks sytokine familie. Oncostaten M i leukemi hemmende faktor. OSM-heisen kimera skyldes å bytte BC-sløyfeområdet til OSM med en tilsvarende løftesekvens.Det første PCR-forsterkningstrinnet besto av tre separate reaksjoner. N-terminal OSM fragment, som krevde N-terminal OSM fremover og BC starte omvendt primere brukt OSM som mal. LIF BC-sløyfen ble oppnådd gjennom BC start fremover og BC N omvendt primere ved hjelp av LIF som mal.C-terminal OSM fragmentet brukt BC ende fremover og C terminal OSM omvendt primere samt OSM som mal. Disse rensede fragmentene ble deretter brukt som mal i den andre PCR-reaksjonen sammen med N-terminal OSM fremover og C-terminal OSM omvendt primere for å forsterke den tilsvarende OSM LIF BC loop gensekvensen. Etter rensing og transformasjon til e-coli ble individuelle plasmider isolert og screenet ved begrensning av enzymfordøyelsen for riktig innsetting av DNA-fragmentet.Gel elektroforese avslørte positive treff som deretter ble sendt for sekvens verifisering. Kimeriske proteiner må produseres og aktiviteten måles i et perfekt factionality-systemer. For å fastslå betydningen av de erstattede regionene for den aktuelle fraksjonen.Denne teknikken har vært svært nyttig og ofte brukt, forstyrret av signalreseptorer for å identifisere nøkkelfunksjondomener og reseptorgjenkjenningssteder. Nummeret jeg bruker til DNA-elektroforese bør håndteres ved hjelp av engangshansker, laboratoriefrakk og vernebriller.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated celle-gjennomtrengende peptider å studere intracellulær Protein-protein interaksjoner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: trinns affinitet rensing for parallell analyse av Protein-Protein og Protein-metabolitten komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering av proteiner for ett molekyl Force spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anvendelse av Biolayer laboratoriefasiliteter (BLI) for å studere protein-protein interaksjoner i transkripsjon

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluering av protein-protein interaksjoner ved hjelp av en on-membran fordøyelsen Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...